目標(biāo)導(dǎo)航,預(yù)習(xí)導(dǎo)引,1.會(huì)提取和分離血液中的血紅蛋白。 2.體驗(yàn)從復(fù)雜體系中提取生物大分子的基本過程和方法。 3.能說出色譜法、電泳法等分離生物大分子的原理。,目標(biāo)導(dǎo)航,預(yù)習(xí)導(dǎo)引,一,二,三,一、基礎(chǔ)知識(shí) 蛋白質(zhì)的各種特性的差異,如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)和對(duì)其他分子的親和力,等等,可以用來分離不同種類的蛋白質(zhì)。 1.凝膠色譜法 (1)概念:凝膠色譜法也稱做分配色譜法,是根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的有效方法。 (2)原理:大多數(shù)凝膠是由多糖類化合物構(gòu)成的小球體,小球體內(nèi)部有許多貫穿的通道,當(dāng)相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時(shí),相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道,路程較長,移動(dòng)速度較慢;而相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)無法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道,只能在凝膠外部移動(dòng),路程較短,移動(dòng)速度較快。相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)因此得以分離。,目標(biāo)導(dǎo)航,預(yù)習(xí)導(dǎo)引,一,二,三,(3)凝膠材料:多孔性,多糖類化合物,如葡聚糖或瓊脂糖。 (4)具體過程,蛋白質(zhì)混合物上柱;洗脫開始,相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)擴(kuò)散進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi);相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)則被排阻于凝膠顆粒之外;相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)被滯留;相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)向下移動(dòng);相對(duì)分子質(zhì)量不同的分子完全分開;相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)行程較短,已從層析柱中洗脫出來,相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)還在行進(jìn)中。,目標(biāo)導(dǎo)航,預(yù)習(xí)導(dǎo)引,一,二,三,2.緩沖溶液 (1)作用:在一定范圍內(nèi),能夠抵制外界的酸和堿對(duì)溶液pH的影響,維持pH基本不變。 (2)配制:通常由12種緩沖劑溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的使用比例就可以制得在不同pH范圍內(nèi)使用的緩沖液。 3.電泳 (1)概念:帶電粒子在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過程。 (2)原理:許多重要的生物大分子,如多肽、核酸等都具有可解離的基團(tuán),在一定pH下,這些基團(tuán)會(huì)帶上正電或負(fù)電。在電場(chǎng)的作用下,這些帶電分子會(huì)向著與所帶電荷相反的電極移動(dòng)。電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小、形狀的不同,使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度,從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。,目標(biāo)導(dǎo)航,預(yù)習(xí)導(dǎo)引,一,二,三,(3)分類:瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳。 在測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量時(shí)通常使用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶凈電荷的多少以及分子的大小等因素。而在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中,SDS能使蛋白質(zhì)發(fā)生完全變性,由幾條肽鏈組成的蛋白質(zhì)復(fù)合體在SDS的作用下會(huì)解聚成單條肽鏈,因此測(cè)定的結(jié)果只是單條肽鏈的相對(duì)分子質(zhì)量。同時(shí)SDS所帶的大量負(fù)電荷大大超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量,因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間的電荷差別,使電泳遷移率完全取決于分子的大小。,目標(biāo)導(dǎo)航,預(yù)習(xí)導(dǎo)引,一,二,三,二、蛋白質(zhì)的提取和分離 蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步:樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。 1.樣品處理及粗分離 血液由血漿和各種血細(xì)胞組成,其中紅細(xì)胞最多。在紅細(xì)胞的組成中,除水分以外,約90%是血紅蛋白。血紅蛋白由四條肽鏈組成,包括兩條-肽鏈和兩條-肽鏈。其中每條肽鏈環(huán)繞一個(gè)亞鐵血紅素基團(tuán),此基團(tuán)可攜帶一分子氧或一分子二氧化碳。血紅蛋白因含有血紅素而呈現(xiàn)紅色。,目標(biāo)導(dǎo)航,預(yù)習(xí)導(dǎo)引,一,二,三,(1)紅細(xì)胞的洗滌 目的:去除雜蛋白。 方法:采用低速短時(shí)間離心,如500 r/min離心 2 min。 (2)血紅蛋白的釋放,目標(biāo)導(dǎo)航,預(yù)習(xí)導(dǎo)引,一,二,三,(3)分離血紅蛋白溶液:將攪拌好的混合液離心后可觀察到試管中溶液分為4層(從上往下)。 第1層:無色透明的甲苯層。 第2層:脂溶性物質(zhì)的沉淀層白色薄層固體。 第3層:血紅蛋白的水溶液紅色透明液體。 第4層:其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀物。 將液體用濾紙過濾,除去脂溶性沉淀層,于分液漏斗中靜置片刻后,分出下層的紅色透明液體。 (4)透析:取1 mL的血紅蛋白溶液裝入透析袋中,將其放入盛有300 mL的物質(zhì)的量濃度為20 mmol/L的磷酸緩沖液中(pH為7.0),透析12 h。 透析袋一般是用硝酸纖維素(又稱玻璃紙)制成的,能使小分子自由進(jìn)出,而將大分子保留在袋內(nèi)。透析可以去除樣品中相對(duì)分子質(zhì)量較小的雜質(zhì),或用于更換樣品的緩沖液。,目標(biāo)導(dǎo)航,預(yù)習(xí)導(dǎo)引,一,二,三,2.純化凝膠色譜操作 處理后的樣品還含有其他種類的蛋白質(zhì)分子(如呼吸酶等),因此要將雜蛋白與血紅蛋白進(jìn)行分離。 第一步要制作凝膠色譜柱。第二步要裝填凝膠色譜柱,因?yàn)楦傻哪z和用緩沖液平衡好的凝膠的體積差別很大,所以裝柱前需要根據(jù)色譜柱的內(nèi)體積計(jì)算所需要的凝膠量。在裝填凝膠柱時(shí),不能有氣泡存在。第三步是樣品的加入和洗脫。 3.純度鑒定SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 判斷純化的蛋白質(zhì)是否達(dá)到要求,需要進(jìn)行蛋白質(zhì)純度的鑒定。鑒定方法中使用最多的是SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。,目標(biāo)導(dǎo)航,預(yù)習(xí)導(dǎo)引,一,二,三,三、注意事項(xiàng) 1.紅細(xì)胞的洗滌 洗滌次數(shù)、離心速度與離心時(shí)間十分重要。洗滌次數(shù)過少,無法除去血漿蛋白;離心速度過高和時(shí)間過長會(huì)使白細(xì)胞等一同沉淀,達(dá)不到分離的效果,影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。 2.色譜柱填料的處理 商品凝膠是干燥的顆粒,使用前需直接放在洗脫液中膨脹。為了加速膨脹,可以將加入洗脫液的濕凝膠用沸水浴加熱,逐漸升溫至接近沸騰。這種方法不僅節(jié)約時(shí)間,還能除去凝膠中可能帶有的微生物,排除膠粒內(nèi)的空氣。,目標(biāo)導(dǎo)航,預(yù)習(xí)導(dǎo)引,一,二,三,3.凝膠色譜柱的裝填 裝填凝膠時(shí)要盡量緊密,從而降低顆粒之間的空隙。不能有氣泡存在,因?yàn)闅馀輹?huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序,降低分離效果。洗脫液不能流干,露出凝膠顆粒,否則需重新裝填。 4.蛋白質(zhì)的分離 分離過程中,仔細(xì)觀察紅色區(qū)帶在洗脫過程中的移動(dòng)情況。如果色譜柱裝填成功、分離操作正確,能清楚地看到紅色區(qū)帶狹窄、平整、均勻一致地隨著洗脫液緩慢移動(dòng);如果紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬,說明分離效果不好,與凝膠色譜柱的裝填有關(guān)。,知識(shí)梳理,典例透析,一,二,三,四,一、血紅蛋白提取和分離的過程 血紅蛋白提取和分離的程序可分為四大步,分別是樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。首先通過洗滌紅細(xì)胞、血紅蛋白的釋放、離心等操作收集到血紅蛋白溶液,即樣品的處理;再經(jīng)過透析去除相對(duì)分子質(zhì)量較小的雜質(zhì),即樣品的粗分離;然后通過凝膠色譜法將相對(duì)分子質(zhì)量較大的雜質(zhì)蛋白除去,即樣品的純化;最后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行純度鑒定。,知識(shí)梳理,典例透析,一,二,三,四,二、緩沖溶液 在一定范圍內(nèi),能對(duì)抗少量外來強(qiáng)酸、強(qiáng)堿或具有稍加稀釋不引起溶液pH發(fā)生明顯變化的作用叫做緩沖作用,具有緩沖作用的溶液叫做緩沖溶液。緩沖溶液通常是由一種或兩種化合物(緩沖劑)溶解于水中制得的,調(diào)節(jié)緩沖劑的使用比例就可制得在不同pH范圍內(nèi)使用的緩沖液。緩沖溶液的作用是維持反應(yīng)體系的pH基本不變。在生物體內(nèi)進(jìn)行的各種生物化學(xué)反應(yīng)過程都是在一定的pH下進(jìn)行的,受到氫離子濃度的嚴(yán)格調(diào)控。為了能夠在實(shí)驗(yàn)室條件下準(zhǔn)確地模擬生物體內(nèi)的過程,就必須保持體外溶液的pH與體內(nèi)環(huán)境的pH基本一致。,知識(shí)梳理,典例透析,一,二,三,四,三、兩種電泳方法的比較,知識(shí)梳理,典例透析,一,二,三,四,四、用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量 使用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量時(shí),可選用一組已知相對(duì)分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白同時(shí)進(jìn)行電泳,根據(jù)已知相對(duì)分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白的電泳區(qū)帶位置,用電泳遷移率和相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)作標(biāo)準(zhǔn)曲線,可以測(cè)定未知蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量。,知識(shí)梳理,典例透析,題型一,題型二,題型三,題型一 凝膠色譜法的原理與操作 【例題1】 利用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)時(shí),什么樣的蛋白質(zhì)先洗脫出來? ( ) A.相對(duì)分子質(zhì)量較大的 B.溶解度高的 C.相對(duì)分子質(zhì)量較小的 D.所帶電荷多的 解析:相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)能進(jìn)入凝膠內(nèi)部通道,路程較長,移動(dòng)速度較慢;相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì),路程較短,移動(dòng)速度較快,首先洗脫出來。 答案:A 反思領(lǐng)悟凝膠色譜法是根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的有效方法。,典例透析,題型一,題型二,題型三,知識(shí)梳理,題型二 電泳技術(shù)的原理與操作 【例題2】 下列關(guān)于電泳的說法,不正確的是( ) A.電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過程 B.帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng) C.蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶凈電荷的多少 D.用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,蛋白質(zhì)的電泳遷移率完全取決于分子的大小 解析:蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶凈電荷的多少以及分子的大小等因素。SDS能與各種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物,SDS 所帶負(fù)電荷的量大大超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量,因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間的電荷差異,使SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中蛋白質(zhì)的電泳遷移率完全取決于分子的大小。 答案:C,典例透析,題型一,題型二,題型三,知識(shí)梳理,反思領(lǐng)悟電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小、形狀的不同,使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度,從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。,典例透析,題型一,題型二,題型三,知識(shí)梳理,題型三 蛋白質(zhì)的提取和分離 【例題3】 以下關(guān)于豬血紅蛋白提純的描述,不正確的是 ( ) A.洗滌紅細(xì)胞時(shí),使用生理鹽水可防止紅細(xì)胞破裂 B.豬成熟紅細(xì)胞中沒有細(xì)胞器和細(xì)胞核,提純時(shí)雜蛋白較少 C.血紅蛋白的顏色可用于凝膠色譜法分離過程的監(jiān)測(cè) D.在凝膠色譜法分離過程中,血紅蛋白比相對(duì)分子質(zhì)量較小的雜蛋白移動(dòng)慢 解析:大分子物質(zhì)由于分子直徑較大,不易進(jìn)入凝膠顆粒的微孔,而只能分布于顆粒之間,所以在洗脫時(shí)向下移動(dòng)的速度較快,相反,相對(duì)分子質(zhì)量較小的物質(zhì)向下移動(dòng)速度較慢。 答案:D,