專題 5 DNA和蛋白質(zhì)技術(shù) 高頻考點(diǎn)突破 專 題 5 D N A 和 蛋 白 質(zhì) 技 術(shù) 基礎(chǔ)自主梳理 命題視角剖析 即時(shí)達(dá)標(biāo)訓(xùn)練 基礎(chǔ)自主梳理 一、血紅蛋白的提取和分離 1凝膠色譜法：也稱 _，是根據(jù) 相對(duì)分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的有效方法。 2電泳 (1)概念：電泳是指 _在電場(chǎng)的作用下 發(fā)生遷移的過(guò)程。 (2)特點(diǎn)：電泳利用待分離樣品中各種分子 _的差異以及分子本身的大小、 _的 不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而 實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。 分配色譜法 帶電粒子 帶電性質(zhì) 形狀 3實(shí)驗(yàn)操作 (1)樣品處理：通過(guò)紅細(xì)胞的洗滌、攪拌、離 心等操作收集到血紅蛋白溶液。 (2)粗分離：通過(guò)透析去除血紅蛋白溶液中的 _較小的雜質(zhì)。 (3)純化：通過(guò) _分離相對(duì)分子 質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)。 (4)純度鑒定：用 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn) 行樣品純度鑒定。 相對(duì)分子質(zhì)量 凝膠色譜法 二、 PCR技術(shù)擴(kuò)增 DNA片段 1 PCR技術(shù) (1)PCR： _的簡(jiǎn)稱，是一種體 外迅速擴(kuò)增 _的技術(shù)。 (2)擴(kuò)增方向：總是從子鏈的 5端向 _端延伸。 (3)引物特點(diǎn)：是一小段 _或 DNA，能與 DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)，用于 PCR 的引物長(zhǎng)度通常為 _個(gè)核苷酸。 (4)原理： DNA復(fù)制原理。 (5)條件： DNA模板、分別與兩條模板鏈相結(jié)合 的兩種 _，四種脫氧核苷酸、耐熱的 _，同時(shí)控制溫度。 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) DNA片段 3 RNA 20 30 引物 DNA聚合酶 2過(guò)程 (1)變性：當(dāng)溫度上升到 _以上時(shí)，雙鏈 DNA解旋為單鏈。 (2)復(fù)性：溫度下降為 50 左右時(shí)，兩種 _通 過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與 _結(jié)合。 (3)延伸：當(dāng)溫度上升到 72 左右時(shí)，四種脫氧核 苷酸在 _的作用下，根據(jù) _ 原則合成新的 DNA鏈。 3結(jié)果： DNA聚合酶只能特異性地復(fù)制處于 _序列，使這段固定長(zhǎng)度的序 列呈 _擴(kuò)增。 90 引物 兩條單鏈 DNA DNA聚合酶 堿基互補(bǔ)配對(duì) 兩個(gè)引物之間的 DNA 指數(shù) 高頻考點(diǎn)突破 DNA的粗提取與鑒定 1基本原理 (1)血細(xì)胞在蒸餾水中易吸水而導(dǎo)致細(xì)胞膜和 核膜的破裂，據(jù)此可得含核 DNA的溶液。 (2)DNA在不同濃度的 NaCl溶液中溶解度不 同，在 0.14 mol/L的 NaCl溶液中溶解度最低。 (3)DNA不溶于酒精溶液；不被蛋白酶所水 解；可被二苯胺染成藍(lán)色。 科目一考試網(wǎng) http:/ 科目一模 擬考試 2016 金手指駕校網(wǎng) http:/ 金手指駕駛員考試 2016 2方法目的 方法 目的 溶于 NaCl溶 液中并稀釋 (1)NaCl溶液物質(zhì)的量濃度為 2 mol/L時(shí)， DNA溶解，而部分蛋白質(zhì)發(fā)生鹽析而生成 沉淀，通過(guò)過(guò)濾可除去部分蛋白質(zhì)及不溶 于 NaCl溶液的雜質(zhì) (2)當(dāng) NaCl溶液稀釋至 0.14 mol/L時(shí)， DNA 析出，過(guò)濾可除去溶于 NaCl溶液的部分蛋 白質(zhì)和其他雜質(zhì) 加入嫩肉粉 嫩肉粉中含木瓜蛋白酶，水解蛋白質(zhì) 加入冷卻酒精 (95%) DNA析出，除去溶于酒精的蛋白質(zhì) 加入二苯胺， 并沸水浴 鑒定 DNA (1)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中兩次用到蒸餾水，第一次目的是 使成熟的雞血細(xì)胞漲破釋放出 DNA，第二次目 的是稀釋 NaCl溶液，使 DNA從溶液中析出。 (2)預(yù)冷的酒精溶液具有以下優(yōu)點(diǎn) 抑制核酸水解酶活性，防止 DNA降解。 降低分子運(yùn)動(dòng)易于形成沉淀析出。 低溫有利于增加 DNA分子柔韌性，減少斷裂。 【 易誤警示 】 本實(shí)驗(yàn)用雞血細(xì)胞作實(shí)驗(yàn)材料， 不能用哺乳動(dòng)物的成熟紅細(xì)胞，原因是哺乳動(dòng)物 的成熟紅細(xì)胞內(nèi)無(wú)細(xì)胞核，但它可以作為血紅蛋 白提取和制備細(xì)胞膜的理想材料。 即時(shí)應(yīng)用 (隨學(xué)隨練，輕松奪冠 ) 1在 “DNA的粗提取與鑒定 ”實(shí)驗(yàn)中，將提取獲 得的 DNA的黏稠物 (還含有許多雜質(zhì) )分別處理如 下： 第一，放入 0.14 mol/L的 NaCl溶液中，攪拌后過(guò) 濾，得濾液 A和黏稠物 a。 第二，放入 2 mol/L的 NaCl溶液中，攪拌后過(guò)濾， 得濾液 B和黏稠物 b。 第三，放入冷卻的 95%的酒精溶液中，攪拌后過(guò) 濾，得濾液 C和黏稠物 c。 以上過(guò)程獲得的濾液和黏稠物中，因含 DNA少 而可以丟棄的是 _。 解析： 在不同濃度的 NaCl溶液中， DNA的 溶解度不同。在 0.14 mol/L的 NaCl溶液中 DNA溶解度最小， DNA析出，呈絲狀物， 過(guò)濾后存在于黏稠物 a中；在 2 mol/L的 NaCl 溶液中 DNA溶解度最大，所以 DNA溶解， 過(guò)濾后存在于濾液 B中；酒精可使 DNA分子 凝集，因此，在冷卻的 95%的酒精溶液中 DNA凝集，呈絲狀物，過(guò)濾后存在于黏稠物 c中。 答案： A、 b、 C 比較細(xì)胞內(nèi) DNA復(fù)制與體外 DNA擴(kuò)增 (PCR) 【 拓展深化 】 引物是指能夠與 DNA母鏈 的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)的一小段 DNA或 RNA。 DNA聚合酶只能特異地復(fù)制處于兩個(gè)引物 之間的 DNA序列，使這段固定長(zhǎng)度的序列呈 指數(shù)擴(kuò)增。 即時(shí)應(yīng)用 (隨學(xué)隨練，輕松奪冠 ) 2 PCR利用了 DNA熱變性的原理， PCR儀實(shí)際 上也是一種能自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器。對(duì) PCR過(guò) 程中 “溫度的控制 ”的下列說(shuō)法錯(cuò)誤的是 ( ) A酶促反應(yīng)需要高的溫度，是為了確保模板的 單鏈 B延伸的溫度必須大于復(fù)性溫度，而小于變性 溫度 C DNA聚合酶不能熱變性，要用耐高溫的聚 合酶 D DNA解旋酶不能熱變性，為了確保模板是 單鏈 解析： 選 D。 PCR是一種體外 DNA擴(kuò)增技術(shù)。 DNA雙鏈的解開不需要解旋酶，靠高溫使其 變性，雙螺旋結(jié)構(gòu)解體，雙鏈分開；復(fù)性前， 在耐高溫的 DNA聚合酶的作用下根據(jù)堿基互 補(bǔ)配對(duì)原則合成新的 DNA，因此延伸的溫度 要大于復(fù)性溫度，小于變性溫度。 血紅蛋白的提取和分離 1方法及原理 方法 原理 凝膠色譜 法 根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的大小分離蛋 白質(zhì) 電泳法 各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分 子本身大小、形狀的不同來(lái)分離 蛋白質(zhì)。 2.實(shí)驗(yàn)操作程序 (1)樣品處理 紅細(xì)胞的洗滌：除去雜蛋白，以利于后續(xù) 步驟的分離純化； 血紅蛋白的釋放：使紅細(xì)胞破裂，血紅蛋 白釋放出來(lái)； 分離血紅蛋白溶液：經(jīng)過(guò)離心使血紅蛋白 和其他雜質(zhì)分離開來(lái)，便于下一步對(duì)血紅蛋 白的純化。 (2)粗分離 透析：除去樣品中相對(duì)分子質(zhì)量 較小的雜質(zhì)。 (3)純化：一般采用凝膠色譜法對(duì)血紅蛋白進(jìn)行 分離和純化。 (4)純度鑒定：一般用 SDS聚丙烯酰胺凝膠電 泳法來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量，即對(duì)血紅蛋白進(jìn) 行純度鑒定。 【 易誤警示 】 相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)通 過(guò)凝膠時(shí)，相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)容易進(jìn) 入凝膠內(nèi)部的通道，而相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋 白質(zhì)只能在凝膠外部移動(dòng)，因此蛋白質(zhì)分子彼 此分離。 即時(shí)應(yīng)用 (隨學(xué)隨練，輕松奪冠 ) 3在血紅蛋白的整個(gè)提取過(guò)程中，不斷用磷酸 緩沖液處理的目的是 (多選 )( ) A防止血紅蛋白被氧氣氧化 B血紅蛋白是一種堿性物質(zhì)，需要酸中和 C防止色譜柱內(nèi)產(chǎn)生氣泡，影響洗脫效果 D讓血紅蛋白處在穩(wěn)定的 pH范圍內(nèi)，維持其結(jié) 構(gòu)和功能 解析： 選 CD。在血紅蛋白的提取過(guò)程中，不斷 用磷酸緩沖液處理的目的是防止色譜柱內(nèi)產(chǎn)生氣 泡，影響洗脫效果，同時(shí)為了讓血紅蛋白保持在 體內(nèi)所處的環(huán)境，以維持其結(jié)構(gòu)和功能。 命題視角剖析 緊扣教材重點(diǎn) PCR原理及過(guò)程 PCR是一種體外迅速擴(kuò)增 DNA片段的 方法，用于放大特定的 DNA片段，數(shù)小時(shí)內(nèi)可 使目的基因片段擴(kuò)增到數(shù)百萬(wàn)個(gè)拷貝的分子生 物學(xué)技術(shù)。 PCR需要模板 DNA、引物、脫氧核 糖核苷酸和 DNA聚合酶等條件。下圖為模板 DNA分子及 2種引物，請(qǐng)回答相關(guān)問(wèn)題： 例 1 (1)PCR的全稱是 _。 PCR與體內(nèi) DNA復(fù)制 的不同之處主要表現(xiàn)在溫度環(huán)境的不同，在 PCR 中先用 95 高溫處理的目的是 _； 而這一過(guò)程中在細(xì)胞內(nèi)是通過(guò) _實(shí)現(xiàn)的。 (2)在 PCR技術(shù)中所需要的引物實(shí)質(zhì)上是一種 _。請(qǐng)?jiān)趫D中繪出引物結(jié) 合的位置。 (3)若將 1個(gè) DNA分子拷貝 10次，則需要在緩沖液 中至少加入 _個(gè)引物。 (4)DNA子鏈復(fù)制的方向是 _，這 是由于 _。 【 嘗試解答 】 (1)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 使 DNA變 性 (使 DNA的兩條鏈解開 ) 解旋酶的催化 (2)單鏈 DNA或 RNA分子，見右 圖 (3)(211 2) (4)5到 3 DNA聚合酶只能從引物 的 3端拼接單個(gè)脫氧核苷酸分子 【 解析 】 本題考查考生對(duì) PCR技術(shù)的理解，屬 于知識(shí)識(shí)記和理解層次的考查，符合高考對(duì)選修 內(nèi)容考查的特點(diǎn)。 PCR技術(shù)又稱多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)， 在 PCR中先用 95 高溫處理的目的是使 DNA分子 中的氫鍵斷裂，兩條鏈解開，即使 DNA分子變性。 引物是一種單鏈 DNA或 RNA分子，它能與解開的 DNA母鏈的 3端結(jié)合，為 DNA聚合酶提供吸附位 點(diǎn)，使 DNA聚合酶從引物的 3端開始連接脫氧核 苷酸，從而決定了 DNA子鏈復(fù)制的方向是 5到 3。 在 DNA分子擴(kuò)增時(shí)，需要 2種引物，由于新合成的 子鏈都需要引物作為復(fù)制的起點(diǎn)，故所需的引物 數(shù)目等于新合成的 DNA子鏈數(shù)目，即 (2 210 2) (211 2)個(gè)。 洞察高考熱點(diǎn) DNA的粗提取 (2010年高考江蘇卷 )某生物興趣小組開展 DNA粗提取的相關(guān)探究活動(dòng)，具體步驟如下： 材料處理：稱取新鮮的花菜、辣椒和蒜黃各 2份， 每份 10 g。 剪碎后分成兩組，一組置于 20 、另一組置于 20 條件下保存 24 h。 DNA粗提取： 第一步：將上述材料分別放入研缽中，各加入 15 mL研磨液，充分研磨。用兩層紗布過(guò)濾，取濾 液備用。 例 2 第二步：先向 6只小燒杯中分別注入 10 mL濾液， 再加入 20 mL體積分?jǐn)?shù)為 95%的冷酒精溶液，然 后用玻璃棒緩緩地向一個(gè)方向攪拌，使絮狀物 纏繞在玻璃棒上。 第三步：取 6支試管，分別加入等量的 2 mol/L NaCl溶液溶解上述絮狀物。 DNA檢測(cè)：在上述試管中各加入 4 mL二苯胺試 劑，混合均勻后，置于沸水中加熱 5 min，待試 管冷卻后比較溶液的顏色深淺，結(jié)果如下表。 材料保存溫度 花菜 辣椒 蒜黃 20 20 (注： “ ”越多表示藍(lán)色越深 ) 分析上述實(shí)驗(yàn)過(guò)程，回答下列問(wèn)題： (1)該探究性實(shí)驗(yàn)課題名稱是 _ _。 (2)第二步中 “緩緩地 ”攪拌，這是為了減少 _。 【 嘗試解答 】 (1)探究不同材料和不同保存溫度 對(duì) DNA提取量的影響 (2)DNA斷裂 (3) 等質(zhì)量的不同實(shí)驗(yàn)材料，在相同的保存溫度 下，從蒜黃提取的 DNA量最多 低溫抑制了相 關(guān)酶的活性， DNA降解速度慢 (4)將第三步獲得的溶液與等量的氯仿充分混和， 靜置一段時(shí)間，吸取上清液 突破易錯(cuò)疑點(diǎn) 對(duì) DNA粗提取與血紅蛋白提取易于混淆 提取物質(zhì) DNA 血紅蛋白 提取方法 鹽析法 凝膠色譜法、電泳法 提取原理 DNA在不同濃度的 NaCl溶液中溶解度不同 DNA不溶于酒精，但某 些蛋白質(zhì)則溶于酒精 根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量 的大小 各種分子帶電性質(zhì) 差異 步驟 溶解在 2 mol/L的 NaCl 溶液中 加水稀釋至 0.14 mol/L NaCl溶液使 DNA析出過(guò) 濾 加入冷卻酒精析出 樣品處理 粗提取 純化 純度鑒定 【 解析 】 將動(dòng)物細(xì)胞放在蒸餾水中，由于滲透 吸水，可使細(xì)胞膜破裂，從而釋放出細(xì)胞中的蛋 白質(zhì)和 DNA，因此 A選項(xiàng)正確。 DNA在 2 mol/L的 NaCl溶液中的溶解度最大，而蛋白質(zhì)在該濃度的 NaCl溶液中部分發(fā)生鹽析沉淀； DNA在 0.14 mol/L的 NaCl溶液中的溶解度最小，而蛋白質(zhì)在 該濃度的 NaCl溶液中溶解，所以 B選項(xiàng)正確。蛋 白質(zhì)純化過(guò)程中利用小分子雜質(zhì)能通過(guò)透析袋， 而大分子蛋白質(zhì)不能通過(guò)透析袋的特點(diǎn)，從而對(duì) 蛋白質(zhì)進(jìn)行粗純化，所以 C選項(xiàng)正確。血紅蛋白 除可用凝膠色譜法進(jìn)行純化外，也可用電泳法進(jìn) 行純化，所以 D選項(xiàng)錯(cuò)誤。