1.2基 因 工 程 的 基 本 操 作 程 序 基 本 步 驟 一 、 目 的 基 因 的 獲 取 二 、 基 因 表 達 載 體 的 構 建 三 、 將 目 的 基 因 導 入 受 體 細 胞 四 、 目 的 基 因 的 檢 測 與 鑒 定 一 、 目 的 基 因 的 獲 取(一 )、 目 的 基 因 目 的 基 因 主 要 指 能 編 碼 蛋 白 質(zhì) 的 基 因 ， 例 如 ， 與 生 物 抗 逆性 相 關 的 基 因 、 與 優(yōu) 良 品 質(zhì) 相 關 的 基 因 、 與 生 物 藥 物 和 保 健 品 相 關的 基 因 等 ， 也 可 以 是 一 些 具 有 調(diào) 控 作 用 的 因 子 。 基 因 結 構 ： 原 核 生 物 基 因 與 真 核 生 物 基 因 在 結 構 上 都 有 編碼 區(qū) 和 非 編 碼 區(qū) 。 編 碼 區(qū) ： 是 編 碼 具 有 一 定 氨 基 酸 序 列 的 蛋 白 質(zhì) 的 序 列 。 非 編 碼 區(qū) ： 分 布 于 編 碼 區(qū) 兩 側 ， 對 于 編 碼 區(qū) 編 碼 蛋 白 質(zhì) 具有 調(diào) 控 作 用 。 原 核 生 物 基 因 -編 碼 區(qū) 連 續(xù) 真 核 生 物 基 因 -編 碼 區(qū) 不 連 續(xù) 外 顯 子 與 內(nèi) 含 子 的 認 識 ： (二 )、 獲 取 目 的 基 因 的 方 法1.從 基 因 文 庫 中 獲 取 目 的 基 因 (1)基 因 文 庫 ： 將 某 種 生 物 全 部 DNA提 取 出 來 ， 選 用 適 當 的 限 制 酶 ， 將 DNA切 成 一 定 范 圍 大 小 的 DNA片 段 ， 分 別 與 載 體 連 接 ， 導 入 受 體 菌 的 群 體 中 儲 存 ， 各個 受 體 菌 分 別 含 有 這 種 生 物 的 不 同 基 因 ， 稱 為 基 因 文 庫 。 (2)種 類 ： 基 因 組 文 庫 ： 這 個 受 體 菌 的 群 體 包 含 了 這 種 生 物 的 所 有 基 因 ， 稱 為 基 因 組 文 庫 。 部 分 基 因 文 庫 ： 部 分 受 體 菌 所 含 有 的 基 因 只 是 該 種 生 物 的 部 分 基 因 ， 稱 為 基 因 組 文 庫 。 如 cDNA文 庫 。 兩 種 文 庫 的 比 較基 因 文 庫 類 型 部 分 (cDNA)文 庫 基 因 組 文 庫構 建 基 因 文 庫的 過 程 某 種 生 物 某 個 時 期 的 mRNA 逆 轉(zhuǎn) 錄 cDNA 與 載 體 連 接 導 入 受 體 菌 群 體 某 生 物 內(nèi) 部 全 部 DNA 限 制 酶許 多 DNA片 段與 載 體 連 接 導 入受 體 菌 群 體文 庫 大 小 小 大基 因 中 啟 動 子 無 有基 因 中 內(nèi) 含 子 無 有基 因 多 少 某 種 生 物 的 部 分 基 因 某 種 生 物 的 全 部 基 因 物 種 間 的 基 因 交 流 可 以 部 分 基 因 可 以 (3)從 基 因 文 庫 中 獲 取 目 的 基 因 的 主 要 依 據(jù) 可 根 據(jù) 基 因 的 核 苷 酸 序 列 、 基 因 的 功 能 、 基 因 在 染 色 體上 的 位 置 、 基 因 的 轉(zhuǎn) 錄 產(chǎn) 物 mRNA、 基 因 的 翻 譯 產(chǎn) 物 蛋 白 質(zhì) 等 特 性來 獲 取 目 的 基 因 。獲取目的基因的途徑 從 供 體 細 胞 的 DNA中 直 接 分 離 。 方 法 ： 鳥 槍 法 。 鳥 槍 法 ： 供 體 的 DNA切 成 許 多 DNA片 段 ， 連 入 載 體 導 入 受 體 細 胞 ， 根 據(jù) 性 狀 篩 選 目 的 基因人 工 合 成 (真 核 細 胞 ) 反 轉(zhuǎn) 錄 法 ： mRNA單 鏈 DNA雙 鏈 DNA根 據(jù) 已 知 氨 基 酸 序 列 合 成 DNA 方 法 ： 氨 基 酸 序 列 推 測 mRNA序 列 ， mRNA序 列 推 測 基 因 序 列 ， 化 學 合 成 目 的 基 因 。 2.利 用 PCR技 術 擴 增 目 的 基 因 (1)PCR： PCR是 聚 合 酶 鏈 式 反 應 的 縮 寫 ， 它 是 一 項 在 生 物 體 外復 制 特 定 DNA片 段 的 核 酸 合 成 技 術 。 通 過 這 一 技 術 ， 可 以 獲 得 大 量的 目 的 基 因 。 (2)原 理 ： 利 用 DNA雙 鏈 復 制 的 原 理 。 (3)前 提 ： 有 一 段 已 知 目 的 基 因 的 核 苷 酸 序 列 (以 便 根 據(jù) 這 一段 序 列 合 成 引 物 )。 (4)需 要 條 件 ： 模 板 DNA、 引 物 、 四 種 脫 氧 核 苷 酸 、 熱 穩(wěn) 定 DNA聚 合 酶 (Taq酶 )、 PCR擴 增 儀 。 (5)特 點 ： 呈 指 數(shù) 式 擴 增 (6)過 程 ： 引 物 結 合 到 互 補 DNA鏈 Taq酶 從 引 物 起 始進 行 互 補 鏈 的 合 成 53355 533 延 伸 方 向 ： 從 5端 向 3端 延 伸 (7)細 胞 內(nèi) DNA復 制 與 PCR技 術 的 比 較細 胞 內(nèi) DNA復 制 PCR技 術不同點 場 所 主 要 在 細 胞 核 內(nèi) 生 物 體 外解 旋 在 解 旋 酶 作 用 下 ， 邊 解 旋 邊 復 制 不 需 解 旋 酶 。 高 溫 (90 95 )解 旋 ，雙 鏈 完 全 分 開酶 DNA解 旋 酶 、 DNA聚 合 酶 Taq酶引 物 不 需 要 需 要溫 度 體 內(nèi) 溫 和 條 件 高 溫相同 點 需 提 供 DNA復 制 的 模 板 ；四 種 脫 氧 核 苷 酸 為 原 料 ；子 鏈 延 伸 的 方 向 都 是 從 5端 到 3端 3.人 工 合 成 如 果 基 因 較 小 ， 核 苷 酸 序 列 又 已 知 ， 也 可 以 通 過 DNA合 成 儀用 化 學 方 法 直 接 人 工 合 成 。 二 、 基 因 表 達 載 體 的 構 建 基 因 表 達 載 體 的 構 建 是 基 因 工 程 的 第 二 步 ， 也 是 基 因 工 程 的 核心 。 1.目 的 ： 是 目 的 基 因 在 受 體 細 胞 中 穩(wěn) 定 存 在 ， 并 且 可 以 遺 傳 至 下一 代 ， 使 目 的 基 因 能 夠 表 達 和 發(fā) 揮 作 用 。 2.組 成 ： 目 的 基 因 +啟 動 子 +終 止 子 +標 記 基 因 。 表 達 載 體啟 動 子 插 入 基 因 終 止 子 復 制 原 點 抗 生 素 抗 性 基 因 2.組 成(1)啟 動 子 ： 是 一 段 有 特 殊 結 構 的 DNA片 段 ， 位 于 基 因 的 首 端 ， 是RNA聚 合 酶 識 別 和 結 合 的 部 位 ， 能 驅(qū) 動 基 因 轉(zhuǎn) 錄 出 mRNA， 最終 獲 得 所 需 要 的 蛋 白 質(zhì) 。(2)終 止 子 ： 是 一 段 有 特 殊 結 構 的 DNA片 段 ， 位 于 基 因 的 尾 端 ， 能使 轉(zhuǎn) 錄 在 所 需 位 置 停 下 來 。(3)標 記 基 因 的 作 用 ： 為 了 鑒 定 受 體 細 胞 中 是 否 含 有 目 的 基 因 ， 從而 將 含 有 目 的 基 因 的 細 胞 篩 選 出 來 。 常 用 的 標 記 基 因 是 抗 生 素基 因 。 3.基 因 表 達 載 體 的 構 建 過 程 以 質(zhì) 粒 作 為 運 載 體 ： 兩 個 切 口獲 得 目 的 基 因 載 體 (質(zhì) 粒 )限 制 性 核 酸 內(nèi) 切 酶 DNA分 子限 制 性 核 酸 內(nèi) 切 酶 一 個 切 口兩 個 黏 性 末 端重 組 DNA分 子 (重 組 質(zhì) 粒 )DNA連 接 酶 結 果 ： 目 的 基 因 兩 端 結 合 呈 環(huán) 狀 DNA 載 體 的 兩 端 重 新 結 合 成 環(huán) 狀 DNA 目 的 基 因 與 載 體 的 黏 性 末 端 結 合 形 成 基 因 表 達 載 體4.基 因 表 達 載 體 的 功 能 (1)使 目 的 基 因 在 受 體 細 胞 中 穩(wěn) 定 存 在 ， 并 且 可 以 遺 傳 給 下 一 代 。 (2)使 目 的 基 因 能 夠 表 達 和 發(fā) 揮 作 用 。 三 、 將 目 的 基 因 導 入 受 體 細 胞 1.轉(zhuǎn) 化 目 的 基 因 進 入 受 體 細 胞 內(nèi) ， 并 且 在 受 體 細 胞 內(nèi) 維 持 穩(wěn) 定 的 表 達 的 過 程 ，成 為 轉(zhuǎn) 化 。 2.將 目 的 基 因 導 入 植 物 細 胞 (1)方 法 ： 農(nóng) 桿 菌 轉(zhuǎn) 化 法 ； 基 因 槍 法 ； 花 粉 管 通 道 法 。 (2)農(nóng) 桿 菌 轉(zhuǎn) 化 法 特 點 ： (3)農(nóng) 桿 菌 轉(zhuǎn) 化 法 過 程 ： 目 的 基 因 插 入 Ti質(zhì) 粒 的 T-DNA上 轉(zhuǎn) 入 農(nóng) 桿 菌 導 入 植 物 細 胞 整 合 到 受體 細 胞 染 色 體 的 DNA上 維 持 穩(wěn) 定 和 表 達 3.將 目 的 基 因 導 入 動 物 細 胞 (1)常 用 方 法 ： 顯 微 注 射 技 術 。 (2)操 作 程 序 ： 將 含 有 目 的 基 因 的 表 達 載 體 提 純 取 卵 (受 精卵 )顯 微 注 射 移 植 到 雌 性 動 物 的 輸 卵 管 或 子 宮 內(nèi) 發(fā) 育 獲得 具 有 新 性 狀 的 動 物 4.將 目 的 基 因 導 入 微 生 物 (1)原 核 生 物 的 特 點 ： 繁 殖 快 、 多 為 單 細 胞 、 遺 傳 物 質(zhì) 少 等 。 (2)轉(zhuǎn) 化 過 程 ： Ca2+處 理 細 胞 感 受 態(tài) 細 胞 重 組 表 達 載 體DNA分 子 與 感 受 態(tài) 細 胞 混 合 感 受 態(tài) 細 胞 吸 收 DNA分 子 (3)實 例 ： 早 期 的 基 因 工 程 操 作 都 用 原 核 生 物 作 為 受 體 細 胞 ， 其中 以 大 腸 桿 菌 最 為 常 見 。 5.目 的 基 因 導 入 不 同 受 體 細 胞 的 比 較生 物 種 類 植 物 細 胞 動 物 細 胞 微 生 物轉(zhuǎn) 化 方 法 農(nóng) 桿 菌 轉(zhuǎn) 化 法基 因 槍 法花 粉 管 通 道 法 顯 微 注 射 技 術 感 受 態(tài) 細 胞 法受 體 細 胞 卵 細 胞 、 受 精 卵 、體 細 胞 受 精 卵 、 卵 細 胞 常 用 大 腸 桿 菌目 的 形 成 具 有 新 性 狀的 植 株 形 成 具 有 新 性 狀的 動 物 生 產(chǎn) 人 們 所 需 要的 基 因 產(chǎn) 品 四 、 目 的 基 因 的 檢 測 與 鑒 定 目 的 基 因 導 入 受 體 細 胞 后 ， 是 否 可 以 穩(wěn) 定 維 持 和 表 達 其 遺 傳特 性 ， 只 有 通 過 檢 測 和 鑒 定 才 能 知 道 。 這 是 基 因 工 程 的 第 四 步工 作 。 1.操 作 目 的 檢 測 和 鑒 定 目 的 基 因 導 入 受 體 細 胞 后 ， 是 否 可 以 穩(wěn) 定 維 持 和表 達 起 遺 傳 特 性 。 2.檢 測 和 鑒 定 水 平目 的 基 因 是否 插 入 mRNA 蛋 白 質(zhì) 個 體DNA分 子雜 交是 否 出 現(xiàn)雜 交 帶 分 子 雜 交是 否 出 現(xiàn)雜 交 帶 抗 原 -抗 體雜 交是 否 出 現(xiàn)雜 交 帶 抗 蟲 、 抗 病接 種 實 驗是 否 抗 蟲 ；是 否 抗 病 個 體 水 平 檢 測分 子 水 平 檢 測轉(zhuǎn) 錄 翻 譯檢測 檢測 檢測 鑒定現(xiàn)象現(xiàn)象 現(xiàn)象 現(xiàn)象 DNA探 針 及 其 應 用 1.DNA探 針 的 應 用 所 依 據(jù) 的 原 理 是 DNA雜 交 。 DNA雜 交 是 指 DNA片 段 在 適 合 的 條 件 下 能 和 與 之 互 補 的 另 一 個 片 段 結 合 。如 果 對 最 初 的 DNA片 段 進 行 標 記 ， 即 成 為 探 針 。 2.DNA探 針 的 制 備 方 法 ： 例 如 ， 化 學 合 成 、 反 轉(zhuǎn) 錄 法 。 3.探 針 的 應 用 從 基 因 文 庫 中 準 確 提 取 目 的 基 因 。 檢 測 轉(zhuǎn) 基 因 生 物 染 色 體 DNA上 是 否 插 入 了 目 的 基 因 和 檢 測目 的 基 因 是 否 轉(zhuǎn) 錄 出 mRNA。 鑒 定 物 種 親 源 關 系 、 疾 病 的 診 斷 和 治 療 。