目標(biāo)導(dǎo)航預(yù)習(xí)導(dǎo)引 目標(biāo)導(dǎo)航預(yù)習(xí)導(dǎo)引一二一、分離蛋白質(zhì)的原理與方法1.分離蛋白質(zhì)的原理2.分離蛋白質(zhì)的方法(1)凝膠色譜法概念:根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的有效方法,也叫分配色譜法。 目標(biāo)導(dǎo)航預(yù)習(xí)導(dǎo)引一二過(guò)程及原理b.分離的過(guò)程 目標(biāo)導(dǎo)航預(yù)習(xí)導(dǎo)引一二c.分離原理:依據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的不同而將蛋白質(zhì)分離。(2)電泳法電泳的概念:指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過(guò)程。原理:利用了待分離樣品中各種分子的帶電性質(zhì)的差異、分子本身的大小以及形狀的不同,使帶電分子在電場(chǎng)中產(chǎn)生不同的遷移速度,從而分離樣品中的各種分子。分離方法:瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。其中后者使用時(shí)通常加入帶負(fù)電荷多的SDS,形成“蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物”,使蛋白質(zhì)遷移速率僅取決于分子的大小。3.緩沖溶液(1)組成:通常由12種緩沖劑溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的使用比例,可配制不同pH的緩沖液。 (2)作用:抵制外界的酸和堿對(duì)溶液pH的影響,維持pH基本不變。 目標(biāo)導(dǎo)航預(yù)習(xí)導(dǎo)引一二緩沖溶液中含對(duì)酸堿起緩沖作用的緩沖對(duì),每一緩沖對(duì)均由弱酸和相應(yīng)的強(qiáng)堿鹽組成。細(xì)胞外液也有酸堿緩沖對(duì),你能回憶并說(shuō)出細(xì)胞外液中的酸堿緩沖對(duì)嗎?提示：細(xì)胞外液中主要的酸堿緩沖對(duì)有:H 2CO3/NaHCO3、NaH2PO4/Na2HPO4等。 目標(biāo)導(dǎo)航預(yù)習(xí)導(dǎo)引一二二、凝膠色譜法的實(shí)驗(yàn)操作1.蛋白質(zhì)的提取和分離步驟(1)樣品處理血紅蛋白的釋放:紅細(xì)胞在蒸餾水和甲苯作用下破裂,釋放出血紅蛋白分離血紅蛋白溶液:混合液離心過(guò)濾去除脂溶性沉淀層用分 液漏斗分離 目標(biāo)導(dǎo)航預(yù)習(xí)導(dǎo)引一二(3)純化:凝膠色譜法。(4)純度鑒定:SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。 目標(biāo)導(dǎo)航預(yù)習(xí)導(dǎo)引一二2.凝膠色譜操作(1)凝膠色譜柱的制作。(2)凝膠色譜柱的裝填。固定:將色譜柱垂直固定在支架上裝填:將用蒸餾水充分溶脹后的凝膠配成凝膠懸浮液,一次性緩慢倒入色譜柱內(nèi),裝填時(shí)可輕輕敲動(dòng)色譜柱,使凝膠裝填均勻洗脫:裝填完后,立即用緩沖液洗脫瓶,在約50 cm高的操作壓下,用300 mL的物質(zhì)的量濃度為20 mmol/L 的磷酸緩沖液(pH為7.0)充分洗滌平衡凝膠12 h 目標(biāo)導(dǎo)航預(yù)習(xí)導(dǎo)引一二(3)樣品的加入與洗脫。加樣前:打開下端的流出口,使柱內(nèi)凝膠面上的緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊,關(guān)閉出口。加透析樣品。調(diào)整緩沖液面:與凝膠面平齊滴加透析樣品:用吸管將1 mL透析后的樣品加到色譜柱的頂端樣品滲入凝膠床:加樣后,打開下端出口,等樣品完全進(jìn)入凝膠層后,關(guān)閉下端出口 洗脫:打開下端出口,用 20 mmol/L的磷酸緩沖液洗脫 目標(biāo)導(dǎo)航預(yù)習(xí)導(dǎo)引一二收集:待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí),用試管收集流出液,每5 mL收集一管,連續(xù)收集 3.操作提示(1)紅細(xì)胞的洗滌:洗滌次數(shù)、離心速度與離心時(shí)間十分重要。洗滌次數(shù)過(guò)少,無(wú)法除去血漿蛋白;離心速度過(guò)高和時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)使白細(xì)胞等一同沉淀,達(dá)不到分離效果。(2)色譜柱填料的處理:商品凝膠使用前需直接放在洗脫液中膨脹,可以將加入其中的濕凝膠用沸水浴加熱,加速膨脹。(3)凝膠色譜柱的裝填:在裝填凝膠柱時(shí),不得有氣泡存在。氣泡會(huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序,降低分離效果。(4)蛋白質(zhì)的分離:如果紅色區(qū)帶均勻一致地移動(dòng),說(shuō)明色譜柱制 作成功。 目標(biāo)導(dǎo)航預(yù)習(xí)導(dǎo)引一二(1)凝膠色譜柱和固定化酶的反應(yīng)柱都裝填有不能通過(guò)“柱”下端多孔板(或多孔篩板)的顆粒,它們的顆粒功能有何不同?提示：凝膠色譜柱裝填的是凝膠顆粒,允許小分子進(jìn)入,不允許大分子進(jìn)入,通過(guò)延長(zhǎng)小分子的路程使大分子與小分子分離。固定化酶的反應(yīng)柱裝填的是固定有酶的載體顆粒,既能催化反應(yīng)物的反應(yīng),又保證了酶與反應(yīng)物分子的分離,實(shí)現(xiàn)了酶的重復(fù)利用,節(jié)約了生產(chǎn)成本。(2)凝膠色譜柱和固定化酶的反應(yīng)柱都能進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)嗎?提示：不是。固定化酶的反應(yīng)柱能進(jìn)行化學(xué)反應(yīng),凝膠色譜柱不能進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)。 知識(shí)精要典題例解遷移應(yīng)用知識(shí)架構(gòu)一二一、血紅蛋白提取和分離的原理1.分離不同種類蛋白質(zhì)的原理蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)(如形狀、大小、電荷性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)、親和力等)千差萬(wàn)別,由此可提取和分離各種蛋白質(zhì)。2.凝膠色譜法(分配色譜法)(1)凝膠:實(shí)際上是一些微小的多孔球體,大多數(shù)是由多糖類化合物構(gòu)成的,如葡聚糖、瓊脂糖。(2)原理:凝膠小球體內(nèi)部有許多貫穿的通道,相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)分子不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部,只能分布在顆粒之間,通過(guò)的路程較短,移動(dòng)速度較快;相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)分子比較容易進(jìn)入凝膠內(nèi)的通道,通過(guò)的路程較長(zhǎng),移動(dòng)速度較慢,因此可將各種相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子分離。 知識(shí)精要典題例解遷移應(yīng)用知識(shí)架構(gòu)一二(3)分離過(guò)程:混合物上柱洗脫大分子蛋白質(zhì)流動(dòng)快、小分子蛋白質(zhì)流動(dòng)慢收集大分子收集小分子。3.緩沖溶液(1)原理:由弱酸和相應(yīng)的強(qiáng)堿弱酸鹽組成(如H2CO3/NaHCO3,NaH2PO4/Na2HPO4等),調(diào)節(jié)酸和鹽的用量,可配制不同pH的緩沖液。(2)緩沖液作用:抵制外界酸、堿對(duì)溶液pH的干擾,從而保持pH穩(wěn)定。 知識(shí)精要典題例解遷移應(yīng)用知識(shí)架構(gòu)一二4.凝膠電泳法(1)原理:許多重要的生物大分子,如多肽、核酸等都具有可解離的基團(tuán),在一定的pH下,這些基團(tuán)會(huì)帶上正電或負(fù)電。在電場(chǎng)的作用下,這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng)。電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小、形狀的不同,使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度,從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。(2)常見分離方法:瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳。 一二知識(shí)精要典題例解遷移應(yīng)用知識(shí)架構(gòu)【例1】 用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)中,相對(duì)分子質(zhì)量不同的兩種蛋白質(zhì)在凝膠中的行進(jìn)過(guò)程,可表示為圖中哪一個(gè)()解析：凝膠色譜法是依據(jù)蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的大小不同而將其分離的。相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)不能進(jìn)入凝膠內(nèi)部通道,路程短,移動(dòng)快,洗脫出來(lái)所用的時(shí)間短;相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)能進(jìn)入凝膠內(nèi)部通道,路程長(zhǎng),移動(dòng)慢,洗脫出來(lái)所用的時(shí)間長(zhǎng)。答案：B 一二知識(shí)精要典題例解遷移應(yīng)用知識(shí)架構(gòu) 一二知識(shí)精要典題例解遷移應(yīng)用知識(shí)架構(gòu)分離蛋白質(zhì)不必考慮的因素是()A.分子的形狀和大小 B.蛋白質(zhì)所帶電荷的性質(zhì)和多少C.蛋白質(zhì)的溶解度D.蛋白質(zhì)肽鍵的結(jié)構(gòu)解析：所有蛋白質(zhì)的肽鍵結(jié)構(gòu)相同,均為“NHCO”,不作為分離蛋白質(zhì)考慮的因素。答案：D 一二知識(shí)精要典題例解遷移應(yīng)用知識(shí)架構(gòu)電泳方法 一二知識(shí)精要典題例解遷移應(yīng)用知識(shí)架構(gòu)二、凝膠色譜法的操作流程 一二知識(shí)精要典題例解遷移應(yīng)用知識(shí)架構(gòu) 一二知識(shí)精要典題例解遷移應(yīng)用知識(shí)架構(gòu)【例2】 下列關(guān)于紅細(xì)胞的洗滌過(guò)程的敘述,正確的是()A.低速長(zhǎng)時(shí)間離心,如500 r/min,12 min,以保證達(dá)到很好的分離效果B.離心后用膠頭吸管吸出下層透明的紅色血漿C.將下層暗紅色的紅細(xì)胞液體倒入燒杯,再加入五倍體積的蒸餾水D.直至上清液中沒有黃色,表明紅細(xì)胞已洗滌干凈解析：紅細(xì)胞洗滌過(guò)程中,應(yīng)做低速短時(shí)間離心,以避免白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等一同沉淀,影響血紅蛋白的提純;離心后血漿在上層,并呈現(xiàn)為黃色,需用膠頭吸管吸出;洗滌紅細(xì)胞時(shí)應(yīng)用生理鹽水而不用蒸餾水,否則,將導(dǎo)致紅細(xì)胞破裂影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此A、B、C均錯(cuò)誤。 答案：D 一二知識(shí)精要典題例解遷移應(yīng)用知識(shí)架構(gòu) 一二知識(shí)精要典題例解遷移應(yīng)用知識(shí)架構(gòu) 一二知識(shí)精要典題例解遷移應(yīng)用知識(shí)架構(gòu)利用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)時(shí),蛋白質(zhì)洗脫出來(lái)的順序是()相對(duì)分子質(zhì)量最大的相對(duì)分子質(zhì)量最小的相對(duì)分子質(zhì)量適中的A.B.C.D.解析：相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)容易通過(guò)凝膠間隙,先被洗脫出來(lái);相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部,后被洗脫出來(lái);相對(duì)分子質(zhì)量適中的,能進(jìn)入凝膠的內(nèi)孔隙中孔徑大小相應(yīng)的部分,洗脫出來(lái)的時(shí)間也居中。答案：C 一二知識(shí)精要典題例解遷移應(yīng)用知識(shí)架構(gòu)1.樣品處理、分離與純化的目的不同 一二知識(shí)精要典題例解遷移應(yīng)用知識(shí)架構(gòu)2.分離血紅蛋白溶液的結(jié)果 知識(shí)架構(gòu)一二 在裝填凝膠色譜柱時(shí),要注意凝膠裝填的要緊密、均勻。因?yàn)槿绻b填的不夠緊密、均勻,就會(huì)在凝膠色譜柱內(nèi)形成無(wú)效的空隙,使本該進(jìn)入凝膠內(nèi)部的樣品分子從這些空隙中通過(guò),攪亂洗脫液的流動(dòng)次序,影響分離效果。同時(shí)在凝膠色譜操作中,不能發(fā)生洗脫液流干,漏出凝膠顆粒的現(xiàn)象。一旦發(fā)生以上現(xiàn)象,凝膠色譜柱必須重新裝填?！纠}】 隨著人類基因組計(jì)劃的進(jìn)展和多種生物基因組測(cè)序工作的完成,人類跨入了后基因組和蛋白質(zhì)組時(shí)代。對(duì)蛋白質(zhì)的研究與應(yīng)用,首先要獲得純度較高的蛋白質(zhì)。 (導(dǎo)學(xué)號(hào)52260017) .血紅蛋白提取的具體過(guò)程可分為:(1)紅細(xì)胞的洗滌。具體操作過(guò)程是;(2);(3)分離血紅蛋白溶液。血紅蛋白混合液在離心管中離心后,從上往下數(shù)第層是紅色透明液體即為血紅蛋白的水溶液;(4)透析。.透析后的樣品還需經(jīng)過(guò)凝膠色譜法進(jìn)一步純化,其目的是,裝填凝膠色譜柱時(shí),要注意色譜柱內(nèi)不能有氣泡,這是因?yàn)椤?.判斷純化的蛋白質(zhì)是否達(dá)到要求,可用電泳法對(duì)樣品進(jìn)行,電泳是指。 解析：.(1)紅細(xì)胞的洗滌目的是去除雜蛋白,過(guò)程是將采集的血樣低速短時(shí)間離心,吸出上層透明黃色血漿,再用五倍體積的生理鹽水低速短時(shí)間離心,重復(fù)洗滌三次。(2)血紅蛋白的釋放:在蒸餾水和甲苯作用下,紅細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。(3)分離血紅蛋白溶液:試管中的溶液分為4層。第1層為無(wú)色透明的甲苯層,第2層為白色薄層固體,是脂溶性物質(zhì)的沉淀層,第3層是紅色透明液體,這是血紅蛋白的水溶液,第4層是其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀物。血紅蛋白混合液在離心管中離心后,從上往下數(shù)第3層是紅色透明液體即為血紅蛋白的水溶液。(4)透析:可以去除樣品中相對(duì)分子質(zhì)量較小的雜質(zhì),或用于更換樣品的緩沖液。.透析后的樣品還需經(jīng)過(guò)凝膠色譜法進(jìn)一步純化,其目的是去除相對(duì)分子質(zhì)量較大的雜質(zhì)蛋白。裝填凝膠色譜柱時(shí),要注意色譜柱內(nèi)不能有氣泡,這是因?yàn)闅馀輹?huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序,降低分離效果。.判斷純化的蛋白質(zhì)是否達(dá)到要求,可用電泳法對(duì)樣品進(jìn)行純度鑒定,電泳是指 帶電離子在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過(guò)程。 答案：.(1)將采集的血樣低速短時(shí)間離心,吸出上層透明黃色血漿,再用五倍體積的生理鹽水低速短時(shí)間離心,重復(fù)洗滌三次(2)血紅蛋白的釋放(3)3.去除相對(duì)分子質(zhì)量較大的雜蛋白氣泡會(huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序,降低分離效果.純度鑒定帶電離子在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過(guò)程