維生素 B2與發(fā)酵 第六組 維生素 B2的概述 一、結構與性質 維生素 B2又叫核黃素 (riboflavin)。 是核醇與 6.7一二甲基異咯嗪的縮合物。 核黃素味苦，在 240 時變暗色，熔 點為 275 282 ，并在此溫度下引起 破壞。 性質 核黃素為橙黃色結晶化合物，溶于水， 但溶解度很低，水溶液呈現黃綠色熒光 核黃素對熱安定， 120 加熱 6小時，僅 有少量分解，在堿性溶液中較易破壞，在 光照及紫外線照射下，可以引起不可逆分 解 結構 核黃素的異咯嗪上第 1位及第 10位 N原子與活 潑的雙鍵相連，能接受氫而被還原成無色 產物，還原后很容易再脫氫，因此具有可 逆的氧化還原特性 化學結構式 二、維生素 B2的作用 與組織的呼吸過程有關 參與碳水化物的中間代謝 與激素有關 促進色氨酸轉化為煙酸 ， VB6轉變?yōu)榱姿徇?哆醛 維持體內還原型谷胱甘肽的濃度 ， 參與體 內的抗氧化防御系統(tǒng) 參與藥物代謝 提高機體對環(huán)境的適應能力 三、維生素 B2的發(fā)酵原理 目前核黃素的工業(yè)化生產主要有微 生物發(fā)酵法和化學半合成法兩種 , 其中微生物發(fā)酵法以 生產工藝簡單、 原料廉價、環(huán)境友好以及資源可再 生 等優(yōu)點而倍受世界核黃素生產商 的青睞。 (一 )化學合成法制備維生素 B2 將 D-核糖與 3， 4-二甲基苯胺縮合，在氫化還原得 一仲胺此仲胺與苯氯化重氮化物反應，生成一種 偶氮染料化合物 3， 4二甲基 -6-苯偶氮 -D 核 糖胺最后與巴比妥酸在乙酸存在下縮合即可得到 維生素 B2。此維生素 B2的生產工藝生產 B2的產 率可達 95.3%，純度達 96.8%。其中合成所用的 D-核糖目前是以 D-葡萄糖為原料，經芽孢桿菌屬 細菌發(fā)酵而成的，它代替了原先用 D-葡萄糖經 4步 反應合成 D-核糖的方法。因為后者需要用到鈉汞 齊，從而帶來了很嚴重的環(huán)境污染問題?；瘜W法 合成維生素 B2可以利用傳統(tǒng)的分批反應的設備， 但在純化精制階段，偶氮燃料中間物和維生素 B2 均會生成細小晶體，給有效地過濾和洗滌帶來了 較大的困難。同時由于這 2種化合物的顏色都比較 深，也使工廠的車間管理較困難。 （二）微生物法合成維生素 B2 維生素 B2的微生物發(fā)酵生產采用三級發(fā)酵 法。將在 25 培養(yǎng)成熟的維生素 B2產生菌 的斜面孢子用無菌水制成孢子懸浮液，接 種于種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)（ 30+ ）， 3040h），最后將二級發(fā)酵液移種至三級 發(fā)酵罐發(fā)酵（ 30+ ， 160h），得到維生素 B2發(fā)酵液。工業(yè)上使用的維生素 B2的產生 菌主要有 阿氏假囊酵母 （ Eremotecium ashbyii）和 棉病囊菌 （ Ashbya gossypii） 2 種菌。經過菌種改良后，維生素 B2生產的 最高水平可達到 10000U/ml。產品質量好， 成本低。 生產菌種 核黃素發(fā)酵的主要 生產菌 包括 : 棉囊阿舒氏酵母 A shbya gossyp ii 解朊假絲酵母 Candida famata 阿舒氏假囊酵 Eremothecium ashbyii 釀酒酵 Saccharomyces sp 枯草芽孢桿菌 Bacillus subtilis 產氨棒狀桿菌 Corynebactiaaminogensis 然而在利用棉囊阿舒氏酵母、解朊 假絲酵母和阿舒氏假囊酵母等真菌 進行核黃素生產時 , 存在著 發(fā)酵周 期過長 、 原料成分配比復雜 、 需加 入不飽和脂肪酸來促進核黃素的產 量 等缺點。 隨著基因工程技術的發(fā)展 , 枯草芽 孢桿菌和產氨棒狀桿菌等產核黃素 工程菌相繼構建成功 , 這些工程菌 具有 發(fā)酵周期短 ( 2 3天 ) 、 原料 要求簡單 、 產量高等優(yōu)點 , 在核黃 素的微生物發(fā)酵生產中顯示了強大 的生命力 四、發(fā)酵過程 第一步 ，菌種選取 。 隨著分子生物 學技術的發(fā)展，基因工程手段已經應 用于核黃素生產菌種育種中，這樣選 出來的菌種具有 產量高、能耗低（主 要指培養(yǎng)菌種所需的營養(yǎng)物質）、產 品純度高 等有點，顯著提高了經濟效 益。 第二步 ，發(fā)酵方法的選取。 核黃素 微生物發(fā)酵法包括 液體深層發(fā)酵法 和 固體發(fā)酵法 （液體和固體主要是指培 養(yǎng)菌種的培養(yǎng)基狀態(tài)的不同：即培養(yǎng) 基可以是液態(tài)的，也可以是固態(tài)的）。 這里需要指出的是，固體發(fā)酵工藝 比液體發(fā)酵 操作簡單方便，生產規(guī) ?？纱罂尚?，特別是固體發(fā)酵的設 備比液體發(fā)酵降低 80%成本以上， 同時能大大減少能源的消耗，便于 推廣和應用。 第三步 ，核黃素的提取。 即從發(fā)酵 液中將核黃素提取出來。主要的提取 方法有： 重金屬鹽沉淀法，酸溶液法 和堿溶液法。 科學研究表明，堿溶液 法提取核黃素不僅 收益高， 且 耗能低 ， 隨著離心分離設備的不斷改進，堿溶 液法分離提取核黃素的優(yōu)越性越來越 明顯。 第四步 ，核黃素的測定。 是對發(fā)酵 液中核黃素含量、質量的測定。測定 的方法有： 微生物法、熒光比色法、 高效液相色譜技術（ HPLC） ,核黃素 化學發(fā)光新方法等。 目前核黃素化學 發(fā)光新方法的精確度和靈敏度高、分 析速度快，具有廣泛的應用前景。 第五步 ，核黃素顆粒的制備。 微生 物發(fā)酵生產的核黃素需要干燥才能制 成核黃素成品。常用的干燥方法： 普 通氣流干燥法和噴霧干燥法。 六、微生物發(fā)酵的缺點 與化學合成法相比 , 微生物發(fā)酵法 也存在著某些缺點和不足。例如在 核黃素的后期加工與處理過程中 , 核黃素的分離純化比較困難 , 難以 獲得高純度的核黃素。 七、發(fā)酵中的注意事項 整個過程應必須嚴格控制無菌環(huán)境，抗生 素的加入要在溫度不太高時（不 燙手為止 ） 加入，防止抗生素失活。 發(fā)酵罐在使用之前一定要清洗干凈，不能 留有任何殘渣， 特別要注意一些管道和死 角的殘留物質的清洗 ，避免染菌。 發(fā)酵罐與培養(yǎng)基滅菌時要分開滅， 葡萄糖 單獨滅菌，另外磷酸鹽也要單獨滅菌 ，因 為磷酸鹽容易和培養(yǎng)基中其他無機鹽在高 溫下反應生成一些難溶化合物沉淀后不易 被菌體分解利用，影響培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分， 造成菌種在前期生長過程中表現緩慢和營 養(yǎng)不良狀況。 用發(fā)酵罐進行高溫滅菌時要注意 夾套里是 否注水 ，否則會嚴重損壞發(fā)酵罐。 發(fā)酵過程中要嚴密注意 PH的變化 。 溶氧的大小 能直接反應發(fā)酵罐內殘?zhí)堑睦?用情況。 發(fā)酵后期需要 加壓 來維持氧濃度。