第 四 章 莖 尖 分 生 組 織 培 養(yǎng) 及 脫 毒 苗 生 產(chǎn) 一 、 概 念 和 意 義 1.概 念莖 尖 分 生 組 織 培 養(yǎng) ： 指 對(duì) 不 超 過(guò) 0.1mm的 莖 尖或 幾 十 微 米 的 莖 尖 進(jìn) 行 的 培 養(yǎng) 。特 點(diǎn) ： 可 獲 無(wú) 病 毒 苗 ， 操 作 困 難 ， 成 苗 時(shí) 間 長(zhǎng) 。 普 通 莖 尖 培 養(yǎng) ： 對(duì) 幾 毫 米 至 幾 十 毫 米 長(zhǎng) 的 莖尖 、 芽 尖 及 側(cè) 芽 的 培 養(yǎng) 。 操 作 技 術(shù) 簡(jiǎn) 單 、 易成 活 、 成 苗 時(shí) 間 短 、 繁 殖 速 度 快 。 第 一 節(jié) 莖 尖 分 生 組 織 培 養(yǎng) 莖 尖 分 生 組 織 培 養(yǎng) 除 可 以 生 產(chǎn) 脫 毒 苗 外 ， 還 具 有方 法 簡(jiǎn) 便 ， 繁 殖 迅 速 ， 遺 傳 性 比 較 穩(wěn) 定 ， 易 保 持 植 株的 優(yōu) 良 性 狀 的 優(yōu) 點(diǎn) ， 在 基 礎(chǔ) 理 論 研 究 和 實(shí) 際 應(yīng) 用 中 具有 重 要 價(jià) 值 。2.意 義 ：1.形 態(tài) 建 成 研 究 2.用 于 無(wú) 病 株 生 產(chǎn) 3.進(jìn) 行 營(yíng) 養(yǎng) 繁 殖 4.育 種 中 的 應(yīng) 用 l二 、 莖 尖 分 生 組 織 培 養(yǎng) 一 般 方 法1.材 料 的 制 備 健 壯 枝 梢 去 除 葉 片 分 成 1-2cm 自 來(lái) 水沖 洗 消 毒 75%的 酒 精 30秒 0.1%升 汞 或20倍 次 氯 酸 鈉 消 毒 8-10min 無(wú) 菌 水 修 剪剝 離 莖 尖 ， 通 常 切 割 下 頂 端 0.20.5 mm葉 原 基 的 莖 尖 （ 無(wú) 菌 水 ） 接 種 。 2.培 養(yǎng) 基 多 為 MS培 養(yǎng) 基 及 其 改 良 配 方 ， 還 有 White、B5等 。3.培 養(yǎng) 條 件（ 1） 溫 度 ： 26 28（ 2） 光 照 ： 光 培 養(yǎng) 的 效 果 通 常 比 暗 培 養(yǎng) 好 。（ 3） 濕 度 ： 與 其 他 器 官 培 養(yǎng) 相 似 。 一 、 病 毒 的 危 害 多 數(shù) 栽 培 植 物 ， 尤 其 無(wú) 性 繁 殖 植 物 ， 都 易 受到 一 種 或 幾 種 ， 甚 至 幾 十 種 病 毒 的 侵 染 。 例 如 ， 草莓 感 染 60多 種 病 毒 。 并 且 隨 著 栽 培 時(shí) 間 的 推 移 ， 侵染 病 毒 的 種 類(lèi) 越 來(lái) 越 多 。 受 病 毒 侵 染 的 植 物 生 長(zhǎng) 緩 慢 、 畸 形 、 產(chǎn) 量 大 幅度 下 降 ， 品 質(zhì) 變 劣 ， 甚 至 完 全 喪 失 商 品 價(jià) 值 。 因 此說(shuō) ， 病 毒 帶 來(lái) 極 大 的 危 害 。第 二 節(jié) 脫 毒 苗 的 培 育 和 病 毒 檢 測(cè) l 目 前 ， 對(duì) 細(xì) 菌 和 真 菌 侵 染 的 病 害 ， 可 以 通 過(guò) 藥 物 處理 達(dá) 到 治 愈 的 目 的 ， 如 多 菌 靈 等 。 但 目 前 ， 還 沒(méi) 有藥 物 能 治 病 毒 病 。l 種 子 一 般 不 帶 病 毒 ， 種 子 繁 殖 植 物 可 以 得 到 無(wú) 菌 植株 。 但 對(duì) 于 無(wú) 性 繁 殖 植 物 ， 必 須 采 用 一 種 有 效 的 方法 ， 脫 去 病 毒 ， 才 能 達(dá) 到 提 高 產(chǎn) 量 和 質(zhì) 量 的 目 的 。 l二 、 病 毒 侵 染 的 特 點(diǎn)l 早 在 40年 代 ， 就 有 科 學(xué) 家 (White等 )發(fā) 現(xiàn) 病 毒 在根 上 和 莖 上 的 分 布 是 不 均 勻 的 ， 離 根 尖 和 莖 尖 越近 ， 病 毒 的 密 度 越 低 。 反 之 ， 越 高 。 即 病 毒 在 植物 體 內(nèi) 的 分 布 是 不 均 勻 的 ， 分 生 組 織 一 般 無(wú) 病 毒侵 染 。 l分 生 組 織 之 所 以 能 避 開(kāi) 病 毒 侵 染 ， 可 能 有 4方 面原 因 ：l1、 在 植 物 體 中 ， 病 毒 的 移 動(dòng) 主 要 靠 兩 條 途 徑 ，一 是 通 過(guò) 維 管 系 統(tǒng) ， 而 分 生 組 織 中 尚 未 形 成 維管 系 統(tǒng) ； 二 是 通 過(guò) 胞 間 連 絲 ， 但 這 條 途 徑 病 毒移 動(dòng) 速 度 非 常 緩 慢 ， 難 以 追 趕 上 活 躍 生 長(zhǎng) 的 莖尖 和 根 尖 。 l2、 在 旺 盛 分 裂 的 分 生 組 織 中 ， 代 謝 活 動(dòng) 很 高 ，使 病 毒 無(wú) 法 進(jìn) 行 復(fù) 制 。 l3、 在 莖 尖 中 存 在 高 水 平 內(nèi) 源 激 素 ， 可 以 抑 制病 毒 的 增 殖 。l4、 在 植 物 體 內(nèi) 存 在 有 一 種 “ 病 毒 鈍 化 系 統(tǒng) ” ，它 在 分 生 組 織 中 的 活 性 應(yīng) 最 高 ， 因 而 使 分 生組 織 不 受 侵 染 。 l 以 上 是 四 種 可 能 原 因 ， 無(wú) 論 哪 種 說(shuō)法 正 確 ， 事 實(shí) 是 分 生 組 織 一 般 不 帶 病 毒 。因 此 ， 利 用 這 一 原 理 ， 進(jìn) 行 莖 尖 培 養(yǎng) ，培 育 無(wú) 病 毒 苗 。 植 物 脫 病 毒 方 法物 理 方 法 化 學(xué) 方 法 生 物 方 法高 溫 處 理 莖 尖 培 養(yǎng) 微 體 嫁 接珠 心 培 養(yǎng) 愈 傷 脫 毒熱 處 理 脫 毒 l（ 一 ） 熱 處 理 脫 毒 法l 熱 處 理 脫 毒 原 理l 病 毒 DNA分 子 進(jìn) 入 細(xì) 胞 后 隨 植 物 細(xì) 胞 DNA一起 復(fù) 制 。l 熱 處 理 并 不 能 殺 死 病 毒 ， 只 能 鈍 化 病 毒 活 性 ，使 病 毒 在 植 物 體 內(nèi) 增 殖 減 緩 或 增 殖 停 止 ， 失 去 傳染 能 力 。l 作 為 一 種 物 理 效 應(yīng) 可 以 加 速 植 物 細(xì) 胞 的 分 裂 ，使 植 物 細(xì) 胞 在 與 病 毒 繁 殖 的 競(jìng) 爭(zhēng) 中 取 勝 。 l 具 體 方 法 ：l 第 一 ， 熱 水 浸 泡 處 理 ， 適 用 于 切 下 的 材 料 ， 在 50度左 右 的 溫 水 中 浸 漬 數(shù) 分 鐘 至 數(shù) 小 時(shí) ， 方 法 簡(jiǎn) 便 易 行但 材 料 易 受 傷 。l 第 二 ， 熱 風(fēng) 處 理 ， 將 生 長(zhǎng) 的 盆 栽 植 物 移 入 室 內(nèi) 或 生長(zhǎng) 箱 內(nèi) ， 處 理 溫 度 因 植 物 種 類(lèi) 、 生 理 狀 況 而 異 。 一般 為 3540度 ， 短 則 幾 十 分 鐘 ， 長(zhǎng) 達(dá) 數(shù) 月 。 l 熱 處 理 的 優(yōu) 缺 點(diǎn)l 優(yōu) 點(diǎn) : 方 法 簡(jiǎn) 單 ， 效 果 明 顯 。l 缺 點(diǎn) : l 1)具 有 局 限 性 ， 不 能 去 除 所 有 病 毒 。 只 對(duì) 圓 形病 毒 （ 蘋(píng) 果 花 葉 病 毒 ） ， 或 對(duì) 線 狀 病 毒 （ 馬 鈴薯 卷 葉 病 毒 ） 有 效 ； 而 對(duì) 桿 狀 病 毒 （ 千 日 紅 病毒 ） 無(wú) 效 。l 2)熱 處 理 后 只 有 小 部 分 植 株 能 夠 存 活 。 極 易 使植 物 材 料 受 熱 枯 死 ， 造 成 損 失l 3） 延 長(zhǎng) 熱 處 理 時(shí) 間 ， 病 毒 鈍 化 效 果 好 ， 同 時(shí)也 可 能 會(huì) 鈍 化 植 物 組 織 中 的 抗 性 因 子 而 降 低 處理 效 果 。 其 它 效 果 香 石 竹 （ 康 乃 馨 ） 在 38 40 下 經(jīng) 兩 個(gè)月 處 理 可 除 去 全 部 病 毒 。 馬 鈴 薯 在 37 下 處 理 10 20天 能 除 去 卷葉 病 毒 。 l（ 二 ） 莖 尖 培 養(yǎng) 脫 毒 l 1.莖 尖 培 養(yǎng) 脫 毒 的 原 理 l （ 1） 病 毒 在 植 物 體 內(nèi) 的 分 布 l 病 毒 濃 度 不 同 ， 離 尖 端 越 遠(yuǎn) 病 毒 濃 度 越 高 。 莖 尖或 根 尖 離 體 培 養(yǎng) 便 可 獲 得 無(wú) 病 毒 再 生 植 株 。l 必 須 指 出 的 是 ， 所 謂 無(wú) 病 毒 ， 只 是 相 對(duì) 的 ， 不 是絕 對(duì) 的 。l （ 2） 莖 尖 大 小 與 脫 毒 l 莖 尖 外 植 體 的 大 小 與 脫 毒 效 果 成 反 比 。 莖 尖 分 生組 織 不 能 合 成 自 身 需 要 ， 生 長(zhǎng) 素 ， 細(xì) 胞 分 裂 素 ，因 而 帶 葉 原 基 的 莖 尖 生 長(zhǎng) 快 ， 成 苗 率 高 。 因 此 莖尖 越 大 培 養(yǎng) 成 活 率 越 高 。 因 此 對(duì) 不 同 植 物 脫 毒 適宜 的 莖 尖 大 小 不 同 。 2.莖 尖 培 養(yǎng) 脫 毒 的 方 法（ 1） 取 樣 與 消 毒可 直 接 選 定 的 植 株 上 取 頂 芽 進(jìn) 行 消 毒 接 種 。采 頂 芽 與 側(cè) 芽 消 毒 接 種 。 消 毒 方 法 是 ： 剪 取 頂 芽 梢 段 3、 5厘 米 ， 剝 去大 葉 片 ， 用 自 來(lái) 水 沖 洗 干 凈 ， 在 75%酒 精 中浸 泡 30秒 左 右 ， 用 1%-3次 氯 酸 鈉 或 5%-7%的 漂 白 粉 溶 液 消 毒 10-20分 ， 最 后 用 無(wú) 菌 水沖 洗 材 料 4-5次 。 （ 2） 接 種 材 料 置 10 40倍 的 雙 筒 解 剖 鏡 下 ， 解剖 刀 切 取 0.1 0.3mm帶 有 1 2個(gè) 葉原 基 的 莖 尖 ， 接 種 到 培 養(yǎng) 基 上 。 （ 3） 培 養(yǎng) 接 種 后 材 料 置 25+2 ， 光 照 度 1500-5000LX， 每 日光 照 10-16h條 件 下 培 養(yǎng) 。 但 一 般 光 照 培 養(yǎng) 比 暗 培養(yǎng) 效 果 好 。 其 間 應(yīng) 更 換 新 鮮 培 養(yǎng) 基 。 提 高 培 養(yǎng) 基中 BA的 濃 度 可 形 成 大 量 從 生 芽 。3.培 養(yǎng) 基 與 培 養(yǎng) 方 式 ：（ 1） 培 養(yǎng) 基 ： 常 用 MS， White等 培 養(yǎng) 基 。（ 2） 培 養(yǎng) 方 式 ： 莖 尖 培 養(yǎng) 一 般 采 用 半 固 體 培養(yǎng) 基 l（ 三 ） 、 熱 處 理 與 莖 尖 培 養(yǎng) 結(jié) 合 脫 毒l 果 樹(shù) 等 木 本 植 物 ， 熱 處 理 后 新 芽 頂 端 嫁 接 成 活 率 較低 。l 莖 尖 培 養(yǎng) 時(shí) ， 莖 尖 過(guò) 小 成 活 率 太 低 ， 而 莖 尖 太 大 又脫 除 不 掉 病 毒l 將 熱 處 理 后 的 較 大 莖 尖 進(jìn) 行 培 養(yǎng) 獲 得 無(wú) 病 毒 植 株 ，可 以 克 服 這 些 缺 點(diǎn) 。 （ 四 ） 微 體 嫁 接 離 體 培 養(yǎng) 脫 毒 法應(yīng) 用 微 體 嫁 接 的 原 因 ：木 本 植 物 莖 尖 培 養(yǎng) 難 以 生 根 形 成 植 株 。具 體 做 法 ： 將 極 小 的 莖 尖 （ 0.1mm0.2mm） 作 為 接 穗 嫁 接 到 不帶 病 毒 的 種 子 實(shí) 生 苗 砧 木 上 ， 然 后 將 砧 木 、 接 穗 一 起在 培 養(yǎng) 基 上 培 養(yǎng) 。優(yōu) 點(diǎn) ： 接 穗 在 砧 木 上 易 成 活 ， 故 可 用 很 小 的 莖 尖 來(lái) 培養(yǎng) ， 去 除 病 毒 幾 率 大 ， 獲 得 無(wú) 病 毒 苗 的 可 能 性 大 。 微 嫁 接 要 求 的 剝 離 技 術(shù) 高 ， 嫁 接 成 活 率 與 接 穗 大 小呈 正 相 關(guān) ， 而 脫 毒 率 與 接 穗 大 小 呈 負(fù) 相 關(guān) 脫 除 病 毒 的 關(guān) 鍵 ： 要 求 剝 離 技 術(shù) 很 高 需 要 考 慮 砧 木 和 接穗 對(duì) 營(yíng) 養(yǎng) 組 成 的 不同 要 求 ； 與 接 穗 的 取 材 季 節(jié)有 密 切 關(guān) 系 （ 蘋(píng) 果46月 取 材 嫁 接 成 活率 較 高 。 ） （ 五 ） 無(wú) 病 毒 種 苗 的 保 存 、 應(yīng) 用 及 繁 殖（ 1） 無(wú) 病 毒 原 種 的 保 存 獲 得 無(wú) 毒 原 種 不 易 ， 若 保 存 不 好 會(huì) 很 快 重新 感 染 病 毒 。 為 防 止 再 度 感 染 ， 應(yīng) 在 隔 離 條 件下 保 存 。 若 原 種 保 存 得 好 ， 無(wú) 毒 原 種 可 以 利 用 5-10年 ，在 生 產(chǎn) 上 可 以 創(chuàng) 造 更 多 的 經(jīng) 濟(jì) 效 益 。 1、 隔 離 種 植 保 存 通 過(guò) 無(wú) 毒 原 種 要 在 隔 離 區(qū) 或 隔 蟲(chóng) 網(wǎng) 室 內(nèi) 種 植 保存 。 植 物 病 毒 的 傳 播 媒 介 主 要 是 昆 蟲(chóng) 如 蚜 蟲(chóng) 、 葉 蟬2、 離 體 保 存 脫 毒 苗 經(jīng) 鑒 定 后 ， 選 擇 無(wú) 病 原 種 株 系 ， 回 接 于試 管 內(nèi) ， 可 長(zhǎng) 期 保 存 ， 是 最 理 想 的 保 存 方 法 。 （ 2） 無(wú) 毒 原 種 的 應(yīng) 用 獲 得 無(wú) 毒 原 種 后 ， 一 方 面 要 積 極 進(jìn) 行 無(wú) 毒 苗的 推 廣 ， 另 一 方 面 還 要 做 好 無(wú) 病 毒 種 的 繁 育 。 無(wú) 毒 苗 的 推 廣 應(yīng) 在 發(fā) 展 良 種 的 新 區(qū) 使 用 才 能取 得 良 好 的 效 果 ； 在 老 病 區(qū) 使 用 時(shí) 應(yīng) 實(shí) 行 統(tǒng) 一 的防 治 措 施 ， 一 次 性 全 區(qū) 換 種 ， 才 能 取 得 應(yīng) 有 的 效果 。 （ 3） 無(wú) 病 毒 原 種 的 繁 殖 可 在 無(wú) 毒 源 和 其 他 病 蟲(chóng) 害 的 大 田 中 進(jìn)行 ， 場(chǎng) 地 土 壤 要 進(jìn) 行 消 毒 ， 防 治 蚜 蟲(chóng) 、 線蟲(chóng) 和 其 他 傳 毒 媒 介 ， 并 建 立 一 套 嚴(yán) 格 的 原種 繁 育 制 度 和 栽 培 管 理 制 度 ， 防 止 病 毒 的再 次 感 染 。 四 、 植 物 脫 毒 苗 的 鑒 定1、 視 覺(jué) 觀 察 法 (直 接 檢 測(cè) 法 ) 看 植 株 的 莖 葉 是 否 有 該 病 毒 所 有 可 見(jiàn) 癥 狀 。番茄無(wú)菌小 苗 厚葉蓮花掌 植 物 病 毒 引 起 植 株 的 癥 狀 是 各 異 的 ， 在 觀 賞 植 物 上由 病 毒 引 起 外 部 癥 狀 主 要 有 以 下 幾 種 ：l （ 1） 變 色 ： 褪 綠 、 黃 化 、 花 葉 、 斑 駁 、 紅 葉 等 ， 常 見(jiàn) 病毒 有 ； 香 石 竹 斑 駁 病 毒 、 黃 瓜 花 葉 病 毒 、 芋 花 葉 病 毒 等 。l （ 2） 壞 死 ： 常 見(jiàn) 的 壞 死 是 病 斑 或 斑 點(diǎn) 。 有 輪 斑 、 環(huán) 斑 、條 斑 條 紋 等 。 如 香 石 竹 壞 死 斑 點(diǎn) 病 毒 、 ， 鳳 仙 花 壞 死 斑點(diǎn) 病 毒 草 等 。l （ 3） 畸 形 ： 植 株 可 出 現(xiàn) 矮 縮 、 矮 化 或 葉 片 皺 縮 、 卷 葉 、蕨 葉 等 病 狀 。l （ 4） 萎 蔫 ： 主 要 是 指 植 物 根 或 莖 的 維 管 束 組 織 受 到 破 壞而 發(fā) 生 供 水 不 足 所 出 現(xiàn) 的 凋 萎 現(xiàn) 象 。 2、 生 物 鑒 定 法 (指 示 植 物 indicating Plant法 ) 由 于 采 用 汁 液 接 種 法 比 較 困 難 ， 所 以 通 常 采 用嫁 接 接 種 的 方 法 , 利 用 嫁 接 法 接 種 ， 把 待 測(cè) 的 植 物接 種 在 敏 感 植 物 上 ， 然 后 視 其 有 無(wú) 病 斑 ， 來(lái) 判 斷 是 否脫 除 了 病 毒 。指示植物 接穗 嫁 接 后的 植 物 l 定 義 :將 一 些 對(duì) 病 毒 敏 感 、 癥 狀 特 征 顯 著的 植 物 作 為 指 示 植 物 (又 叫 鑒 別 寄 主 ),利用 病 毒 在 其 他 植 物 上 產(chǎn) 生 的 枯 斑 作 為 鑒別 病 毒 種 類(lèi) 的 方 法 .優(yōu) 點(diǎn) :方 法 簡(jiǎn) 單 靈 敏 準(zhǔn) 確 擦 方 便 ,仍 為 一 種 經(jīng) 濟(jì) 有效 的 方 法缺 點(diǎn) :枯 斑 法 不 能 測(cè) 出 病 毒 總 的 核 蛋 白 濃 度 ,而 只 能測(cè) 出 相 對(duì) 的 感 染 力 小 于 0.1mm的 病毒 顆 粒 用 電 子 顯 微 鏡 直 接觀 察 經(jīng) 脫 毒 培 養(yǎng) 的 葉片 ， 檢 查 是 否 有 的 病毒 粒 子 存 在 ， 還 可 測(cè)量 病 毒 顆 粒 的 大 小 、形 狀 和 結(jié) 構(gòu) 。較 為 先 進(jìn) 的 方 法 ， 但需 一 定 的 設(shè) 備 和 技 術(shù) 4、 酶 聯(lián) 免 疫 法 在 血 清 法 的 基 礎(chǔ) 上 ， 結(jié) 合 酶 反 應(yīng) 發(fā) 展 起 來(lái) 。 在抗 體 上 帶 上 某 種 酶 ， 抗 原 和 抗 體 結(jié) 合 成 的 免 疫復(fù) 合 物 就 有 了 酶 活 性 ， 在 反 應(yīng) 體 系 中 加 入 酶 底物 ， 底 物 在 酶 的 催 化 下 ， 形 成 有 色 反 應(yīng) 物 。 從而 使 檢 測(cè) 的 靈 敏 度 大 大 提 高 。 l 甘 屬 育 苗 取 莖 頂 5cm， 去 掉 老 片 表 面 殺 菌 剝 取 莖 尖 培 養(yǎng) ， MS + 0.2mg/L NAA + 2 mg/L 6-BA 一 個(gè) 月 后 長(zhǎng) 出 不 定 芽 ， 高 于 5cm時(shí) 從 基 部 切下 ， MS基 本 培 養(yǎng) 基 上 長(zhǎng) 大 后 ， 1-2個(gè) 節(jié) 間 一 段 ，新 的 MS基 本 培 養(yǎng) 基 上 繼 代 培 養(yǎng) ， 進(jìn) 行 擴(kuò) 繁 煉 苗 4天 左 右 ， 移 栽 沙 子 中 成 活 后 ， 移 栽 塑 料 棚 ， 再擴(kuò) 繁 田 間 栽 培第 三 節(jié) 以 甘 薯 為 例 介 紹 脫 毒 過(guò) 程