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1、食品工業(yè)中應(yīng)用的研究 食品工業(yè)中應(yīng)用的研究 2014/05/16 1傳統(tǒng)方法獲得GOD 1.1菌株誘變對(duì)GOD生產(chǎn)菌株的誘變通常采用紫外誘變和化學(xué)誘變劑誘變等方法。紫外線照射通過(guò)改變菌體DNA從而引起菌體的突變。李筱瑜等人將黑曲霉菌株P(guān)－9采用紫外線進(jìn)行誘變，得到突變菌株U－69產(chǎn)酶酶活是出發(fā)菌株P(guān)－9的2.5倍?；瘜W(xué)誘變是用化學(xué)誘變劑處理菌種，以誘發(fā)遺傳物質(zhì)的突變。化學(xué)誘變相比于紫外誘變更具定向性，化學(xué)誘變劑不同，作用的菌株、細(xì)胞及基因不同，誘變的效果也會(huì)存在差異。常

2、用的化學(xué)誘變劑有甲基磺酸乙酯(EMS)和硫酸二乙酯(DES)等。選擇單獨(dú)一種誘變方法，也可以幾種方法復(fù)合使用，篩選出其中的正突變菌株，提高原始菌株產(chǎn)酶能力。 1.2微生物產(chǎn)GOD的主要影響因素通過(guò)篩選得到高產(chǎn)GOD的天然菌株或者通過(guò)誘變育種獲得高產(chǎn)的突變菌株，同時(shí)適宜菌株生長(zhǎng)的培養(yǎng)條件及合適的培養(yǎng)基組成也是高效生產(chǎn)微生物GOD的關(guān)鍵因素。發(fā)酵條件的優(yōu)化能進(jìn)一步提高菌株的產(chǎn)酶活力。文獻(xiàn)中適宜微生物產(chǎn)GOD的條件見(jiàn)表2。從表2可以看出，不同的菌種對(duì)碳源有顯著的選擇性。一般生產(chǎn)中選擇葡萄糖作為產(chǎn)GOD菌株的碳源，Hatziuikolaou等報(bào)道，葡萄糖是GOD最主要的誘導(dǎo)物，另有一些霉菌在以蔗糖、

3、糖漿、甘露糖、果糖等作為碳源時(shí)也能產(chǎn)生GOD。研究表明，初始碳源濃度為8%左右時(shí)適宜GOD的合成。濃度降低，菌體生長(zhǎng)緩慢，使產(chǎn)酶下降;而濃度繼續(xù)增大，由于其分解代謝物大量生成形成阻遏作用，產(chǎn)酶水平也會(huì)降低。而在氮源的選擇上，有研究表明，硝酸鹽比蛋白胨等有機(jī)氮源對(duì)產(chǎn)酶的促進(jìn)效果更好。郭曉賢等的研究結(jié)果表明，將硝酸鹽和蛋白胨復(fù)配作為復(fù)合氮源相比于單一氮源更有利于GOD的生成。 培養(yǎng)基初始pH對(duì)酶活力有很大的影響，pH值的選擇在GOD的生產(chǎn)中是一個(gè)關(guān)鍵的因素。GOD在pH56之間活力較高，在接近5.5時(shí)酶活力最高;pH值低于4.5，或超過(guò)6.5時(shí)酶活均有顯著下降趨勢(shì)。GOD在強(qiáng)酸強(qiáng)堿環(huán)境中活力容易

4、降低的原因可能是由于酶蛋白活性中心氨基酸殘基隨著pH值的變化而發(fā)生了改變，使得酶蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而喪失活性。在現(xiàn)實(shí)環(huán)境下，最適pH值不一定是一個(gè)固定值，隨著底物、緩沖液的不同而相應(yīng)地發(fā)生變化。一般來(lái)說(shuō)葡萄糖氧化酶在pH56時(shí)有較好的穩(wěn)定性。在微生物的生長(zhǎng)和GOD的合成過(guò)程中，溫度影響很大，一般認(rèn)為30℃31℃為黑曲霉的最適發(fā)酵溫度。在發(fā)酵培養(yǎng)前期將溫度控制在略高于30℃，使菌絲體生長(zhǎng)旺盛，之后溫度降至30℃31℃培養(yǎng)，產(chǎn)酶量將有很大程度的增長(zhǎng)，因?yàn)楫a(chǎn)酶需要相對(duì)較低的溫度。青霉菌生產(chǎn)GOD的適宜溫度比黑曲霉略低，一般在26℃29℃。 產(chǎn)酶活性最初隨時(shí)間的增加而增大，達(dá)到最大值后隨時(shí)間的增加而逐

5、步降低。因?yàn)槌跏茧A段微生物生長(zhǎng)迅速，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，產(chǎn)酶逐漸增加。隨著微生物繼續(xù)生長(zhǎng)繁殖，代謝產(chǎn)物逐漸增多，尤其是酸的大量生成使pH值迅速下降，不利于產(chǎn)酶。不同菌種生長(zhǎng)周期不同，因此根據(jù)不同的菌種選擇合適的發(fā)酵時(shí)間有利于GOD的生產(chǎn)。在菌株培養(yǎng)產(chǎn)酶的過(guò)程中，只有當(dāng)溶氧滿(mǎn)足菌體的需求時(shí)，菌體才能正常的生長(zhǎng)及產(chǎn)酶。當(dāng)達(dá)到一定轉(zhuǎn)速，溶氧量已經(jīng)可滿(mǎn)足菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的需求時(shí)，酶活不會(huì)出現(xiàn)明顯增加的現(xiàn)象。在實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵試驗(yàn)中，攪拌轉(zhuǎn)速一般選擇在200r/min左右。在GOD的合成過(guò)程中，低濃度的鈣離子對(duì)GOD的產(chǎn)生有促進(jìn)作用，當(dāng)超過(guò)一定濃度之后反而抑制產(chǎn)酶。經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，以35g/L的濃度添加CaCO3對(duì)產(chǎn)酶

6、的促進(jìn)作用最明顯，而Mg2+、Fe2+在GOD的合成過(guò)程中起到抑制作用。 2利用基因重組技術(shù)獲得GOD 工業(yè)化生產(chǎn)中常用黑曲霉或青霉發(fā)酵來(lái)獲得GOD，但黑曲霉和青霉菌發(fā)酵過(guò)程中常會(huì)伴隨產(chǎn)生過(guò)氧化氫酶、淀粉酶等其他雜蛋白，給后期的分離純化工作帶來(lái)困難，使用基因工程菌重組表達(dá)葡萄糖氧化酶基因有利于解決這一問(wèn)題。將GOD的基因進(jìn)行克隆，連接相應(yīng)的表達(dá)載體后轉(zhuǎn)化基因工程菌株，通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)GOD基因來(lái)獲取大量的GOD蛋白。由于基因工程菌株分泌到基質(zhì)中的其本身內(nèi)源蛋白量很少，基質(zhì)中主要是基因工程菌株分泌到胞外的外源目的蛋白，因此能簡(jiǎn)化后期的蛋白純化操作。目前國(guó)外主要用基因克隆、表達(dá)來(lái)提高菌株的產(chǎn)酶活力

7、，在這一領(lǐng)域研究已經(jīng)比較深入。WhittingtonH成功地將青霉菌的GOD基因?qū)氲结劸平湍钢?，獲得了具有生物活性的GOD;Szynol實(shí)現(xiàn)了GOD基因在大腸桿菌中的表達(dá);SilviaCrognale將一株青霉的GOD基因成功導(dǎo)入到畢赤酵母中，發(fā)酵培養(yǎng)酶活達(dá)到50U/mL;國(guó)內(nèi)在這一方面的研究也取得了一定的進(jìn)展。母敬郁等采用瑞氏木霉表達(dá)了黑曲霉來(lái)源的GOD基因，經(jīng)過(guò)對(duì)重組后的瑞氏木霉進(jìn)行誘變篩選，突變株的GOD發(fā)酵液酶活達(dá)到25U/mL。目前已有多種外源基因表達(dá)系統(tǒng)被開(kāi)發(fā)出來(lái)，如大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)等。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)雖然發(fā)展較為成熟，操作簡(jiǎn)單、周期短、產(chǎn)量高，但其表達(dá)產(chǎn)物無(wú)翻譯后

8、的修飾與加工過(guò)程，不能對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行翻譯。酵母繁殖速度快、易于培養(yǎng)、基因工程操作簡(jiǎn)便，并能夠?qū)δ康牡鞍走M(jìn)行翻譯后加工與修飾，越來(lái)越廣泛地用作外源基因表達(dá)的宿主菌株。常用的酵母表達(dá)系統(tǒng)主要有釀酒酵母(Sac-charomycesceresiviae)和巴斯德畢赤酵母(Pichiapasloris)表達(dá)系統(tǒng)。釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)由于存在表達(dá)產(chǎn)物產(chǎn)量低、分泌效果差，不適合高密度發(fā)酵等缺點(diǎn)在實(shí)際應(yīng)用中有一定的局限性。巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)外源基因表達(dá)量高且穩(wěn)定、培養(yǎng)成本低，且適合于高密度發(fā)酵，便于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。同時(shí)分泌到細(xì)胞外的自身蛋白量少，有利于外源蛋白后期的分離純化，因此被廣泛地應(yīng)用于外源基因的表達(dá)。

9、 畢赤酵母發(fā)酵生產(chǎn)外源蛋白一般過(guò)程包括:首先基因工程菌株在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)達(dá)到一定的生物量，然后以甲醇為誘導(dǎo)物誘導(dǎo)產(chǎn)酶。前一階段并不誘導(dǎo)產(chǎn)酶，只是菌體富集的階段;后一階段在甲醇的誘導(dǎo)下，畢赤酵母甲醇氧化酶AOX1基因才能啟動(dòng)和表達(dá)，此時(shí)才誘導(dǎo)產(chǎn)酶。在優(yōu)化工程菌株的發(fā)酵條件時(shí)，除了控制溫度、pH值、溶氧等常規(guī)條件外，甲醇作為誘導(dǎo)過(guò)程中唯一的碳源和誘導(dǎo)物是影響表達(dá)效果的關(guān)鍵因素，其誘導(dǎo)方式、濃度、誘導(dǎo)時(shí)間都會(huì)產(chǎn)生影響外源蛋白的表達(dá)。既要保證甲醇濃度能夠滿(mǎn)足畢赤酵母表達(dá)代謝所需要的碳源和能量，同時(shí)甲醇濃度過(guò)高會(huì)產(chǎn)生過(guò)量的過(guò)氧化氫及甲醛，對(duì)細(xì)胞造成毒害，因此嚴(yán)格控制甲醇濃度是提高畢赤酵母表達(dá)量的

10、重要因素。雖然目前利用基因工程的手段實(shí)現(xiàn)了GOD的異源表達(dá)，但是由于表達(dá)量不高導(dǎo)致的生產(chǎn)成本高的問(wèn)題仍然沒(méi)有得到有效的解決，阻礙了GOD的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用。因此如何采用基因工程技術(shù)實(shí)現(xiàn)GOD基因的高效表達(dá)，使GOD的產(chǎn)量得到大幅度的提高成為了亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。 作者：朱運(yùn)平伍少明李秀婷肖林滕超褚文丹單位：北京工商大學(xué)食品學(xué)院食品添加劑與配料北京高校工程研究中心北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室山東龍力生物科技股份有限公司 上一個(gè)文章： 物聯(lián)網(wǎng)的食品安全信息化研究下一個(gè)文章： 情景劇表演對(duì)食品安全教學(xué)的影響