小麥籽粒植酸含量和無(wú)機(jī)磷含量的分布及其關(guān)系 植酸(Phytic acid,PA)又稱肌醇-6-磷酸(Myo-inositol 1,2,3,4,5,6hexakisphosphate或InsP6),是維生素族的1種肌醇六磷酸,是植物種子中磷的主要存儲(chǔ)形式,其含磷量占種子全磷的60% 80%,占肌醇多磷酸的95%以上,而其余肌醇多磷酸的磷量往往不到全磷的5%,另外無(wú)機(jī)磷含量占全磷的2%8%。細(xì)胞磷(包括DNA、RNA、自由核苷酸、磷脂和糖脂 等)所含磷占種子全磷量的10%20%。小麥種子植酸主要分布在糊粉層,84%88%的植酸存在于麩皮中,胚芽部分約占10%,而胚乳中幾乎沒(méi)有,約占2%左右。研究表明,禾谷類作物用作糧食和飼料時(shí),非反芻動(dòng)物(包括人)不能消化吸收植酸和植酸鹽。在消化道中,植酸易于與Fe和Zn等礦質(zhì)元素形成不能被人和反芻動(dòng)物吸收的復(fù)合物,也可以與蛋白質(zhì)結(jié)合形成植酸-蛋白質(zhì)二元復(fù)合物或植酸-金屬陽(yáng)離子-蛋白質(zhì)三元復(fù)合物,而且植酸還會(huì)抑制-淀粉酶和磷脂酶的活性,所以植酸是不可忽視的抗?fàn)I養(yǎng)因子。土壤中缺乏分解植酸及植酸鹽的微生物,有機(jī)肥中的植酸還會(huì)造成土壤、水系磷污染。 植酸含量多采用三氯化鐵比色法,其原理是利用植酸對(duì)鐵離子強(qiáng)烈的螯合作用,通過(guò)顯色反應(yīng)的OD值來(lái)測(cè)定出植酸含量。李春喜等采用FeCl3-磺基水楊酸測(cè)定了18個(gè)品種籽粒的植酸含量,其平均含量是10.55mg/g,百農(nóng)64(11.98mg/g)含量最高,豫麥34(9.36mg/g)含量最低,不同品種間籽粒植酸含量差異極顯著,說(shuō)明不同品種間存在廣泛的遺傳變異。吳澎等對(duì)我國(guó)137份微核心種質(zhì)資源小麥材料的全麥粉中的植酸含量進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果表明植酸平均含量為21.04g/mg,并按植酸含量其分為高、中、低含量3類品種,各占供試品種的3.45%、89.3%及7.25%。無(wú)機(jī)磷含量測(cè)定多采用鉬藍(lán)比色法,其原理如下:磷在一定酸度下,磷酸與鉬酸銨作用生成磷鉬酸銨,對(duì)苯二酚、亞硫酸鈉可將磷鉬酸銨還原成藍(lán)色的鉬藍(lán),使溶液呈藍(lán)色,藍(lán)色的深淺與磷的含量成正比,可用分光光度計(jì)測(cè)定,從而間接反應(yīng)出植酸含量。李麗等對(duì)磷鉬黃比色法測(cè)定小麥麩中植酸含量的測(cè)試條件進(jìn)行研究,結(jié)果表明該方法檢測(cè)植酸磷含量的線性范圍為016g/mL,相關(guān)系數(shù)為0.999 4,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.22%1.32%,樣品加標(biāo)回收率為95.3%103%。Guttieri等利用鉬藍(lán)顯色法從EMS誘變后代中篩選出了低植酸的小麥突變株系,低植酸特性改變了麥粒中的總磷量分布,增加中央胚乳磷含量的同時(shí)減少了麩皮中磷的含量,突變型麩皮中的無(wú)機(jī)磷比野生型增加了4倍。楊宋蕊利用鉬藍(lán)顯色法篩選出2個(gè)EMS誘變小麥籽粒高無(wú)機(jī)磷突變體HIP-y1和HIPh1。秦麗燕等利用鉬藍(lán)比色法測(cè)定了570份普通小麥品種(系)和近緣種雜交后代株系,以及4個(gè)普通小麥雜交組合后代株系的籽粒無(wú)機(jī)磷含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn),這570份材料的籽粒無(wú)機(jī)磷含量主要分布在0.46 0.93g/mg之間,低無(wú)機(jī)磷(低于0.15g/mg)和高無(wú)機(jī)磷(高于0.93g/mg)的材料都比較少,分別只占材料總數(shù)的3.16%和1.23%。4個(gè)雜交組合群體無(wú)機(jī)磷含量的平均值分別為0.65、0.59、0.45和0.58g/mg,與其親本材料含量相仿。目前報(bào)道側(cè)重于小麥籽粒植酸含量或無(wú)機(jī)磷含量的研究。本研究采用三氯化鐵比色法和鉬藍(lán)比色法同時(shí)對(duì)92份小麥品種(系)全麥粉的植酸和無(wú)機(jī)磷含量進(jìn)行測(cè)定和分析,同時(shí)考查它們與千粒重和容重的相關(guān)性,旨在分析小麥籽粒植酸含量和無(wú)機(jī)磷含量的分布以及兩者之間的關(guān)系,從而為小麥營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)分析、小麥種質(zhì)資源篩選和品質(zhì)育種提供參考。1、材料與方法1.1材料92份小麥品種或品系于2010/2011年度種植于中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)上莊實(shí)驗(yàn)站試驗(yàn)田。試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì),每小區(qū)4行,行長(zhǎng)2m,行距25cm,3次重復(fù)。待植株成熟后,收獲各個(gè)小區(qū)的小麥籽粒。各品種(系)籽粒于2011年夏收獲后,及時(shí)晾曬,在室內(nèi)進(jìn)行考種。達(dá)到安全含水量后后熟3個(gè)月,手工磨制全麥粉,每份約5g。1.2精密儀器和藥品規(guī)格本研究室內(nèi)使用儀器為"航天二院"生產(chǎn)的航天之星ZS-3板式酶標(biāo)儀。所用藥品純度均為分析純。1.3方法1.3.1無(wú)機(jī)磷含量的測(cè)定小麥籽粒全麥粉的無(wú)機(jī)磷含量測(cè)定采用鉬藍(lán)比色法,具體參照Dorsch等9的方法進(jìn)行,略有修改,具體操作如下:準(zhǔn)確稱取90mg全麥粉置于2mL離心管中,加入900L 10.4mol/L的鹽酸,漩渦震蕩30min后,置于4 冰箱過(guò)夜提取。次日,漩渦震蕩30s后,6 000r/min離心2min,上清即為無(wú)機(jī)磷提取液。取10L提取液于96孔酶標(biāo)板中(同時(shí)將磷標(biāo)準(zhǔn)樣品作為對(duì)照),加100L水和100L顯色液,其他樣品均加入90L蒸餾水和100L顯色液,室溫下反應(yīng)1h后,放入酶標(biāo)儀中在410nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值。顯色液由3mol/L硫酸、25%鉬酸銨、10%抗壞血酸、蒸餾水按1112配置而成。磷標(biāo)準(zhǔn)樣品用磷酸氫二鉀配制,含磷量分別是0、0.50、0.46、0.93和1.39g/mg。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次,取其平均值。1.3.2植酸含量的測(cè)定小麥籽粒全麥粉的植酸含量測(cè)定采用三氯化鐵比色法,具體參照傅啟高等的方法進(jìn)行,略有修改,具體操作如下:稱取 樣品2.0g,加入40 mL1.2%HCl&10%Na2SO4溶液于室溫下攪拌浸提2h,8 000r/min離心15min,取上清液于4冰箱中備用。取0.1g/L植酸標(biāo)準(zhǔn)液分別0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.4mL于10mL玻璃試管中,加蒸餾水3.0、2.8、2.6、2.4、2.2、2.0、1.6mL配成標(biāo)準(zhǔn)曲線,搖勻;取植酸提取液2 mL,加入15% TCA2mL,于10mL硬質(zhì)玻璃試管中混勻,4 冰箱中靜置2h后,8 000r/min離心15min。吸取上清2mL,用0.75mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH為6.06.5,加蒸餾水至30mL,混勻,分別取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測(cè)溶液150L于酶標(biāo)板中,加入50L 0.3%磺基水楊酸&0.03% FeCl3&6H2O,混勻后放入酶標(biāo)儀在500nm處測(cè)定OD值。1.3統(tǒng)計(jì)方法使用Excel軟件分析各品種(系)植酸含量以及無(wú)機(jī)磷含量的極大值、極小值和平均值。并通過(guò)Excel圖表軟件繪制品種(系)間籽粒植酸酸、無(wú)機(jī)磷含量、容重及千粒重的頻率分析柱狀圖。2、結(jié)果與分析2.1小麥籽粒無(wú)機(jī)磷含量的變異采用鉬藍(lán)比色法對(duì)92份小麥品種(系)籽粒的無(wú)機(jī)磷含量進(jìn)行了測(cè)定,結(jié)果(圖1)表明,在所測(cè)品種中無(wú)機(jī)磷含量為0.421.60g/mg,平均值為0.84g/mg,變異系數(shù)是0.24。籽粒無(wú)機(jī)磷含量在0.150.93g/mg的材料占參試材料的73.9%,籽粒無(wú)機(jī)磷含量高于0.93g/mg的材料占參試材料的26.1%。說(shuō)明無(wú)機(jī)磷含量在所測(cè)品種間變異范圍較大,呈近正態(tài)分布。其中高無(wú)機(jī)磷材料(高于0.93g/mg)分別是農(nóng)大5688、百農(nóng)64、晉麥80和宋3744等材料。2.2小麥籽粒植酸含量的變異采用三氯化鐵比色法對(duì)92份小麥品種的籽粒植酸含量進(jìn)行了測(cè)定,結(jié)果(圖2)表明:在所測(cè)品種中植 酸含量為17.5428.71g/mg,平均值為23.27g/mg,變異系數(shù)是0.09,變異范圍較小,呈正態(tài)分布。籽粒植酸含量在1327g/mg的中等植酸含量品種占參試材料的95%,籽粒植酸含量高于27g/mg的高植酸材料占參試材料的5%,分別是晉麥80、農(nóng)大5225、百農(nóng)64、濟(jì)麥5319和宋3744。2.3小麥籽粒植酸含量、無(wú)機(jī)磷含量與容重、千粒重的相關(guān)性對(duì)92份材料籽粒植酸含量、無(wú)機(jī)磷含量與千粒重、容重的相關(guān)性進(jìn)行了分析,結(jié)果(表1)表明:植酸含量與其容重顯著負(fù)相關(guān)(相關(guān)系數(shù)r為-0.209 2),而與其千粒重的相關(guān)系數(shù)較小、沒(méi)有達(dá)到顯著水平,說(shuō)明容重會(huì)顯著影響植酸含量,容重越低則植酸含量越高;而千粒重對(duì)植酸含量的影響很小。小麥籽粒的無(wú)機(jī)磷含量與其容重顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.231 5),與其千粒重顯著正相關(guān) (r=0.255 4),說(shuō)明容重、千粒重會(huì)顯著影響籽粒無(wú)機(jī)磷含量,容重越低(或千粒重越高)則無(wú)機(jī)磷含量越高。小麥籽粒植酸含量與間接法測(cè)定的小麥籽粒無(wú)機(jī)磷含量呈極顯著正相關(guān)(r=0.479 6)。2.4小麥籽粒植酸含量、無(wú)機(jī)磷含量和總磷含量近似值的分布趨勢(shì)根據(jù)蘇琪等換算植酸磷的方法,用已測(cè)定的植酸含量,間接估算出植酸磷含量,并將植酸磷和無(wú)機(jī)磷相加得到總磷含量近似值。按照植酸磷含量從低到高的順序繪制散點(diǎn)圖,以分析三者在材料間的分布趨勢(shì)(圖3),結(jié)果表明:無(wú)機(jī)磷含量在材料間變化幅度比較大,植酸磷含量在材料間的變化幅度比較小;總磷含量近似值在不同材料間并非穩(wěn)定不變(極大值為9.69g/mg,極小值為5.54g/mg,變異系數(shù)是0.10),其變化幅度介于植酸磷和無(wú)機(jī)磷之間,且總磷含量主要取決于植酸磷含量。因而不同品種(系)間的植酸含量不能簡(jiǎn)單地用無(wú)機(jī)磷含量來(lái)反映。3、討論常用的植酸測(cè)定方法有2種:間接測(cè)定法(測(cè)定無(wú)機(jī)磷含量)和直接測(cè)定法(測(cè)定植酸含量)。由于測(cè)定無(wú)機(jī)磷簡(jiǎn)單易行,目前大多數(shù)研究都用這種方法來(lái)間接測(cè)定植酸含量,也被廣泛用來(lái)進(jìn)行低植酸品種的篩選。因?yàn)橹参锏目偭琢勘３植蛔?在總磷一定的情況下,植酸磷含量的降低通常伴隨著無(wú)機(jī)磷含量的增加,所以植酸含量低的種子相對(duì)而言無(wú)機(jī)磷含量較高,反之,無(wú)機(jī)磷含量低的種子對(duì)應(yīng)的植酸含量較高。但是由于種子大小,籽粒飽滿度及種植地點(diǎn)和年份的差異,植物種子總磷的含量會(huì)有所差別,這種間接測(cè)定結(jié)果可信度就會(huì)降低。結(jié)合孫潔等測(cè)定玉米植酸含量時(shí)的研究結(jié)果和本研究結(jié)果,間接法測(cè)定無(wú)機(jī)磷含量數(shù)據(jù)和直接法測(cè)定植酸含量數(shù)據(jù)具有較顯著差異,所以間接法所測(cè)結(jié)果不能用于實(shí)際數(shù)值,但是可供參考。在低植酸突變體篩選時(shí),因?yàn)橥蛔儾粫?huì)造成總磷含量和細(xì)胞磷的變化,所以無(wú)機(jī)磷的高低能夠間接反映植酸含量的變化,然后用直接法進(jìn)行進(jìn)一步分析。植酸是禾谷類作物中含磷最豐富的化合物,占種子全磷量的75%,無(wú)機(jī)磷一般占全磷的2% 8%,所以理論上植酸含量高的品種(系)對(duì)應(yīng)的總磷含量應(yīng)該不低,無(wú)機(jī)磷含量也相對(duì)較高。本研究中直接法測(cè)定的植酸含量和間接法測(cè)定無(wú)機(jī)磷含量存在極顯著的正相關(guān)關(guān)系,這與之前李興林的研究結(jié)果正好相反?？赡芤?yàn)樗貌牧喜煌瑢?dǎo)致,李興林研究所用材料為市場(chǎng)所售特級(jí)面粉,而本研究所用材料為普通小麥品種(系)全麥粉,由于麩皮中存在大量植酸,所以在普通品種中篩選低植酸材料的時(shí)候不能用無(wú)機(jī)磷作為篩選指標(biāo)。影響植酸含量差異的原因包括不同品種的遺傳基因、種植地區(qū)、年份、耕作條件不同以及測(cè)定方法差異。本研究中間接法和直接法測(cè)定結(jié)果的差異說(shuō)明,在普通品種而不是突變?nèi)后w中篩選低植酸材料時(shí),應(yīng)該避免用間接測(cè)定無(wú)機(jī)磷方法作為篩選低植酸品種(系)的標(biāo)準(zhǔn),因?yàn)槠胀ㄆ贩N總磷含量差異非常大,無(wú)機(jī)磷不能間接反映植酸含量高低。而直接法所得結(jié)果相對(duì)于間接法來(lái)說(shuō),更加真實(shí)可靠,可以用于接下來(lái)的遺傳、分離規(guī)律和相關(guān)基因檢測(cè)方面的研究。