中國藥典 2015版 微生物新增指導(dǎo)原則 主要內(nèi)容 一、概述 二、微生物新增三個(gè)指導(dǎo)原則 三、小結(jié) 一、概述 樣品 檢驗(yàn) 結(jié)果判斷 一、概述 檢查 標(biāo)準(zhǔn) 檢測(cè) 方法 結(jié)果 判斷 1、新版變化 2、標(biāo)準(zhǔn)比較 1、方法變化 2、方法驗(yàn)證 1、計(jì)數(shù)結(jié)果 2、控制菌檢 查結(jié)果 相互關(guān)聯(lián)，相互影響，不可分割 一、概述 1000以下 藥典各論中各種檢查法的說明 -制劑通則、鑒別試驗(yàn)、色譜光譜法 10 xx -1101 無菌檢查法（二部 H ） -1105/6/7 計(jì)數(shù)法 /控制菌 /限度標(biāo)準(zhǔn)（二部 J ） -1121抑菌效力檢查法（二部 N） -其它：異常毒性、熱原、抗生素效價(jià)測(cè)定 20 xx 中藥 30 xx 生物制品相關(guān)測(cè)定 /實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 一、概述 80 xx 試劑和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) 90 xx 指導(dǎo)原則（二部附錄 ） -9201 藥品微生物檢驗(yàn)替代方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則 -9202 非無菌藥品微生物限度檢查法指導(dǎo)原則 -9203 藥品微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則 -9204 微生物鑒定指導(dǎo)原則（ new） -9205 藥品潔凈實(shí)驗(yàn)室微生物監(jiān)測(cè)和控制指導(dǎo)原則（ new） -9206 無菌檢查用隔離系統(tǒng)驗(yàn)證指導(dǎo)原則（ new） 二、 9204微生物鑒定指導(dǎo)原則 本指導(dǎo)原則為非無菌產(chǎn)品微生物限度控制菌檢查中 疑似菌的鑒定， 以及藥物原料、輔料、制藥用水、 中間體、終產(chǎn)品和環(huán)境中檢出微生物的鑒定提供指 導(dǎo)。當(dāng)微生物的鑒定結(jié)果有爭(zhēng)議時(shí)， 以 伯杰氏 系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè) ( Bergey s Manual of Systematic Bacteriology )現(xiàn)行版的鑒定結(jié)果為 準(zhǔn)。 微生物的鑒定程序 微生物鑒定的基本程序包括分離純化和鑒定，鑒定 時(shí)，一般先將待檢菌進(jìn)行初步的分類。 1、待檢菌的分離純化 微生物鑒定的第一步是待檢培養(yǎng)物的分離純化。 2、初篩試驗(yàn) 3、表型微生物鑒定 4、基因型微生物鑒定 微生物鑒定方法的確認(rèn) 系統(tǒng)發(fā)育的相關(guān)內(nèi)容 溯源分析 三、 9205 藥品潔凈實(shí)驗(yàn)室微生物監(jiān)測(cè)和控 制指導(dǎo)原則 本指導(dǎo)原則是用于指導(dǎo)藥品微生物檢驗(yàn)用的潔凈室 等受控環(huán)境微生物污染情況的監(jiān)測(cè)和控制。 藥品潔凈實(shí)驗(yàn)室的潔凈級(jí)別按空氣懸浮粒子大小和 數(shù)量的不同參考現(xiàn)行 “藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范”分 為 A、 B、 C、 D 4 個(gè)級(jí)別。 人員要求、 初次使用的潔凈實(shí)驗(yàn)室參數(shù)確認(rèn)、 微生物監(jiān)測(cè)方法、 監(jiān)測(cè)頻次及監(jiān)測(cè)項(xiàng)目、 監(jiān)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)、 警戒限和糾偏限、 數(shù)據(jù)分析及偏差處理、 微生物鑒定和微生物控制。 人員 從事藥品潔凈實(shí)驗(yàn)室微生物監(jiān)測(cè)和控制的人員應(yīng)符 合現(xiàn)行 中國藥典 通則中“藥品微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì) 量管理指導(dǎo)原則（通則 9203）”的相關(guān)要求。 (9203)藥品微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則 （ 1）人員專業(yè)背景 應(yīng)具備微生物學(xué)或相近專業(yè)知識(shí)的教育背景。 （ 2）人員培訓(xùn) -崗位和職責(zé)培訓(xùn) -設(shè)備操作培訓(xùn) -檢驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)（無菌操作、培養(yǎng)基制備、消毒、滅菌、 注平板、菌落計(jì)數(shù)、菌種的轉(zhuǎn)種、傳代和保藏、微 生物檢查方法和鑒定基本技術(shù)等） -生物安全培訓(xùn) -繼續(xù)教育培訓(xùn) （ 3）人員技能 檢驗(yàn)人員 ：必須熟悉相關(guān)檢測(cè)方法、程序、檢測(cè)目的 和結(jié)果評(píng)價(jià)。 管理者 ：專業(yè)技能和經(jīng)驗(yàn)水平應(yīng)與他們的職責(zé)范圍相 符，如：管理技能、實(shí)驗(yàn)室安全、試驗(yàn)安排、預(yù)算、 實(shí)驗(yàn)研究、實(shí)驗(yàn)結(jié)果的評(píng)估和數(shù)據(jù)偏差的調(diào)查、技 術(shù)報(bào)告書寫等。 實(shí)驗(yàn)室 ：應(yīng)通過參加內(nèi)部質(zhì)量控制、 能力驗(yàn)證或使用 標(biāo)準(zhǔn)菌株等方法客觀評(píng)估檢驗(yàn)人員的能力，必要時(shí) 對(duì)其進(jìn)行再培訓(xùn)并重新評(píng)估。當(dāng)使用一種非經(jīng)常使 用的方法或技術(shù)時(shí)，有必要在檢測(cè)前確認(rèn)微生物檢 測(cè)人員的 操作技能 。 （ 4）人員檔案 所有人員的培訓(xùn)、考核內(nèi)容和結(jié)果均應(yīng)記錄歸檔 。 確認(rèn) 確認(rèn)目的：確保操作順暢，保證設(shè)備系統(tǒng)的運(yùn)行能 力和可靠性。 確認(rèn)時(shí)間：初次使用的潔凈實(shí)驗(yàn)室應(yīng)進(jìn)行參數(shù)確認(rèn)， 物理參數(shù)的測(cè)試應(yīng)當(dāng)在微生物監(jiān)測(cè)方案實(shí)施之前。 確認(rèn)參數(shù)：物理參數(shù)、空氣懸浮粒子和微生物 -物理參數(shù)：高效空氣過濾器完整性，氣流組織、空 氣流速（平均風(fēng)速） ，換氣次數(shù)、壓差、溫度和相 對(duì)濕度等。 -微生物：浮游菌、沉降菌、表面微生物 測(cè)試條件：模擬正常檢測(cè)條件 物理參數(shù)測(cè)試方法參照 潔凈室施工及驗(yàn)收規(guī)范 的現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)（ GB50591-2010）中附錄方法 -高效空氣過濾器完整性： 附錄 D3 高效空氣過濾器現(xiàn)場(chǎng)掃描檢漏方法 -氣流組織：附錄 E12 氣流的檢測(cè) -平均風(fēng)速：附錄 E1 風(fēng)量和風(fēng)速的檢測(cè) -壓差：附錄 E2 靜壓差的檢測(cè) -溫度、相對(duì)濕度：附錄 E5 溫濕度的檢測(cè) 空氣懸浮粒子和微生物的確認(rèn)： 見“監(jiān)測(cè)”項(xiàng)下。 物理參數(shù)建議標(biāo)準(zhǔn)： 參照 GMP(2010)、 FDA(ISPE，換氣次數(shù) ) 最長監(jiān)測(cè)周期： 參照 GB,詳見表 1 監(jiān)測(cè) 1、監(jiān)測(cè)內(nèi)容 空氣懸浮粒子數(shù)（非生物活性） 微生物（有生物活性） -環(huán)境浮游菌 -環(huán)境沉降菌 -表面微生物（關(guān)鍵檢測(cè)臺(tái)面、人員操 作服及 5指手套等） 2、監(jiān)測(cè)方法： 懸浮粒子： 醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子的 測(cè)試方法 （ GB/T16292-2010） 浮游菌： 醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）浮游菌的測(cè)試 方法 (GB/T16293-2010) 沉降菌： 醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）沉降菌的測(cè)試 方法 (GB/T16294-2010) 2.監(jiān)測(cè)方法 表面微生物（環(huán)境、設(shè)備和人員） 接觸碟法： 將充滿規(guī)定的瓊脂培養(yǎng)基的接觸碟對(duì)規(guī)則表面或平面 進(jìn)行取樣， 然后置合適的溫度下培養(yǎng)一定時(shí)間并計(jì)數(shù)，每碟取 樣面積約為 25 cm2 ，微生物計(jì)數(shù)結(jié)果以 cfu/碟報(bào)告； 擦拭法： 用于不規(guī)則表面的微生物監(jiān)測(cè)，特別是設(shè)備的不規(guī)則表 面。擦拭法是采用合適尺寸的無菌模板或標(biāo)尺確定擦拭的面積， 取樣后，將拭子置合適的緩沖液或培養(yǎng)基中，充分振蕩，然后 采用適宜的方法計(jì)數(shù)，每個(gè)拭子取樣面積為約 25 cm2 ，微生 物計(jì)數(shù)結(jié)果以 cfu/拭子報(bào)告。 表面微生物測(cè)定應(yīng)在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后進(jìn)行。 培養(yǎng)基：一般采用胰酪大豆胨瓊脂 培養(yǎng)基（ TSA） ， 必要時(shí)可加入適宜的中和劑 ， 當(dāng)監(jiān)測(cè)結(jié)果有疑似真菌或考慮季節(jié)因素影響時(shí)， 可 增加沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 (SDA)。 培養(yǎng)時(shí)間： ChP(2015) GB/T16293-2010 TSA: 3-5天 不少于 2天 SDA： 5-7天 不少于 5天 3.監(jiān)測(cè)頻次及監(jiān)測(cè)項(xiàng)目 參考 GMP（ 2010）及 GB50073-2013，見表 2 檢測(cè)頻次的調(diào)整 如果如果出現(xiàn)連續(xù)超過糾偏限和警戒限、 關(guān)鍵區(qū)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)有污染微生物存在、 空氣凈化系統(tǒng) 進(jìn)行任何重大的維修、 消毒規(guī)程改變、設(shè)備有重大 維修或增加、潔凈室（區(qū)）結(jié)構(gòu)或區(qū)域分布有重大 變動(dòng)、引起微生物污染的事故、日常操作記錄反映 出傾向性的數(shù)據(jù)時(shí)應(yīng)考慮修改監(jiān)測(cè)頻次。 4.監(jiān)測(cè)標(biāo)準(zhǔn) 參考 GMP（ 2010），見表 3、 4 5.警戒限和糾偏限（參考 FDA ，見表 5） 藥品潔凈實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)歷史數(shù)據(jù)，結(jié)合不 同潔凈區(qū)域的標(biāo)準(zhǔn)，采用適宜的方法，制定適當(dāng)?shù)?微生物監(jiān)測(cè)警戒限和糾偏限。限度確定后，應(yīng)定期 回顧評(píng)價(jià)，如歷史數(shù)據(jù)表明環(huán)境有所改善，限度應(yīng) 作出相應(yīng)調(diào)整以反映環(huán)境實(shí)際質(zhì)量狀況。 表 5 列出了各級(jí)別潔凈環(huán)境微生物糾偏限參考值。 6.數(shù)據(jù)分析及偏差處理 參考 USP(35) (1)數(shù)據(jù)分析 應(yīng)當(dāng)對(duì)日常環(huán)境監(jiān)測(cè)的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和回 顧， 通過收集的數(shù)據(jù)和趨勢(shì)分析，總結(jié)和評(píng)估潔凈 實(shí)驗(yàn)室是否受控，評(píng)估警戒限和糾偏限是否適合， 評(píng)估所采取的糾偏措施是否合適。 應(yīng)當(dāng)正確評(píng)估微生物污染， 不僅僅關(guān)注微 生物數(shù)量，更應(yīng)關(guān)注微生物污染檢出的頻率， 往往 在一個(gè)采樣周期內(nèi)同一環(huán)境中多點(diǎn)發(fā)現(xiàn)微生物污染， 可能預(yù)示著風(fēng)險(xiǎn)增加，應(yīng)仔細(xì)評(píng)估。幾個(gè)位點(diǎn)同時(shí) 有污染的現(xiàn)象也可能由不規(guī)范的采樣操作引起， 所 以在得出環(huán)境可能失控的結(jié)論之前，應(yīng)仔細(xì)回顧采 樣操作過程。在污染后的幾天對(duì)環(huán)境進(jìn)行重新采樣 是沒有意義的， 因?yàn)椴蓸舆^程不具有可重復(fù)性。 （ 2）偏差處理 當(dāng)微生物監(jiān)測(cè)結(jié)果超出糾偏限度時(shí)，應(yīng)當(dāng) 按照偏差處理規(guī)程進(jìn)行報(bào)告、記錄、調(diào)查、處理以 及采取糾正措施，并對(duì)糾正措施的有效性進(jìn)行評(píng)估。 7.微生物鑒定 建議對(duì)受控環(huán)境收集到的微生物進(jìn)行適當(dāng) 水平的鑒定， 微生物菌群信息有助于預(yù)期常見菌群， 并有助于評(píng)估清潔 /消毒規(guī)程、方法、清潔 /消毒劑 及微生物監(jiān)測(cè)方法的有效性，尤其當(dāng)超過監(jiān)測(cè)限度 時(shí)，微生物鑒定信息有助于污染源的調(diào)查。關(guān)鍵區(qū) 域分離到的菌落應(yīng)先于非關(guān)鍵區(qū)域進(jìn)行鑒定。 微生 物鑒定參照微生物鑒定指導(dǎo)原則“通則 9204 微生 物鑒定指導(dǎo)原則 ”進(jìn)行。 微生物控制 微生物控制手段： 為了保證藥品潔凈實(shí)驗(yàn)室環(huán)境維持適當(dāng)?shù)?水平， 并處于受控狀態(tài)， 除保持空調(diào)系統(tǒng)的良好 運(yùn)行狀態(tài)，對(duì)設(shè)施進(jìn)行良好維護(hù)，潔凈室內(nèi)人員應(yīng) 嚴(yán)格遵守良好的行為規(guī)范，并定期進(jìn)行環(huán)境監(jiān)控。 除保持空調(diào)系統(tǒng)的良好運(yùn)行狀態(tài)，對(duì)設(shè)施進(jìn)行良好 維護(hù)，潔凈室內(nèi)人員應(yīng)嚴(yán)格遵守良好的行為規(guī)范， 并定期進(jìn)行環(huán)境監(jiān)控。 消毒劑和清潔劑的要求： 應(yīng)當(dāng)監(jiān)測(cè)消毒劑和清潔劑的微生物污染狀 況， 并在規(guī)定的有效期內(nèi)使用， A/B 級(jí)潔凈區(qū)應(yīng)當(dāng) 使用無菌的或經(jīng)無菌處理的消毒劑和清潔劑。 所采 用的化學(xué)消毒劑應(yīng)經(jīng)過驗(yàn)證或有證據(jù)表明其消毒效 果， 其種類應(yīng)當(dāng)多于一種， 并定期進(jìn)行更換以防 止產(chǎn)生耐受菌株。不得用紫外線消毒代替化學(xué)消毒。 必要時(shí)，可采用熏蒸等適宜的方法降低潔凈區(qū)的衛(wèi) 生死角的微生物污染， 并對(duì)熏蒸劑的殘留水平進(jìn)行 驗(yàn)證。 各潔凈級(jí)別的轉(zhuǎn)換（約相當(dāng)） GMP(2010) GB(50457-2008) GB(50073-2013) A級(jí)（動(dòng)態(tài)） 100級(jí) ISO 5級(jí) B級(jí)（靜態(tài)） B級(jí)（動(dòng)態(tài)） 100級(jí) 10000級(jí) ISO 5級(jí) ISO 7級(jí) C級(jí)（靜態(tài)） C級(jí)（動(dòng)態(tài)） 10000級(jí) 100000級(jí) ISO 7級(jí) ISO 8級(jí) D級(jí)（靜態(tài)） 100000級(jí) ISO 8級(jí) GB50457-2008 醫(yī)藥工業(yè)潔凈廠房設(shè)計(jì)規(guī)范 GB50073-2013潔凈廠房設(shè)計(jì)規(guī)范 四、 9206無菌檢查用隔離系統(tǒng)驗(yàn)證指導(dǎo)原則 新軟艙體無菌檢查隔離器 無菌檢查用隔離器的結(jié)構(gòu) 1. 空氣處理系統(tǒng) 2. 傳遞接口及傳遞門 3.滅菌設(shè)備 4. 配套設(shè)備與輔助設(shè)施 汽化過氧化氫發(fā)生器 無菌傳遞艙 隔離器安裝位置的選擇 無菌檢查用隔離器安裝環(huán)境的潔凈度要求 建議 不 低于我國現(xiàn)行 GMP 中 D 級(jí)空氣潔凈度要求，安裝隔 離器的房間應(yīng)限制無關(guān)人員出入。 應(yīng)保證隔離器安 裝地點(diǎn)周圍有足夠的空間， 以便于隔離器的移動(dòng)、 物品的輸送和正常維護(hù)。 隔離系統(tǒng)驗(yàn)證 1 操作驗(yàn)證 2 隔離器完整性驗(yàn)證 3 滅菌驗(yàn)證 4 滅菌循環(huán)驗(yàn)證 5. 隔離器內(nèi)部潔凈度驗(yàn)證 6. 儀器儀表的驗(yàn)證 隔離器的應(yīng)用 1. 包裝完整性驗(yàn)證 2. 隔離器內(nèi)部環(huán)境的無菌維持 3. 無菌檢驗(yàn)結(jié)果的解釋 4. 安全與培訓(xùn) 1101 無菌檢查法 細(xì)菌培養(yǎng)基：硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基 霉菌培養(yǎng)基： 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基 檢驗(yàn)數(shù)量：除另有規(guī)定外，出廠產(chǎn)品按表 1規(guī)定；上市產(chǎn)品監(jiān)督檢驗(yàn)按表 2規(guī)定。 表 1、表 2中最少檢驗(yàn)數(shù)量不包括陽性對(duì)照試驗(yàn)的供試品用量。 表 2 上市抽驗(yàn)樣品的最少檢驗(yàn)數(shù)量 供試品 供試品最少檢驗(yàn)數(shù)量（瓶或支） 液體制劑 固體制劑 血液制品 V<50ml V50ml 醫(yī)療器具 10 10 6 2 10 注： 1.若供試品每個(gè)容器內(nèi)的裝量不夠接種兩種培養(yǎng)基，那么表中的最少檢驗(yàn)數(shù)量應(yīng)增加相應(yīng)倍數(shù)。 2.抗生素粉劑（ 5g）及抗生素原料藥（ 5g）的最少檢驗(yàn)數(shù)量為 6瓶（或支）。 桶裝固體原料的最少 檢驗(yàn)數(shù)量為 4個(gè)包裝。 表 3 供試品的最少檢驗(yàn)量 供試品 供試品裝量 每支供試品接入每種培養(yǎng) 基的最少量 液體制劑 1ml 1ml<V40ml 40ml100ml 全量 半量，但不得少于 1ml 20ml 10%但不少于 20ml 固體制劑 M<50mg 50mgM<300mg 300mgM<5g M5g 全量 半量 150mg 500mg 半量（生物制品） 生物制品的原 液及半成品 半量 醫(yī)療器具 外科用敷料棉花 及紗布縫合線， 一次性醫(yī)用材料 帶導(dǎo)管的一次性 醫(yī)療器具（如輸 液袋） 其他醫(yī)療器具 取 100mg或 1cm 3cm整個(gè)材 料 二分之一內(nèi)表面積 整個(gè)器具（切碎或拆散開）