乙肝疫苗的制備組員：一班 房天宇 李樺楠 二班 李耀 友情提示此文檔在網(wǎng)頁中無法完全展示，請免費(fèi)下載后閱讀 乙型病毒性肝炎 乙型病毒性肝炎是由乙肝病毒（HBV）引起的、以肝臟炎性病變?yōu)橹?，并可引起多器官損害的一種疾病。乙肝廣泛流行于世界各國，主要侵犯兒童及青壯年，少數(shù)患者可轉(zhuǎn)化為肝硬化或肝癌。因此，它已成為嚴(yán)重威脅人類健康的世界性疾病，也是我國當(dāng)前流行最為廣泛、危害性最嚴(yán)重的一種疾病。乙型病毒性肝炎無一定的流行期，一年四季均可發(fā)病，但多屬散發(fā)。近年來乙肝發(fā)病率呈明顯增高的趨勢。 乙肝疫苗的應(yīng)用是預(yù)防和控制乙型肝炎的根本措施。 乙肝疫苗的概念 乙肝疫苗是用于預(yù)防乙肝的特殊藥物。疫苗接種后，可刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生保護(hù)性抗體，這種抗體存在于人的體液之中，乙肝病毒一旦出現(xiàn)，抗體會立即作用，將其清除，阻止感染，并不會傷害肝臟，從而使人體具有了預(yù)防乙肝的免疫力，從而達(dá)到預(yù)防乙肝感染的目的。接種乙肝疫苗是預(yù)防乙肝病毒感染的最有效方法。 乙肝疫苗的發(fā)展史 乙肝疫苗形成于1986年，為了得到乙肝疫苗，研究人員從研究復(fù)試病毒，到酵母，并研究純化的蛋白質(zhì)序列。并經(jīng)過了大量的誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。 1991年，疫苗被應(yīng)用于高危險人群。主要是一些兒童，因為兒童的感染率極高。 2005年，美國推行常規(guī)的疫苗注射。給所有未注射過乙肝疫苗的兒童注射。治療性疫苗是指在已感染病原微生物或已患有某些疾病的機(jī)體中，通過誘導(dǎo)特異性的免疫應(yīng)答，達(dá)到治療或防止疾病惡化的天然、人工合成或用基因重組技術(shù)表達(dá)的產(chǎn)品或制品 疫苗的組成疫 苗 的 組 成 抗 原免 疫 佐 劑 乙肝疫苗的制備 目前使用的乙肝疫苗是基因工程疫苗-重組酵母乙肝疫苗和重組CHO乙肝疫苗，其主要成分是乙肝病毒的表面抗原，即一種乙肝病毒外衣殼蛋白，并非完整病毒。這種表面抗原不含有病毒遺傳物質(zhì)，不具備感染性和致病性，但保留了免疫原性，即刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體的能力。 乙肝表面抗原曾經(jīng)是從乙肝病毒攜帶者的血液，經(jīng)純化滅活等嚴(yán)格工序制備而來，即血源性疫苗，該疫苗由于安全、來源和成本等原因已被淘汰(如，有引起血源性疾病的嫌疑和浪費(fèi)大量的血） 基因工程乙肝疫苗是采用基因工程技術(shù)生產(chǎn)的，即構(gòu)建含有乙肝表面抗原基因的重組質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)染相應(yīng)的宿主細(xì)胞，如酵母、CHO細(xì)胞，生產(chǎn)乙肝表面抗原蛋白。利用重組酵母生產(chǎn)的叫重組酵母乙肝疫苗，利用CHO細(xì)胞生產(chǎn)的叫重組CHO乙肝疫苗，劑量為每支5微克。它們都可以用于預(yù)防所有已知亞型的乙肝病毒感，都可以放心選用。 乙 肝 病 毒 病 理 切 片 目 的 基 因 的 分 離 培 養(yǎng) 酵 母 細(xì)胞 （ 增 ）檢 測 正 確 表 達(dá) 目 的 產(chǎn) 物的 酵 母 （ 檢 ） 0.0重組酵母構(gòu)建重 組 質(zhì) 粒 的 構(gòu)建 （ 切 ， 接 ） 導(dǎo) 入 酵 母 細(xì)胞 （ 轉(zhuǎn) ） 轉(zhuǎn) 細(xì) 胞 轉(zhuǎn) 化 手 段 將 DNA重 組 分 子 導(dǎo) 入 酵 母 細(xì) 胞內(nèi) 。 增短 時 間 培 養(yǎng) 轉(zhuǎn) 化 酵母 細(xì) 胞 ， 以 擴(kuò) DNA重 組 分 子 。檢 檢接用 DNA連 接 酶 將 含 有 外源 基 因 的 DNA片 段 連 接到 質(zhì) 粒 分 子 上 ， 構(gòu) 成DNA重 組 分 子 。根 據(jù) 已 經(jīng) 測 定 的 編 碼 乙 肝 病毒 表 面 抗 原 決 定 簇 基 因 序 列 ，用 化 學(xué) 合 成 法 直 接 合 成 目 的基 因 。用 識 別 相 同 黏 性 末 端 的 限 制性 內(nèi) 切 酶 將 外 源 DNA和 質(zhì) 粒分 子 切 開 。 切篩 選 和 鑒 定 經(jīng) 轉(zhuǎn) 化 處 理的 酵 母 細(xì) 胞 ， 獲 得 外 源基 因 高 效 表 達(dá) 的 基 因 工程 菌 菌種制備和發(fā)酵用 成 功 構(gòu) 造 的 基 因 工 程 菌 進(jìn) 行 擴(kuò) 大 培 養(yǎng) ， 經(jīng) 過 逐 級 放 大 至 發(fā) 酵 罐 。發(fā) 酵 過 程 應(yīng) 該 具 有 下 列 特 點(diǎn) ：原 料 以 碳 水 化 合 物 為 主 ， 不 含 有 毒 物 質(zhì) ， 并 加 入 少 量 有 機(jī) 和 無 機(jī) 氮 源 ；能 容 易 進(jìn) 行 大 量 有 效 的 乙 肝 病 毒 表 面 抗 原 的 生 產(chǎn) ； 生 物 反 應(yīng) 過 程 是 以 生命 體 的 自 動 調(diào) 節(jié) 方 式 進(jìn) 行 的 ， 多 個 反 應(yīng) 像 一 個 反 應(yīng) 一 樣 ， 在 單 一 設(shè) 備 中進(jìn) 行 ； 生 產(chǎn) 過 程 中 ， 通 常 常 溫 進(jìn) 行 ， 操 作 溫 和 ， 不 考 慮 防 爆 問 題 ； 能 夠高 度 選 擇 性 的 進(jìn) 行 復(fù) 雜 化 合 物 在 特 定 部 分 的 反 應(yīng) ， 如 氧 化 、 還 原 、 官 能團(tuán) 導(dǎo) 入 ； 生 產(chǎn) 過 程 中 考 慮 防 止 雜 菌 的 污 染 。 發(fā) 酵 過 程 中 ， 可 采 用 分 批 補(bǔ) 料 或 連 續(xù) 流 加 補(bǔ) 料 以 保 證 最 優(yōu) 生 長 和 維 持 細(xì)胞 濃 度 、 生 長 速 度 和 營 養(yǎng) 供 應(yīng) 之 間 的 適 當(dāng) 平 衡 。 可 添 加 誘 導(dǎo) 劑 如 乳 糖 到 發(fā) 酵 液 中 去 以 誘 導(dǎo) 可 調(diào) 節(jié) 啟 動 子 的 表 達(dá) 。 分離純化 細(xì) 胞 破 碎微 濾超 濾 微 濾 超 濾 硅 膠 吸 附疏 水 層 析硫 氰 酸 鹽 處 理凝 膠 層 析離 子 交 換 層 析 無 菌 過 濾無 菌 過 濾 氫 氧 化 鋁 共 沉 淀 細(xì) 胞 破 碎 微 濾 超 濾 發(fā) 酵 結(jié) 束 后 ， 通 過 過 濾 或 離 心 ， 使 酵 母 與 發(fā) 酵液 分 離 ， 然 后 細(xì) 胞 通 過 高 壓 勻 漿 機(jī) 破 碎 ， 釋 放出 抗 原 。 酵 母 的 細(xì) 胞 壁 較 厚 ， 比 大 腸 桿 菌 難 破碎 ， 可 在 高 壓 勻 漿 機(jī) 內(nèi) 施 加 幾 千 個 大 氣 壓 力 ，通 過 針 形 閥 突 然 降 壓 到 零 ， 使 細(xì) 胞 破 碎 。 在 細(xì)胞 破 碎 前 加 入 蛋 白 酶 抑 制 劑 以 防 抗 原 被 分 解 。細(xì) 胞 破 碎 后 加 入 表 面 活 性 劑 使 抗 原 溶 解 。 粗細(xì) 胞 裂 解 物 用 0.2um中 空 纖 維 柱 進(jìn) 行 微 濾 。 抗原 和 大 部 分 低 分 子 量 宿 主 細(xì) 胞 內(nèi) 含 物 通 過 濾膜 ， 細(xì) 胞 碎 片 被 膜 攔 截 。濾 液 再 進(jìn) 行 超 濾 ， 此 時 抗 原 被 膜 攔 截 而 低 分子 量 宿 主 細(xì) 胞 內(nèi) 含 物 通 過 濾 膜 除 去 。 凝 膠 層 析離 子 交 換 層 析 凝膠層析分離原理 單個凝膠珠本身象個篩子。不同類型凝膠的篩孔的大小不同。如果將這樣的凝膠裝入一個足夠長的柱子中，作成一個凝膠柱。當(dāng)含有大小不同的蛋白質(zhì)樣品加到凝膠柱上時，比凝膠珠平均孔徑小的蛋白質(zhì)就要連續(xù)不斷地穿入珠子的內(nèi)部，這樣的小分子不但其運(yùn)動路程長，而且受到來自凝膠珠內(nèi)部的阻力也很大，所以越小的蛋白質(zhì)，把它們從柱子上洗脫下來所花費(fèi)的時間越長！凝膠中只有很少的孔徑可接受大的蛋白。因此，大的蛋白質(zhì)直接通過凝膠珠之間的縫隙首先被洗脫下來。凝膠過濾所用的凝膠孔徑大小的選擇主要取決于要純化的蛋白質(zhì)分子量。 凝膠層析分離原理示意圖 凝 膠 層 析離 子 交 換 層 析 離子交換層析原理 離子交換層析（Ion Exchange Chromatography簡稱為IEC）是以離子交換劑為固定相，依據(jù)流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時的結(jié)合力大小的差別而進(jìn)行分離的一種層析方法。 離子交換層析中，基質(zhì)是由帶有電荷的樹脂或纖維素組成。帶有正電荷的稱之陽離子交換樹脂；而帶有負(fù)電荷的稱之陰離子樹脂。由于蛋白質(zhì)也有等電點(diǎn)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于不同的pH條件下，其帶電狀況也不同。陰離子交換基質(zhì)結(jié)合帶有負(fù)電荷的蛋白質(zhì)，所以這類蛋白質(zhì)被留在柱子上，然后通過提高洗脫液中的鹽濃度等措施，將吸附在柱子上的蛋白質(zhì)洗脫下來。結(jié)合較弱的蛋白質(zhì)首先被洗脫下來。反之陽離子 交換基質(zhì)結(jié)合帶有正電荷的蛋白質(zhì)，結(jié)合的蛋白可以通過逐步增加洗脫液中的鹽濃度或是提高洗脫液的pH值洗脫下來。 離子交換層析示意圖 無 菌 過 濾氫 氧 化 鋁 共 沉 淀 分 裝 純 化 后 的 抗 原 再 與 氫 氧 化 鋁 共沉 淀 ， 在 共 沉 淀 時 ， 抗 原 吸 附在 氫 氧 化 鋁 上 。 疫苗純度的測定 乙肝疫苗是通過肌肉注射的方式進(jìn)入人體系統(tǒng)，為了降低疫苗內(nèi)雜質(zhì)含量對人體產(chǎn)生的不良影響，必須進(jìn)行疫苗的純度檢測。 對重組酵母乙肝疫苗，現(xiàn)有的HPLC檢測系統(tǒng)應(yīng)用0.1mol/L DTT（DTT即DL-Dithiothreitol，中文名為二硫蘇糖醇）與1:50吐溫80等量混合處理后能有效地檢測不同類型重組乙肝疫苗表面抗原的純度。 DTT結(jié) 構(gòu) 式 疫苗的保存 疫苗的穩(wěn)定性較差，一般在28 下能保存12個月，但當(dāng)溫度升高后，效力很快降低。在37 下，許多疫苗只能穩(wěn)定幾天或者幾個小時，非常不利于在室溫下運(yùn)輸。為了使疫苗的穩(wěn)定性提高，可用凍干的方法使之干燥。這樣，疫苗的有效期往往可延長1倍或以上，在室溫下其效價的損失亦較慢。 Thank you!H B s A g vaccine p r e p a r a t i o nH e L i a o n i n g M e d i c a l C o l l e g e