《NCBI基本功能與引物設(shè)計(jì).ppt》由會(huì)員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《NCBI基本功能與引物設(shè)計(jì).ppt（38頁(yè)珍藏版）》請(qǐng)?jiān)谘b配圖網(wǎng)上搜索。

,,NCBI常用功能與引物設(shè)計(jì),2010級(jí)博士：謝鵬,導(dǎo)師：鄒曉庭,Your site here,為何要接觸NCBI？,如何使用NCBI？,如何設(shè)計(jì)引物？,Your site here,NCBI簡(jiǎn)介,NCBI：National Center for Biotechnology Information 美國(guó)國(guó)家信息技術(shù)中心 （http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）,1992年10月，NCBI承擔(dān)起對(duì)GenBank DNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)的責(zé)任。NCBI工作人員通過(guò)來(lái)自各個(gè)實(shí)驗(yàn)室遞交的序列和同國(guó)際核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)（EMBL和DDBJ）交換數(shù)據(jù)建立起數(shù)據(jù)庫(kù).,Genebank是遺傳序列數(shù)據(jù)庫(kù)，一個(gè)所有可以公開(kāi)獲得的DNA序列的注釋過(guò)的收集。 GenBank以指數(shù)形式增長(zhǎng)，核酸堿基數(shù)目大概每14個(gè)月就翻一個(gè)倍。最近，GenBank擁有來(lái)自47,000個(gè)物種的30億個(gè)堿基。,Sub title,NCBI常用功能,,查找核酸/氨基酸序列,序列相似性分析,引物驗(yàn)證,Your site here,一、查找核酸、氨基酸序列,1.以雞FAT/CD36為例，search：,2.調(diào)整右側(cè)檢索目錄，tree--list：,,,Your site here,3.瀏覽信息，下載序列，并以Genebank、FASTA格式保存,點(diǎn)擊Genebank:,,,,,,,,氨基酸序列：,Genebank核酸序列：,… …,FASTA格式的核酸序列：,,,… …,Your site here,二、序列相似性分析,序列相似性分析： 就是將待研究序列與DNA或蛋白質(zhì)序列庫(kù)進(jìn)行比較，用于確定該序列的生物屬性，也就是找出與此序列相似的已知序列是什么。完成這一工作只需要使用兩兩序列比較算法。常用的程序包有BLAST、FASTA等 序列同源性分析： 是將待研究序列加入到一組與之同源，但來(lái)自不同物種的序列中進(jìn)行多序列同時(shí)比較，以確定該序列與其它序列間的同源性大小。這是理論分析方法中最關(guān)鍵的一步。完成這一工作必須使用多序列比較算法。常用的程序包有DNAMAN、CLUSTAL等,Blast簡(jiǎn)介,BLAST ： “局部相似性基本查詢工具”(Basic Local Alignment Search Tool)的 縮寫(xiě)，是由NCBI開(kāi)發(fā)的一個(gè)基于序列相似性的數(shù)據(jù)庫(kù)搜索程序。,主要的Blast程序：,,,Blast 序列相似性分析,1.修改測(cè)序結(jié)果，剔除克隆載體序列,在測(cè)序結(jié)果中找到上下游引物對(duì)應(yīng)位置，剔除引物外的多余部分,以鴿子的I-FABP片段為例：,GCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATTAGGAAGTTAGGAGCCCACGATAATCTGAAGATCACTATTCAACAAGATGGAAACAAATTTACGGTCAAAGAATCAAGCAACTTCCGTACTATAGATATTGAATTCACTCTGGGAGTCAATTTTGACTACAGTCTCGCTGACGGAACGGAAATCTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGT… …,上游引物：5‘-AGRAARYTDGSAGCYCAC-3’ 下游引物： 5‘- TCHGTYCCRTCWGCBAGA-3‘,,,,TAGGAAGTTAGGAGCCCACGATAATCTGAAGATCACTATTCAACAAGATGGAAACAAATTTACGGTCAAAGAATCAAGCAACTTCCGTACTATAGATATTGAATTCACTCTGGGAGTCAATTTTGACTACAGTCTCGCTGACGGAACGGA,Your site here,2.進(jìn)入NCBI 3.點(diǎn)擊Basic BLAST中的nucleotide blast選項(xiàng),Your site here,,,,,,,Your site here,4.尋找相近物種，比較相似性,,,,,,Your site here,,,,,點(diǎn)擊score，獲得相似性比較具體信息,NCBI官方說(shuō)明：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/tutorial/Altschul-1.html,Your site here,引物設(shè)計(jì)與簡(jiǎn)并PCR,RT－PCR原理與技術(shù)簡(jiǎn)介 引物設(shè)計(jì)過(guò)程 簡(jiǎn)并PCR技術(shù) 后續(xù)研究,Your site here,RT－PCR原理與技術(shù)簡(jiǎn)介,DNA mRNA 蛋白質(zhì),酶活力 Western blot,Northern blot 半定量RTPCR 定量RTPCR,Your site here,RT－PCR原理與技術(shù)簡(jiǎn)介,,1,2,Your site here,常規(guī)引物設(shè)計(jì),引物設(shè)計(jì)原則 Primer5和Oligo6進(jìn)行引物分析,Your site here,引物設(shè)計(jì)原則,引物的長(zhǎng)度一般為15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因?yàn)檫^(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，即Taq 酶的最適溫度。 引物3’端的序列要比5’端重要。引物3’端的堿基一般不用A，因?yàn)锳在錯(cuò)誤引發(fā)位點(diǎn)的引發(fā)效率相對(duì)比較高。另外引物間3’端的互補(bǔ)、二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)失敗。5’端序列對(duì)PCR 影響不大。 引物的GC含量一般為40-60%，以45-55％為宜，過(guò)高或過(guò)低都不利于引發(fā)反應(yīng)。PCR引物的GC/AT比率應(yīng)當(dāng)?shù)扔诨蚋哂谒糯蟮哪０宓腉C/AT比。 ΔG值(自由能)反映引物與模板結(jié)合的強(qiáng)弱程度。一般情況下，引物的ΔG值最好呈正弦曲線形狀，即5’端和中間ΔG值較高，而3’端ΔG值相對(duì)較低，且不要超過(guò)9（ΔG值為負(fù)值，這里取絕對(duì)值）。 引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能量一般不要超過(guò)4.5，否則容易產(chǎn)生引物二聚體帶。,,Your site here,以雞的I-FABP為例，設(shè)計(jì)常規(guī)引物：,1.輸入I-FABP的已知序列，點(diǎn)擊primer:,,Your site here,2.點(diǎn)擊search進(jìn)行引物條件設(shè)置：,,,,,,,,3.Search criteria 篩選,,,,,,,Your site here,4.選擇最優(yōu)引物,5.手動(dòng)修改，調(diào)整引物,,,Your site here,Blast 引物驗(yàn)證,最為重要的環(huán)節(jié)：對(duì)自己設(shè)計(jì)的引物或文獻(xiàn)報(bào)道的引物進(jìn)行測(cè)試,1.登陸NCBI——Blast——Primer-BLAST: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/,,Your site here,以文獻(xiàn)報(bào)道雞的MUC2的引物為例：,,Your site here,,,,Your site here,,,Your site here,簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì),More of an art than a science 降低簡(jiǎn)并度（500以下） 例如：上游 D Y N L F D L L 下游 P V N G N G K Q 根據(jù)密碼子表建立引物系列http://www.kazusa.or.jp/codon/ 謹(jǐn)慎使用次黃嘌呤,GAYTAYAAYYTNTTYGAYYTNYTN,CCNGTNAAYGGNAAYGGNAARCAR,Symbol Definition B not A D not C H not G I Inosine K G or T/U M A or C N A,C,G or T/U R A or G S C or G V not T/U W A or T Y C or T/U,簡(jiǎn)并引物：在常規(guī)引物的某些位點(diǎn)上以簡(jiǎn)并核苷酸代替。,Your site here,簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)過(guò)程,傳統(tǒng)方法（適用于保守度高序列） 應(yīng)用BLAST進(jìn)行同源序列搜索 應(yīng)用DNAMAN選擇保守區(qū)域（氨基酸或核苷酸） 簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)原則 Primer5和Oligo6進(jìn)行引物分析 CODEHOP法（適用于保守度低序列）,Your site here,應(yīng)用BLAST進(jìn)行同源序列搜索,剪切然后粘貼DNA或蛋白序列； 使用FASTA格式的序列； FASTA格式的序列以一個(gè)單行的說(shuō)明開(kāi)始，說(shuō)明行以其開(kāi)始處的一個(gè)大于號(hào)（）與序列數(shù)據(jù)區(qū)分開(kāi)。說(shuō)明行以下是序列數(shù)據(jù)。 簡(jiǎn)單使用訪問(wèn)編號(hào)：RefSeq或Genebank序號(hào)。 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/,Your site here,Your site here,DNAMAN分析序列保守區(qū),對(duì)Gallus、Taeniopygia、Mus、Ruttus的I-FABP的CDS進(jìn)行分析得到保守區(qū)序列,,Your site here,CODEHOP,原理 方法： http://bioinformatics.weizmann.ac.il/blocks/codehop.html,,Your site here,簡(jiǎn)并PCR技術(shù),,,,,,RNA,cDNA,cDNA,反轉(zhuǎn)錄,合并產(chǎn)物,分裝產(chǎn)物,,,,,,β-actin,樣 品,PCR,Your site here,簡(jiǎn)并PCR技術(shù),使用標(biāo)準(zhǔn)的反應(yīng)體系并適當(dāng)增大引物濃度（1-3 μM） 退火溫度是最關(guān)鍵點(diǎn)： 采用Touchdown方法優(yōu)化條件 采用梯度PCR優(yōu)化條件 使用熱啟動(dòng)PCR 循環(huán)數(shù)增加至50 cycles 電泳檢測(cè)至關(guān)重要 不用二次擴(kuò)增重復(fù)結(jié)果,Your site here,應(yīng)用半定量或定量PCR法研究營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等對(duì)該基因表達(dá)水平的影響 使用RACE法進(jìn)行基因cDNA全長(zhǎng)擴(kuò)增 進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 原核表達(dá) 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù) 為RNAi法研究基因功能提供基礎(chǔ),后續(xù)研究,,Thank You!,