第 二 節(jié) 脫 毒 種 苗 生 產(chǎn) 及 病 毒 檢 測 技 術(shù) 一 、 脫 毒 的 意 義 ： 無 性 繁 殖 作 物 長 期 營 養(yǎng) 繁 殖 ， 易 受 病 毒 侵 染 ， 而 使 病毒 在 體 內(nèi) 積 累 ， 導(dǎo) 致 種 性 退 化 ， 造 成 產(chǎn) 量 下 降 或 品 質(zhì) 降 低甚 至 死 亡 ， 給 農(nóng) 業(yè) 造 成 巨 大 損 失 。 通 過 莖 尖 培 養(yǎng) 獲 得 無 病 毒 種 苗 ， 對 退 化 品 種 進(jìn) 行 提 純 復(fù)壯 。 提 高 產(chǎn) 量 和 品 質(zhì) ， 如 馬 鈴 薯 脫 毒 可 提 高 產(chǎn) 量 30-60%,提高 了 經(jīng) 濟(jì) 效 益 。 此 外 ， 由 于 減 少 農(nóng) 藥 使 用 ， 可 以 保 護(hù) 生 態(tài)環(huán) 境 。 脫 毒 技 術(shù) 主 要 應(yīng) 用 于 各 種 無 性 繁 殖 植 物 ， 如 草 莓 、 馬鈴 薯 、 甘 薯 、 蘋 果 、 香 蕉 、 甘 蔗 等 。 二 、 脫 毒 方 法 ：（ 一 ） 莖 尖 分 生 組 織 培 養(yǎng) 脫 毒 ：1. 脫 毒 原 理 ： 病 毒 在 植 物 體 內(nèi) 的 分 布 不 均 勻 ， 越 靠 近頂 端 區(qū) 域 ， 帶 毒 越 少 ， 頂 端 分 生 組 織 （ 0.2-0.5 mm） 不 帶病 毒 或 含 病 毒 量 極 低 。 因 此 ， 分 離 分 生 組 織 細(xì) 胞 進(jìn) 行 培養(yǎng) ， 可 以 獲 得 無 病 毒 種 苗 。 2. 莖 尖 分 生 組 織 培 養(yǎng) 脫 毒 的 基 本 程 序 ： 一 般 包 括 培 養(yǎng) 基 選 擇 和 制 備 、 帶 脫 毒 材 料 的 表 面 、 滅菌 、 莖 尖 分 生 組 織 分 離 、 接 種 和 培 養(yǎng) 、 誘 導(dǎo) 芽 分 化 和 小植 株 增 殖 、 誘 導(dǎo) 生 根 、 馴 化 移 栽 等 環(huán) 節(jié) 。 莖 尖 分 生 組 織 的 分 離 需 要 在 超 凈 工 作 臺 上 借 助 體 視 顯微 鏡 進(jìn) 行 。 莖 尖 放 在 培 養(yǎng) 皿 內(nèi) 進(jìn) 行 解 剖 ， 一 只 手 用 鑷 子固 定 ， 另 一 手 用 解 剖 針 將 葉 片 和 葉 原 基 層 層 剝 掉 ， 當(dāng) 露出 半 圓 形 頂 端 分 生 組 織 時 ， 將 分 生 組 織 切 下 ， 接 種 與 培養(yǎng) 基 上 。 virus-freetissuevirus particlesfound here 3. 脫 毒 效 果 與 莖 尖 大 小 的 關(guān) 系 ： 脫 毒 效 果 和 莖 尖 分 生 組 織 大 小 直 接 相 關(guān) ， 莖 尖 分 生 組織 越 小 ， 脫 毒 率 越 高 ， 但 生 長 速 度 慢 。 如 草 莓 莖 尖 切 取0.2-0.3mm時 ， 脫 毒 率 達(dá) 到 100%， 而 切 取 1.0mm時 ， 脫毒 率 為 50%。 因 此 ， 脫 毒 培 養(yǎng) 時 ， 需 要 兼 顧 脫 毒 率 、 成活 率 及 莖 尖 發(fā) 育 成 完 整 植 株 的 能 力 。 既 要 脫 除 病 毒 ， 也要 使 莖 尖 分 生 組 織 迅 速 生 長 發(fā) 育 。 一 般 莖 尖 分 生 組 織 大小 以 0.2-0.5mm為 適 宜 。 （ 二 ） 微 體 嫁 接 脫 毒 ： 微 體 嫁 接 是 在 無 菌 條 件 下 ， 將 極 小 (0.2mm） 的 莖 尖 嫁接 到 試 管 內(nèi) 的 無 菌 實 生 苗 砧 木 上 ， 經(jīng) 培 養(yǎng) ， 待 接 口 愈 合 發(fā)育 為 完 整 植 株 而 達(dá) 到 脫 毒 的 效 果 。 該 方 法 已 在 柑 橘 、 蘋 果 、葡 萄 、 山 茶 等 園 藝 植 物 中 應(yīng) 用 。 微 體 嫁 接 1. 微 體 嫁 接 的 方 法 ：（ 1） 試 管 砧 木 的 準(zhǔn) 備 :將 無 病 毒 種 子 表 面 滅 菌 后 接 種 與 MS培 養(yǎng)基 ， 黑 暗 條 件 下 培 養(yǎng) 15d使 其 發(fā) 芽 。（ 2） 莖 尖 嫁 接 ： 在 超 凈 工 作 臺 上 ， 將 幼 苗 的 上 胚 軸 和 子 葉 去 掉 ，根 系 截 短 ， 在 離 上 胚 軸 頂 端 越 0.5cm處 斜 向 下 切 一 深 達(dá) 木 質(zhì)部 ， 長 2-3cm的 切 口 ， 在 斜 切 口 末 端 橫 切 一 刀 ， 用 去 掉 切 下部 分 。 在 體 視 顯 微 鏡 下 ， 從 待 脫 毒 樣 品 上 切 取 0.2mm的 莖 尖分 生 組 織 ， 小 心 放 于 切 口 的 水 平 面 上 ， 切 面 向 下 并 與 砧 木 切口 形 成 層 組 織 緊 密 貼 合 ， 然 后 接 于 培 養(yǎng) 基 上 。（ 3） 嫁 接 苗 培 養(yǎng) ： 將 嫁 接 苗 置 于 光 下 培 養(yǎng) ， 光 照 時 數(shù) 16h， 嫁接 1周 后 形 成 愈 傷 組 織 ， 2-3周 愈 合 ， 5-6周 后 接 穗 發(fā) 育 為 新梢 。 2. 微 體 嫁 接 脫 毒 的 關(guān) 鍵 ： 影 響 微 體 嫁 接 成 活 率 的 主 要 因 素 為 接 穗 大 小 和 取 樣 時 間 。與 接 穗 大 小 呈 正 相 關(guān) ， 而 無 病 毒 植 株 獲 得 與 接 穗 莖 尖 的 大小 呈 負(fù) 相 關(guān) 。 莖 尖 分 生 組 織 小 于 0.2mm可 以 脫 除 多 數(shù) 病 毒 ，春 季 取 材 嫁 接 的 成 活 率 高 于 其 他 季 節(jié) 。 （ 3） 熱 處 理 脫 毒 ： 通 過 熱 處 理 可 以 由 受 病 毒 侵 染 的 個 體 得 到 無 病 毒 植 株 ，其 原 理 是 利 用 病 毒 與 植 物 的 耐 熱 性 不 同 ， 在 高 于 常 溫 的 環(huán)境 下 ， 植 物 組 織 中 的 病 毒 受 熱 后 可 被 部 分 或 全 部 鈍 化 或 失去 活 性 ， 而 寄 主 植 物 組 織 很 少 或 不 會 受 到 傷 害 。 或 高 溫 下植 物 生 長 快 ， 而 病 毒 增 殖 慢 而 使 植 物 新 生 部 分 不 帶 病 毒 。 1.熱 處 理 脫 毒 方 法 ： 可 以 通 過 溫 湯 浸 漬 或 熱 空 氣 處 理 法 脫 毒 ， 前 者 對 休 眠 芽效 果 較 好 ， 后 者 對 活 躍 生 長 的 莖 尖 效 果 較 好 。 熱 空 氣 處 理 即 把 旺 盛 生 長 的 植 物 移 入 熱 療 室 ， 在 35-40 下 處 理 一 定 時 間 （ 幾 分 鐘 到 數(shù) 周 ） 熱 處 理 后 將 莖 尖 切下 嫁 接 于 無 病 毒 砧 木 或 進(jìn) 行 組 織 培 養(yǎng) 。 熱 處 理 溫 度 應(yīng) 逐 步升 高 ， 直 到 要 求 溫 度 。 溫 湯 浸 漬 的 材 料 常 用 50-55 處 理 10-50min或 35 溫水 處 理 30-40min。 2. 熱 處 理 脫 毒 條 件 ：（ 1） 溫 度 和 持 續(xù) 時 間 ： 因 病 毒 種 類 而 異 ， 有 些 33-34 處理 28-33d即 可 脫 毒 ， 而 有 些 必 須 在 39-42 處 理 50-60d，耐 熱 桿 狀 病 毒 熱 處 理 脫 毒 效 果 差 。 在 植 物 的 耐 熱 范 圍 內(nèi) ，溫 度 越 高 ， 脫 毒 效 果 越 好 。 一 般 采 用 35-38 .尤 其 37恒 溫 處 理 30 2天 為 普 遍 。 也 可 采 用 高 低 溫 處 理 減 少 對 植 物的 損 傷 。 如 馬 鈴 薯 40 （ 4h） +16-20 （ 20h） 。（ 2） 濕 度 和 光 照 ： 濕 度 以 70-80%為 適 宜 。 光 照 以 自 然 光最 好 。（ 3） 前 處 理 ： 27-35 1-2周 。 （ 四 ） 其 他 脫 毒 方 法 ：1. 花 器 官 培 養(yǎng) 脫 毒 ： 由 植 物 的 花 器 官 培 養(yǎng) 脫 分 化 形 成 愈 傷組 織 ， 然 后 再 分 化 不 定 芽 ， 可 以 獲 得 無 毒 苗 。 如 草 莓 花藥 培 養(yǎng) 。2. 珠 心 胚 培 養(yǎng) 脫 毒 ： 柑 橘 類 珠 心 胚 與 微 管 組 織 沒 有 聯(lián) 系 ， 一般 不 帶 毒 ， 可 以 利 用 珠 心 胚 進(jìn) 行 培 養(yǎng) 獲 得 。3.化 學(xué) 脫 毒 :采 用 病 毒 唑 等 試 劑 處 理 材 料 或 添 加 到 培 養(yǎng) 基 中 可以 鈍 化 病 毒 ， 達(dá) 到 一 定 的 脫 毒 效 果 。4. 超 低 溫 處 理 脫 毒 :經(jīng) 過 冷 凍 保 護(hù) 劑 處 理 過 的 莖 尖 材 料 ， 采 用液 氮 處 理 （ -196 ） 可 以 鈍 化 病 毒 ， 達(dá) 到 脫 毒 效 果 ， 該 方法 已 在 香 蕉 等 果 樹 中 成 功 應(yīng) 用 。5. 合 并 熱 處 理 、 莖 尖 培 養(yǎng) 或 微 嫁 接 脫 毒 ： 采 用 多 種 方 法 同 時處 理 可 以 達(dá) 到 更 好 的 脫 毒 效 果 。 二 、 病 毒 檢 測 方 法 ： 1、 形 態(tài) 鑒 定 ： 根 據(jù) 植 株 的 生 長 狀 態(tài) 鑒 定 是 否脫 毒 ， 但 不 準(zhǔn) 確 。 2、 指 示 植 物 鑒 定 法 ： 利 用 特 定 的 易 于 感 染 某 些病 毒 的 指 示 植 物 的 特 征 進(jìn) 行 病 毒 鑒 定 。 指 示 植 物 CMV病 毒 感 染 的 植 株 葉 片 3、 抗 血 清 鑒 定 法 ： 利 用 抗 原 和 抗 體 的 特 異 性 反 應(yīng) 原 理進(jìn) 行 病 毒 鑒 定 。 用 已 知 病 毒 的 抗 血 清 （ antiserum） 鑒定 未 知 病 毒 。 近 年 來 又 在 此 基 礎(chǔ) 上 發(fā) 展 出 酶 聯(lián) 免 疫 法 （ Enzyme Linked Immunosorbent Assay， ELISA） ， 方 法 是 將 抗原 固 定 在 支 持 物 上 ， 加 入 待 檢 血 清 ， 然 后 加 入 酶 （ 過 氧化 物 酶 或 堿 性 磷 酸 酶 ） 標(biāo) 記 的 抗 體 ， 使 待 檢 血 清 與 對 應(yīng)抗 原 的 特 異 性 抗 體 結(jié) 合 ， 最 后 用 分 光 光 度 計 進(jìn) 行 診 斷 。 酶 聯(lián) 免 疫 法 進(jìn) 行 病 毒 鑒 定 4、 電 子 顯 微 鏡 檢 測 （ Electronmicroscope） ： 采 用 電子 顯 微 鏡 對 病 毒 的 薄 樣 品 （ 約 1 100um） 或 純 化 的病 毒 懸 液 中 進(jìn) 行 病 毒 的 直 接 觀 察 。5、 RT PCR檢 測 （ Reverse TranscriptionPolymerase Chain Reaction） ： RT-PCR是 將 RNA模 板 的反 轉(zhuǎn) 錄 （ RT） ,和 cDNA的 聚 合 酶 鏈 式 擴 增 （ PCR） 相 結(jié)合 的 技 術(shù) 。 RT-PCR技 術(shù) 靈 敏 而 且 用 途 廣 ， 可 用 于 檢 測病 毒 DNA的 轉(zhuǎn) 錄 產(chǎn) 物 ， 分 析 表 達(dá) 的 水 平 。 該 方 法 已 用 于大 蒜 脫 毒 苗 檢 測 。 四 、 無 毒 苗 的 保 存 與 繁 殖 ：（ 一 ） 無 毒 苗 的 保 存 ： 無 毒 苗 木 需 在 隔 離 條 件 下 保 存 以 防 止 再 度 感 染 病 毒 ， 一般 在 專 用 的 防 蟲 網(wǎng) 室 進(jìn) 行 培 養(yǎng) ， 或 者 在 離 體 條 件 下 保 存 。（ 二 ） 無 毒 苗 的 繁 殖 ：1.無 毒 苗 的 繼 代 培 養(yǎng) 與 快 速 繁 殖 可 采 用 不 定 芽 或 叢 生 芽 等 途 徑 進(jìn) 行 無 毒 苗 的 快 繁 。2. 無 毒 苗 的 生 根 及 微 型 鱗 莖 的 培 養(yǎng) 生 長 至 1.0-1.5 cm的 無 毒 苗 接 種 于 生 根 培 養(yǎng) 基 誘 導(dǎo) 生 根 或在 誘 導(dǎo) 試 管 鱗 莖 、 試 管 種 薯 等 培 養(yǎng) 基 上 誘 導(dǎo) 形 成 脫 毒 鱗 莖 、脫 毒 種 薯 等 繁 殖 材 料 。 2010312