核 技 術(shù) ：能 量 的 放 大 計 算 機(jī) 芯 片 ： 信 息 的 集 成20世 紀(jì) 自 然 科 學(xué) 的 兩 大 成 就 PCR技 術(shù) ：生 命 信 息 的 放 大 基 因 芯 片 ：生 命 信 息 的 集 成20世 紀(jì) 生 命 科 學(xué) 的 兩 大 成 就 PCR技 術(shù)高 考 專 題 復(fù) 習(xí) 目 的 基 因 的 檢 測 與 鑒 定基 因 工 程 的 基 本 操 作 程 序 的 步 驟 ：目 的 基 因 的 獲 取基 因 表 達(dá) 載 體 的 構(gòu) 建將 目 的 基 因 導(dǎo) 入 受 體 細(xì) 胞 一 、 目 的 基 因 的 獲 取 從 基 因 文 庫 中 獲 取 目 的 基 因基 因 文 庫 ： 將 含 有 某 種 生 物 不 同 基 因 的 許 多 DNA片 斷 ， 導(dǎo) 入 到 中 ， 各 個受 體 菌 分 別 含 有 這 種 生 物 的 不 同 基 因 ，稱 為 基 因 文 庫 ?；?因 文 庫 基 因 組 文 庫部 分 基 因 文 庫（ 如 cDNA文 庫 ） 基 因 文 庫 的 構(gòu) 建 過 程基因組文庫 限 制 酶 供 體 細(xì) 胞 的全 部 DNA大 量 DNA片 段拼 接 到 載 體 上導(dǎo) 入 受 體 細(xì) 胞 擴(kuò) 增 基 因 文 庫 的 構(gòu) 建 過 程mRNA 單 鏈 DNA 雙 鏈 DNA逆 轉(zhuǎn) 錄cDNA文 庫 PCR的 全 稱 ： 聚 合 酶 鏈 式 反 應(yīng)PCR的 原 理 ： DNA復(fù) 制 PCR技 術(shù) 擴(kuò) 增 目 的 基 因 的 前 提 條 件 ：要 有 一 段 已 知 的 目 的 基 因 的 核 苷 酸 序 列 。 模 板原 料引 物 酶控 制 溫 度目 的 基 因 DNA四 種 脫 氧 核 苷 酸如 單 鏈 DNA分 子 片 段耐 熱 的 DNA聚 合 酶PCR儀 自 動 調(diào) 控PCR的 條 件 ： 多 聚 酶 鏈 式 反 應(yīng)（ Polymerase Chain Reaction） ， 是 一 種 體 外 迅速 擴(kuò) 增 DNA片 段 的 技 術(shù) 。1988年 美 國 穆 里 斯（ K.Mullis） 等 人 發(fā) 明 ， 榮獲 1993年 諾 貝 爾 化 學(xué) 獎 。PCR 【 基 礎(chǔ) 知 識 】一 、 PCR原 理 ：DNA復(fù) 制 ： 半 保 留 復(fù) 制 ；DNA的 熱 變 性 原 理 。Taq DNA聚 合 酶 v耐 高 溫 。 【 基 礎(chǔ) 知 識 】一 、 PCR原 理 ：DNA復(fù) 制 ： 半 保 留 復(fù) 制 ；v需 要 提 供 合 成 模 板 ； v不 能 起 始 新 的 DNA鏈 ， 必 須 要 有 引 物 提 供 3 -OH；v合 成 的 方 向 都 是 5 3 。 DNA聚 合 酶 【 基 礎(chǔ) 知 識 】二 、 PCR條 件 ：胞 內(nèi) DNA復(fù) 制 與 PCR技 術(shù) 的 比 較 ：胞 內(nèi) DNA復(fù) 制 PCR解 旋 解 旋 酶 ， 邊 解 旋 邊 復(fù) 制酶 解 旋 酶 /DNA聚 合 酶模 板 DNA母 鏈引 物 RNA能 量 +原 料 dNTP溫 度 最 適 溫 度緩 沖 液 Mg 2+,緩 沖 對子 鏈 合 成 半 不 連 續(xù) 復(fù) 制 變 性Taq DNA聚 合 酶DNA母 鏈dNTP3個 溫 度Mg2+,緩 沖 對連 續(xù) 復(fù) 制DNA 【 基 礎(chǔ) 知 識 】二 、 PCR條 件 ：引 物 ：v引 物 設(shè) 計 的 原 則 ：決 定 PCR擴(kuò) 增 產(chǎn) 物 的 特 異 性 和 長 度 。1.引 物 長 度 ： 通 常 為 20 30bp， 盡 量 降 低 引 物 與 非 擴(kuò)增 區(qū) 的 同 源 性 ；2.引 物 內(nèi) 部 不 能 存 在 部 分 互 補(bǔ) 序 列 ；3.兩 個 引 物 之 間 不 能 存 在 部 分 互 補(bǔ) 序 列 ； 例 題 1【 20 1年 安 徽 】 家 蠶 細(xì) 胞 具 有 高 效 表 達(dá) 外 源 基 因 能 力 。 將 人 干 擾 素基 因 導(dǎo) 入 家 蠶 細(xì) 胞 并 大 規(guī) 模 培 養(yǎng) ， 可 以 提 取 干 擾 素 用 于 制 藥 。 采 用 PCR技 術(shù) 可 驗 證 干 擾 素 基 因 是 否 已 經(jīng) 導(dǎo) 入 家 蠶 細(xì) 胞 。 該 PCR反 應(yīng) 體 系 的 主 要 成 分 應(yīng) 該 包 含 ： 擴(kuò) 增 緩 沖 液 （ 含 Mg2+） 、 水 、 4種 脫氧 核 糖 核 苷 酸 、 模 板 DNA、 和 。 對 干 擾 素 基 因 特 異 的 DNA引 物 對Taq DNA聚 合 酶 例 題 2【 2011年 江 蘇 】 請 回 答 基 因 工 程 方 面 的 有 關(guān) 問 題 ： （ 1） 設(shè) 計 引 物 是 PCR技 術(shù) 關(guān) 鍵 步 驟 之 一 。 某 同 學(xué) 設(shè) 計 的 兩 組 引 物 （只 標(biāo) 注 了 部 分 堿 基 序 列 ） 都 不 合 理 （ 如 下 圖 ） ， 請 分 別 說 明 理 由 。 第 一 組 ： ； 第 二 組 ： 。引 物 和 引 物 局 部 發(fā) 生 堿 基 互 補(bǔ) 配 對 而 失 效引 物 自 身 折 疊 后 會 出 現(xiàn) 局 部 堿 基 互 補(bǔ) 配 對 而 失 效（ 2） PCR反 應(yīng) 體 系 中 含 有 熱 穩(wěn) 定 DNA聚 合 酶 ， 下 面 的 表 達(dá) 式 不 能 正確 反 映 DNA聚 合 酶 的 功 能 ， 這 是 因 為 。 DNA聚 合 酶 只 能 將 單 個 脫 氧 核苷 酸 連 續(xù) 結(jié) 合 到 雙 鏈 DNA片 段 的 引 物 鏈 上 【 基 礎(chǔ) 知 識 】二 、 PCR條 件 ：溫 度 ：v70 75 ：v90 95 ：v55 60 ： 變 性 ；復(fù) 性 ； 延 伸 。 【 注 意 】 具 體 溫 度 與 DNA母 鏈及 引 物 中 的 G、 C含 量 有 關(guān) 。 例 題 3【 2008年 江 蘇 】 回 答 下 列 問 題 。（ 1） 在 采 用 常 規(guī) PCR方 法 擴(kuò) 增 目 的 基 因 的 過 程 中 ， 使 用 的 DNA聚 合酶 不 同 于 一 般 生 物 體 內(nèi) 的 DNA聚 合 酶 ， 其 最 主 要 的 特 點 是 。（ 2） PCR過 程 中 退 火 （ 復(fù) 性 ） 溫 度 必 須 根 據(jù) 引 物 的 堿 基 數(shù) 量 和 種類 來 設(shè) 定 。 表 1為 根 據(jù) 模 板 設(shè) 計 的 兩 對 引 物 序 列 ， 圖 2為 引 物 對 與模 板 結(jié) 合 示 意 圖 。 請 判 斷 哪 一 對 引 物 可 采 用 較 高 的 退 火 溫 度 ？ 。 耐 高 溫 引 物 對 B 【 基 礎(chǔ) 知 識 】三 、 PCR過 程 ：預(yù) 變 性 ；復(fù) 性 ；延 伸 ；循 環(huán) 。變 性 ； 【 2011年 江 蘇 】 利 用 PCR技 術(shù) 擴(kuò) 增 目 的 基 因 ， 其 原 理 與 細(xì) 胞 內(nèi)DNA復(fù) 制 類 似 （ 如 下 圖 所 示 ） 。 圖 中 引 物 中 為 單 鏈 DNA片 段 ， 它是 子 鏈 合 成 延 伸 的 基 礎(chǔ) 。（ 1） 從 理 論 上 推 測 ， 第 四 輪 循 環(huán) 產(chǎn) 物 中 含 有 引 物 A的 DNA片 段 所占 比 例 為 。（ 2） 在 第 輪 循 環(huán) 產(chǎn) 物 中 開 始 出 現(xiàn) 兩 條 脫 氧 核 苷 酸 鏈 等 長 的DNA片 段 。 15/16三例 題 4 【 2011年 北 京 】 根 據(jù) T-DNA的 已 知 序 列 ， 利 用 PCR技 術(shù) 可 以 擴(kuò) 增 出被 插 入 的 基 因 片 段 。 如 下 圖 ， 從 圖 中 A、 B、 C、 D四 種 單 鏈 DNA片 段中 選 取 作 為 引 物 進(jìn) 行 擴(kuò) 增 ， 得 到 的 片 段 將 用 于 獲 取 該 基 因的 全 序 列 信 息 。B、 C例 題 5 【 實 驗 操 作 】一 、 實 驗 儀 器 ： 二 、 設(shè) 置 對 照 ：【 實 驗 操 作 】三 、 程 序 設(shè) 計 ： 避 免 外 源 DNA的 污 染 。 【 實 驗 操 作 】微 量 離 心 管 、 槍 頭 、 緩 沖 液 以 及 蒸 餾 水 等 在 使 用 前必 須 進(jìn) 行 高 壓 滅 菌 ； 微 量 離 心 管 在 每 吸 取 一 種 試 劑 都 必 須 更 換 槍 頭 ； 所 有 的 成 分 加 入 離 心 管 后 ， 蓋 嚴(yán) 蓋 子 ， 用 手 指 輕 輕彈 擊 管 的 側(cè) 壁 ， 離 心 10s， 使 反 應(yīng) 液 集 中 在 離 心 管 底部 ， 再 放 入 PCR儀 中 進(jìn) 行 反 應(yīng) 。 四 、 操 作 提 示 ： 【 實 際 應(yīng) 用 】一 、 遺 傳 疾 病 的 診 斷 ：二 、 刑 偵 破 案 ；三 、 古 生 物 學(xué) ；四 、 基 因 克 隆 ：五 、 DNA序 列 測 定 。v基 因 診 斷 ；