目標(biāo)導(dǎo)航預(yù)習(xí)導(dǎo)引 目標(biāo)導(dǎo)航預(yù)習(xí)導(dǎo)引一二一、固定化酶的應(yīng)用實例和固定化細(xì)胞技術(shù)1.課題背景(1)酶應(yīng)用時存在的實際問題對強酸、強堿、高溫和有機溶劑等條件非常敏感,易失活。溶液中的酶很難回收,不能被再次利用,提高了生產(chǎn)成本。反應(yīng)后的酶會混在產(chǎn)物中,如不除去,會影響產(chǎn)品質(zhì)量。(2)固定化酶的優(yōu)點:酶既能與反應(yīng)物接觸,又能與產(chǎn)物分離,還可以被反復(fù)利用。(3)固定化細(xì)胞的優(yōu)點:與固定化酶技術(shù)相比,固定化細(xì)胞制備的成本更低,操作更容易。 目標(biāo)導(dǎo)航預(yù)習(xí)導(dǎo)引一二2.固定化細(xì)胞技術(shù)(1)固定化技術(shù)的類型:包埋法、化學(xué)結(jié)合法和物理吸附法。(2)包埋法包埋法固定化細(xì)胞即將微生物細(xì)胞均勻地包埋在不溶于水的多孔性載體中。常用的載體有明膠、瓊脂糖、海藻酸鈉、醋酸纖維素和聚丙烯酰胺等。任何一項新技術(shù)有利,也必有弊。固定化酶是將酶固定在不溶于水的載體上的一項新技術(shù),由該特點你是否想到了固定化酶的不足?提示：將酶固定在不溶于水的載體上,限制了酶分子與底物分子(或離子)的接觸,減少了酶與底物的接觸面積,降低了化學(xué)反應(yīng)的速 度。 目標(biāo)導(dǎo)航預(yù)習(xí)導(dǎo)引一二二、實驗操作1.制備固定化酵母細(xì)胞酵母細(xì)胞的活化:向干酵母中加入蒸餾水,使其活化配制CaCl2溶液配制海藻酸鈉溶液:在加熱時要用玻璃棒攪拌,并用小火或間斷加熱海藻酸鈉溶液與酵母細(xì)胞混合固定化酵母細(xì)胞 目標(biāo)導(dǎo)航預(yù)習(xí)導(dǎo)引一二2.用固定化酵母細(xì)胞發(fā)酵(1)將固定好的酵母細(xì)胞用蒸餾水沖洗23次。(2)發(fā)酵時的溫度為25 ,時間為24 h。用接種環(huán)對微生物進(jìn)行接種操作時,需要使灼燒滅菌的接種環(huán)先冷卻再使用,由該操作你能設(shè)想一下何時向海藻酸鈉溶液中加入酵母細(xì)胞嗎?請給予適當(dāng)?shù)慕忉?。提示：?yīng)等到海藻酸鈉溶液冷卻至室溫后才能向其內(nèi)加入酵母細(xì)胞,因為溫度過高的海藻酸鈉溶液和溫度過高的接種環(huán)一樣,都可能殺死菌種。 知識精要典題例解遷移應(yīng)用知識架構(gòu)一二一、固定化酶的應(yīng)用和固定化細(xì)胞技術(shù)1.固定化酶的應(yīng)用(1)固定化技術(shù)的概念固定化酶和固定化細(xì)胞技術(shù)是利用物理或化學(xué)方法將酶或細(xì)胞固定在一定空間內(nèi)的技術(shù)。(2)固定化技術(shù)的優(yōu)勢將酶或細(xì)胞固定在不溶于水的載體上,使酶或細(xì)胞可以直接與反應(yīng)物接觸,充分發(fā)揮其催化功能,同時又能與產(chǎn)物分離,被反復(fù)利用。在一定程度上避免高溫、強酸、強堿和有機溶劑對酶活性的影響,以提高催化效率,降低生產(chǎn)成本,提高產(chǎn)品質(zhì)量。 知識精要典題例解遷移應(yīng)用知識架構(gòu)一二(3)應(yīng)用實例:生產(chǎn)高果糖漿原料: 葡萄糖(由淀粉轉(zhuǎn)化而來)反應(yīng)原理:葡萄糖 果糖。生產(chǎn)過程及示意圖(如圖所示)將葡萄糖異構(gòu)酶固定在顆粒狀的載體上 知識精要典題例解遷移應(yīng)用知識架構(gòu)一二放入底部有許多小孔的反應(yīng)柱內(nèi)(酶顆粒不能通過篩板上的小孔,反應(yīng)溶液能通過)葡萄糖溶液從反應(yīng)柱上端注入流經(jīng)反應(yīng)柱與固定化葡萄糖異構(gòu)酶接觸并進(jìn)行反應(yīng)果糖溶液從反應(yīng)柱下端流出 知識精要典題例解遷移應(yīng)用知識架構(gòu)一二2.固定化酶或固定化細(xì)胞技術(shù)的方法固定化酶或固定化細(xì)胞技術(shù)常用的方法有包埋法、化學(xué)結(jié)合法和物理吸附法,如圖所示。包埋法包埋法是指將酶或細(xì)胞包裹在多孔的載體中,如將酶包裹在聚丙烯酰胺凝膠等高分子凝膠中,或包裹在硝酸纖維素等半透性高分子膜中。包埋法又分為凝膠包埋法和微囊化法,前者包埋成格子型, 后者包埋成微膠囊型。 知識精要典題例解遷移應(yīng)用知識架構(gòu)一二化學(xué)結(jié)合法化學(xué)結(jié)合法是指將酶分子或細(xì)胞相互結(jié)合,或?qū)⑵浣Y(jié)合到纖維素、瓊脂糖、離子交換樹脂等載體上的固定方法。工藝簡便及條件溫和是其顯著特點,其載體選擇范圍很大,涉及天然或合成的無機、有機高分子材料,其過程可同時達(dá)到純化和固定化,酶失活后可重新活化,載體可以再生。化學(xué)結(jié)合法中常見的有交聯(lián)法、共價結(jié)合法、離子結(jié)合法等。物理吸附法物理吸附法是指將酶吸附到固定吸附劑表面的方法,固定吸附劑多為活性炭、多孔玻璃等。 知識精要典題例解遷移應(yīng)用知識架構(gòu)一二 一二知識精要典題例解遷移應(yīng)用知識架構(gòu)【例1】 下列有關(guān)固定化酶和固定化細(xì)胞的敘述,正確的是()A.可用包埋法制備固定化酵母細(xì)胞B.反應(yīng)產(chǎn)物對固定化酶的活性沒有影響C.葡萄糖異構(gòu)酶固定前后專一性不同D.固定化細(xì)胞可以催化各種反應(yīng)底物的一系列反應(yīng)解析：固定化酵母細(xì)胞適合采用包埋法,固定化酶適合采用化學(xué)結(jié)合法和物理吸附法,A項正確。酶促反應(yīng)的產(chǎn)物積累如導(dǎo)致pH變化,會影響酶的活性,B項錯誤。酶固定前后專一性不變,C項錯誤。固定化細(xì)胞固定的是一系列酶,可以催化一系列反應(yīng),但不能催化各種反應(yīng)底物的反應(yīng),D項錯誤。答案：A 一二知識精要典題例解遷移應(yīng)用知識架構(gòu) 一二知識精要典題例解遷移應(yīng)用知識架構(gòu) 一二知識精要典題例解遷移應(yīng)用知識架構(gòu)下列關(guān)于固定化細(xì)胞技術(shù)的說法,正確的是()A.物理吸附法的優(yōu)點是操作簡單,吸附牢固B.包埋法的優(yōu)點是操作復(fù)雜,條件溫和,對細(xì)胞無毒性C.物理吸附法容易對酶的活性產(chǎn)生影響D.凝膠包埋常用的凝膠種類有瓊脂、海藻酸鈉(鈣)、明膠和聚丙烯酰胺凝膠等 一二知識精要典題例解遷移應(yīng)用知識架構(gòu)解析：固定化細(xì)胞的主要方法有物理吸附法和包埋法等。它們各有利弊,物理吸附法的主要優(yōu)點是酶活性不受影響,但吸附過程相當(dāng)復(fù)雜,這一過程與微生物細(xì)胞的性質(zhì)、載體的性質(zhì)以及兩者之間的相互作用等有關(guān),且吸附力較弱,吸附不牢固,細(xì)胞容易脫落。而包埋法操作簡單,條件溫和,對細(xì)胞無毒性,適合于生長細(xì)胞的固定,但凝膠的結(jié)構(gòu)要保持穩(wěn)定需要適當(dāng)?shù)臈l件控制。凝膠包埋常用的凝膠種類有瓊脂、海藻酸鈉(鈣)、明膠和聚丙烯酰胺凝膠等。答案：D 一二知識精要典題例解遷移應(yīng)用知識架構(gòu)二、固定化酵母細(xì)胞的實驗操作 一二知識精要典題例解遷移應(yīng)用知識架構(gòu) 一二知識精要典題例解遷移應(yīng)用知識架構(gòu)發(fā)酵(將150 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的葡萄糖溶液轉(zhuǎn)移到200 mL的錐形瓶中,加入固定好的酵母細(xì)胞,25 下發(fā)酵24 h) 一二知識精要典題例解遷移應(yīng)用知識架構(gòu) 一二知識精要典題例解遷移應(yīng)用知識架構(gòu)【例2】 下列關(guān)于酵母細(xì)胞活化的說法,不正確的是 ()A.酵母細(xì)胞活化就是使酵母細(xì)胞由無氧呼吸變成有氧呼吸B.活化就是讓處于休眠狀態(tài)的細(xì)胞恢復(fù)正常的生活狀態(tài)C.酵母細(xì)胞活化所需要的時間較短D.酵母細(xì)胞活化后體積增大解析：在缺水的狀態(tài)下,微生物會處于休眠狀態(tài)。活化就是讓處于休眠狀態(tài)的微生物重新恢復(fù)到正常的生活狀態(tài)。酵母細(xì)胞所需要的活化時間較短,一般需要1 h左右。答案：A 一二知識精要典題例解遷移應(yīng)用知識架構(gòu) 一二知識精要典題例解遷移應(yīng)用知識架構(gòu) 一二知識精要典題例解遷移應(yīng)用知識架構(gòu)下列關(guān)于酶的敘述,正確的是()A.活細(xì)胞內(nèi)合成酶的原料一定是氨基酸B.固定在載體上的酶可以被反復(fù)利用是固定化酶技術(shù)的優(yōu)點之一C.固定化酶活性的發(fā)揮需要提供一定的營養(yǎng)物質(zhì)D.加酶洗衣粉是將酶直接添加到洗衣粉中解析：合成酶的原料是氨基酸或核糖核苷酸;固定化酶技術(shù)是將酶固定在不溶于水的載體上,既能與反應(yīng)物接觸又能與產(chǎn)物分離,能夠反復(fù)利用;固定化酶不是生物體,其活性的維持不需要提供特定的營養(yǎng)物質(zhì);加酶洗衣粉是指添加了酶制劑的洗衣粉,而不是直接添加酶。答案：B 一二知識精要典題例解遷移應(yīng)用知識架構(gòu)制備固定化酵母細(xì)胞的注意事項(1)酵母細(xì)胞的活化:在缺水的狀態(tài)下,微生物會處于休眠狀態(tài)?；罨褪亲屘幱谛菝郀顟B(tài)的微生物重新恢復(fù)正常的生活狀態(tài)。酵母細(xì)胞所需要的活化時間較短,一般需要1 h左右,要提前作好準(zhǔn)備。此外,酵母細(xì)胞活化時體積會變大,因此活化前應(yīng)該選擇體積足夠大的容器,以避免酵母細(xì)胞的活化液溢出容器。(2)加熱:加熱使海藻酸鈉溶化是操作中最重要的一個環(huán)節(jié),影響到實驗的成敗。如果海藻酸鈉濃度過高,將很難形成凝膠珠;如果濃度過低,形成的凝膠珠所包埋的酵母細(xì)胞的數(shù)目少,影響實驗效 果。 一二知識精要典題例解遷移應(yīng)用知識架構(gòu)(3)凝膠珠的檢測:剛形成的凝膠珠應(yīng)在CaCl2溶液中浸泡一段時間,以便形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。檢驗?zāi)z珠的質(zhì)量是否合格可以使用下列方法:一是用鑷子夾起一個凝膠珠放在實驗桌上用手?jǐn)D壓,如果凝膠珠不容易破裂,沒有液體流出,就表明凝膠珠的制作成功。二是在實驗桌上用力摔打凝膠珠,如果凝膠珠很容易彈起,也能表明制備的凝膠珠是成功的。 知識架構(gòu)一二 1.制作固定化葡萄糖異構(gòu)酶時不能采用包埋法,由于酶分子小,包埋時容易從包埋材料中漏出。而細(xì)胞體積大難以被吸附或結(jié)合,所以固定化細(xì)胞常用包埋法。【例1】 如圖為制備固定化酵母細(xì)胞用于葡萄酒生產(chǎn)的流程圖,請回答下列問題。 (導(dǎo)學(xué)號52260015)酵母細(xì)胞活化配制CaCl2溶液配制海藻酸鈉溶液海藻酸鈉溶液與酵母細(xì)胞混合固定化酵母細(xì)胞發(fā)酵葡萄汁葡萄酒葡萄醋(1)本實驗采用了包埋法,而制備固定化酶則不宜用此方法,原因是。實驗過程中用CaCl 2溶液處理的目的是 。 (2)在利用葡萄酒制作葡萄醋時,除控制好溫度等條件外,還要注意控制氣體條件,因為醋酸菌是(填“好氧”“厭氧”或“兼性厭氧”)型細(xì)菌。 (3)為篩選出能高效利用淀粉的轉(zhuǎn)基因釀酒酵母菌,將該工程菌接種在的固體平板培養(yǎng)基上,培養(yǎng)一定時間后,加入碘液,選擇的菌落進(jìn)一步純化培養(yǎng)。 解析：(1)固定化酵母細(xì)胞采用包埋法,酶分子很小,容易從包埋材料中漏出,不宜用此方法;CaCl2溶液處理讓Ca2+與海藻酸鈉反應(yīng)形成不溶于水的海藻酸鈣凝膠。(2)制備果醋的菌種是醋酸菌,屬于好氧型細(xì)菌,需要持續(xù)通入無菌空氣。(3)將該工程菌接種在含淀粉的固體平板培養(yǎng)基上,該工程菌可產(chǎn)生淀粉酶分泌到培養(yǎng)基中,水解淀粉后的區(qū)域,遇到碘液不變藍(lán),會產(chǎn)生透明圈,這樣也可以鑒定淀粉酶基因是否插入釀酒酵母菌。答案：(1)酶分子很小,容易從包埋材料中漏出Ca2+與海藻酸鈉反應(yīng)形成不溶于水的海藻酸鈣凝膠(2)好氧(3)以淀粉作為唯一碳源透明圈大 2.與固定化細(xì)胞相比,固定化酶能充分和反應(yīng)物接觸,充分發(fā)揮其催化作用,并且可以回收和反復(fù)利用。固定化細(xì)胞更易催化一系列生化反應(yīng),而固定化酶只能催化一種或一類生化反應(yīng),因此固定化細(xì)胞成本更低,操作更容易,通常可將單一的酶促反應(yīng)變?yōu)檫B續(xù)的酶促反應(yīng)過程。但固定化細(xì)胞活性的維持需要滿足細(xì)胞生命活動的營養(yǎng)物質(zhì)等條件。 【例2】 下列有關(guān)固定化酶和固定化細(xì)胞的說法,正確的是()A.固定化酶的優(yōu)勢在于能催化一系列生化反應(yīng)B.固定化細(xì)胞技術(shù)一次只能固定一種酶C.固定化酶和固定化細(xì)胞的共同點是所固定的酶都可反復(fù)使用D.固定化酶和固定化細(xì)胞都能反復(fù)使用,但酶的活性迅速下降解析：酶具有專一性,一種酶固定后不可能催化一系列生化反應(yīng);固定化細(xì)胞技術(shù)固定的是一系列酶;固定化酶和固定化細(xì)胞都能反復(fù)使用,若條件適宜,一般不會出現(xiàn)酶的活性迅速下降問題。答案：C