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1、熒 光 原 位 雜 交 技 術 (FISH)在臨 床 病 理 中 的 應 用 與 質(zhì) 控廣 西 至 科 大 學 一 附 院 病 理 科 王 華 熒 光 原 位 雜 交 技 術 (FISH): 用 帶 有 熒 光 素 標 記 的 核 酸 探 針 與 組 織 細胞 中 待 測 的 核 酸 (DNA、 RNA)按 堿 基 配 對的 原 則 進 行 特 異 性 結 合 ， 在 熒 光 顯 微 鏡 下顯 示 細 胞 基 因 狀 態(tài) 的 方 法 。FISH在 臨 床 病 理 中 的 應 用輔 助 病 理 診 斷 、 判 斷 預 后 、 指 導 臨 床 治 療 一 、 常 用 熒 光 素 及 濾 光 片 類

2、 型熒 光 素 顏 色 激 發(fā) 波 長 發(fā) 射 波 長 常 用 濾 光 片Red(紅 色 ) 592 612 Red單 通 道Orange(橙 色 ) 559 588 Orange單 通 道G/O雙 通 道Green(綠 色 ) 497 524 Green單 通 道G/O雙 通 道Aqua(青 藍 色 ) 433 480 Aqua單 通 道DAPI(藍 色 ) 367 452 Blue單 通 道 二 、 常 用 探 針 種 類 單 色 探 針 (single color probe, SC) 雙 色 探 針 (dual color probe, DC) 三 色 探 針 (triple colo

3、r probe, TC) 雙 色 分 離 探 針 (dual color, break apart probe. DC,BCR) 雙 色 單 融 合 探 針 (dual color, single fusion. DC, SF Trans) 額 外 信 號 探 針 (extra signal. ES) 雙 色 雙 融 合 探 針 (dual color,dual fusion probe. DC,DF Trans) 單 色 探 針 (SC)正 常 異 常CEP8 雙 色 探 針 (DC)正 常 異 常HER2 CEP17 三 色 探 針 (TC)正 常 異 常X Y CEP18 雙 色 分 離

4、 探 針 (DC,BCR)正 常 異 常MYC MYC14 18 14 18 雙 色 單 融 合 探 針 (DC, SF Trans)正 常 異 常ABL ABL9 22 9 22BCR BCR 額 外 信 號 探 針 (ES)正 常 異 常ABL ABL9 22 9 22BCR BCR 雙 色 雙 融 合 探 針 ( DC,DF Trans)正 常 異 常IGH IGH14 18 14 18BCL2 BCL2 三 、 FISH檢 測在 常 見 腫 瘤 中 的 應 用 與 意 義 乳 腺 癌探 針 : HER2/CSP17（ 雙 色 探 針 ） HER2基 因 檢 測 意 義 ： HER2基

5、目 擴 增 的 患 者 預 后 差 :無 病 生 存 和 總 生 存 期 縮短 ， 淋 巴 結 轉(zhuǎn) 移 幾 率 高 ， 復 發(fā) 鳳 險 高 。 指 導 內(nèi) 分 泌 冶 療 ： HER2基 因 擴 增 患 者 對 內(nèi) 分 泌 治 療 產(chǎn)生 耐 藥 。 指 導 合 理 選 擇 輔 助 化 療 方 案 ： HER2基 因 擴 增 患 者 宜 采用 紫 杉 醇 化 療 和 高 強 度 的 蒽 環(huán) 類 藥 物 方 案 。 篩 選 分 子 靶 向 藥 物 的 適 用 者 ： HER2基 因 擴 增 患 者 適 合使 用 曲 妥 珠 單 抗 藥 物 。 Her2 (-) 2G + 2R Ratio: 1/1

6、2.2/1, Her2 FISH (+) 探 針 ： TOP2A/CSP17（ 雙 色 探 針 ） TOP2A基 因 兩 種 異 常 ： 擴 增 和 缺 失 。 TOP2A基 因 檢 測 的 意 義 ： 存 在 TOP2A基 因 異 常 的 患 者 預 后 差 ， 尤 其 是 基 因 缺 失的 患 者 預 后 更 差 。 TOP2A基 因 異 常 患 者 對 于 含 蒽 環(huán) 類 藥 物 的 治 療 方 案 更敏 感 。 非 小 細 胞 肺 癌探 針 ： EGFR/CSP7（ 雙 色 探 針 ） EGFR基 因 異 常 ： 擴 增 和 拷 貝 數(shù) 增 加 。 EGFR基 因 檢 測 的 意 義

7、： 30%40%非 小 細 胞 肺 癌 存 在 EGFR基 因 異常 . 篩 選 酪 氨 酸 激 酶 抑 制 劑 適 用 者 ： EGFR基 因增 多 的 患 者 ， 應 用 Iressa/Tarceva治 療 的 有 效 率 為35%， 疾 病 控 制 率 高 達 70%。 EGFR (-) 2G + 2R Ratio: 2.0, EGFR FISH (+) 濾 泡 性 淋 巴 瘤探 針 : BCL2/IGH （ 雙 色 雙 融 合 探 針 ） BCL2基 因 位 于 18q21， IGH基 因 位 于 14q32. BCL2/IGH融 合 基 因 導 致 BCL2蛋 白 的 過 度 表 達

8、 ， 從 而 抑 制 B細 胞 凋 亡 ，使 B細 胞 持 續(xù) 增 殖 引 發(fā) 腫 瘤 。 BCL2/IGH融 合 基 因 檢 測 意 義 : 輔 助 診 斷 FL ： BCL2/IGH重 排 發(fā) 生 在 約 80%-85%的 FL患者 中 。 BCL2/IGH持 續(xù) 陰 性 的 FL患 者 3年 生 存 率 為 100%， 而 陽性 者 3年 生 存 率 只 有 54%； 陰 性 者 3年 疾 病 無 進 展 的 患 者87.5%， 而 陽 性 者 只 有 13%。 BCL2/IGH 正 常 BCL2/IGH斷 裂 、 平 衡 易 位 彌 漫 性 大 B細 胞 淋 巴 瘤 探 針 ： BCL

9、6（ 雙 色 分 離 探 針 ） BCL6基 因 位 于 3q27， 主 要 有 t(3;14)， t(3;22)和t(2;3)3種 易 位 ， 分 別 是 BCL6與 免 疫 球 蛋 白 Ig的 重 鏈 (IGH)、 輕 鏈 (IGL)、 輕 鏈 (IGK)區(qū) 域 易 位 。 BCL6 基 因 斷 裂 檢 測 意 義 目 前 研 究 確 定 至 少 40%的 DLBCL涉 及 3q27染 色 體 易 位 或者 BCL6基 因 重 排 。 BCL6陽 性 患 者 診 斷 治 療 36個 月 后 ， 疾 病 停 止 發(fā) 展 的 比率 為 82%， 攜 帶 有 BCL6重 排 的 病 例 預 后

10、較 好 。 BCL6斷 裂BCL6正 常 套 細 胞 淋 巴 瘤探 針 ： CCND1/IGH（ 雙 色 雙 分 離 探 針 ） CCND1基 因 位 于 11q13， IGH基 因 位 于 14q32。CCND1/IGH融 合 基 因 導 致 CCND1蛋 白 過 度 表 達 ， 可 促 進 細 胞增 生 。 CCND1/IGH融 合 基 因 檢 測 意 義 CCND1基 因 重 排 和 (或 )高 表 達 是 MCL的 特 征 ， FISH探針 檢 測 CCND1/IGH的 陽 性 率 可 以 達 到 96%。 CCND1/IGH正 常 CCND1/IGH斷 裂 易 位 伯 基 特 淋 巴

11、 瘤探 針 :C-MYC（ 雙 色 分 離 探 針 ） 8號 染 色 體 上 C-MYC基 因 最 常 見 的 是 t(8； 14)， 導 致 8號 染 色 體 上 C-MYC基 因 和 l4號 染 色 體 上 IGH增 強 子 元 件 并 列 ,也 可 發(fā) 生 t(2； 8)(p12； q24)， 或 t(8； 22)(q24； ql1) C-MYC基 因 斷 裂 檢 測 意 義 約 80%的 伯 基 特 淋 巴 瘤 病 例 發(fā) 生 t(8； 14)（ q24;q32） ； 約 15%的 伯 基 特 淋 巴 瘤 病 例 發(fā) 生 t(2； 8)(p11;q24)； 約 5%發(fā) 生 t(8； 2

12、2)（ q24;q11） 。 C-MYC基 因 斷 裂 重 組 可 能 是 伯 基 特 淋 巴 瘤 的 一 個 標 志 ，可 以 應 用 于 臨 床 上 伯 基 特 淋 巴 瘤 的 輔 助 診 斷 。 C-MYC正 常 C-MYC斷 裂 MALT淋 巴 瘤 探 針 ： MALT1（ 雙 色 分 離 探 針 ） API2/MALT1（ 雙 色 雙 融 合 探 針 ） API2（ 11q21） MALTI（ 18q21） 易 位 形 成API2/MALTI融 合 基 因 ， 產(chǎn) 生 API2/MALTI融 合 蛋 白 ， 導 致 細胞 增 殖 ， 引 起 腫 瘤 。 MALT1及 API2/MAL

13、TI融 合 基 因 檢 測 意 義 10%-20%的 粘 膜 性 淋 巴 組 織 淋 巴 瘤 中 會 存 在 MALT1 基因 的 斷 裂 重 組 ， 輔 助 診 斷 MALT淋 巴 瘤 。 指 導 針 對 胃 API1/MALT1淋 巴 瘤 患 者 的 抗 幽 門 螺 旋 菌 治療 ： 存 在 MALT1 基 因 的 斷 裂 重 組 的 患 者 不 適 合 用 抗 生 素 治療 。 預 后 判 斷 ： 存 在 MALT1 基 因 的 斷 裂 重 組 的 節(jié) 外 胃 淋 巴 瘤患 者 更 容 易 出 現(xiàn) 局 部 進 展 期 病 變 。 MALT正 常 MALT斷 裂API2/MALT正 常 A

14、PI2/MALT斷 裂 易 位 滑 膜 肉 瘤 探 針 ： SYT SYT基 因 位 于 18q11 2,又 稱 SSl8或 SSXT基 因 。 SYT基 因 檢 測 意 義 輔 助 診 斷 滑 膜 肉 瘤 。 文 獻 報 道 ， 90 以 上 的 滑 膜 肉 瘤 中 存 在 染 色 體 易 位t(X； 18)(p11 2； q11 2)， 導 致 位 于 18q11 2的 SYT基因 和 位 于 Xp11 2的 SSX基 因 融 合 。 脂 肪 肉 瘤 探 針 ： MDM2/CEN12 MDM2基 因 檢 測 意 義 ： 輔 助 診 斷 高 分 化 脂 肪 肉 瘤 。 文 獻 報 導 ： 9

15、0%高 分 化 脂 肪 肉 瘤 中 MDM2基 因 存 在 擴增 。 胃 腸 道 間 質(zhì) 瘤 探 針 ： CCND1/CEN11 MDM2/CEN12 檢 測 意 義 ： CCND1基 因 為 重 要 預 后 因 子 ， 與 多 種 腫 瘸 的 轉(zhuǎn) 移 、復 發(fā) 等 相 關 。 在 高 鳳 險 們 GIST中 擴 增 ， 在 低 風 險 和 中 等風 險 GIST中 無 擴 增 ， 其 表 達 與 GIST有 預 后 相 關 性 。 MDM2基 因 擴 增 宣 GIST患 者 有 預 后 相 關 性 。 前 列 腺 癌 探 針 ： PTEN/CEN10 FGFR1/CEN8 ERG 檢 測 意

16、 義 ： PTEN基 因 缺 失 ， 前 列 腺 癌 患 者 預 后 差 。 FGFR1基 因 擴 增 是 前 列 腺 癌 患 者 傳 遞 激 素 抵 抗 的 重要 過 程 。 沒 有 ERG基 因 改 變 的 前 列 腺 癌 患 者 8年 生 存 期 達 90%。 神 經(jīng) 母 細 胞 瘤 、 神 經(jīng) 膠 質(zhì) 瘤 探 針 ： 1p36/1q25 19q13/19p13 NMYC/2q11 檢 測 意 義 ： 在 神 經(jīng) 母 細 胞 瘤 患 者 中 ， 1p丟 失 是 強 烈 的 預 后 差 因 子 ，提 示 臨 床 應 采 取 積 極 主 動 的 治 療 策 略 ； 結 合 1p， 19q基

17、因 狀 態(tài) 可 輔 助 治 療 和 預 測 退 行 性 少 突神 經(jīng) 膠 質(zhì) 瘤 的 預 后 效 果 。 NMYC基 因 擴 增 為 預 后 差 因 子 ， 指 導 個 性 化 治 療 。 黑 色 素 瘤 探 針 ： PTEN/CEN10 檢 測 意 義 ： PTEN基 因 缺 失 導 致 PI3K/AKT（ 磷 酸 肌 醇 3激 酶 /絲氨 酸 蘇 氨 酸 蛋 白 激 酶 ） 途 經(jīng) 激 活 ， 指 導 抗 PI3K/AKT通 路藥 物 。 PTEN基 因 缺 失 的 患 者 預 后 差 。 宮 頸 CIN、 宮 頸 癌 探 針 ： TERC/CSP3 檢 測 意 義 ： 對 于 CIN1/

18、CIN2的 患 者 ， TERC基 因 擴 增 的 患 者 發(fā)生 進 展 /惡 變 的 可 能 性 超 過 50%， 需 要 及 時 治 療 。 輔 助 明 確 宮 頸 CIN分 級 ， 選 擇 合 理 的 治 療 方 案 。 病 埋 分 級 正 常 /炎 癥 CIN1 CIN2 CIN3 原 位 癌TERC擴 增 率 4.2% 7.3% 69.2% 85.1% 95.7% 膀 胱 癌 探 針 ： CSP3/CSP7 P16/CSP17 檢 測 意 義 ： 膀 胱 癌 9號 染 色 體 部 分 (P16位 點 )缺 失 或 全 部 丟 失 是 最常 見 的 遺 傳 學 異 常 之 一 ， 這

19、一 異 常 與 膀 胱 癌 的 旱 期 發(fā) 望 密切 相 關 。 膀 胱 癌 的 發(fā) 展 與 染 色 體 不 穩(wěn) 定 性 (如 3號 、 7號 、 17號染 色 體 的 非 整 倍 性 )緊 密 相 連 。 早 期 無 創(chuàng) 性 診 斷 泌 尿 系 統(tǒng) 移 行 上 皮 癌 。 泌 尿 系 統(tǒng) 移 行 上 皮 癌 術 后 復 發(fā) 監(jiān) 測 。 四 、 FISH操 作 流 程 石 蠟 切 片 58-60 過 夜 二 甲 苯 脫 蠟 ， 酒 精 脫 二 甲 苯 ， 水 化 組 織 高 壓 處 理 組 織 切 片 胃 蛋 白 酶 處 理 組 織 干 燥 組 織 切 片 后 滴 加 探 針 ， 加 蓋 玻

20、片 與 封 固 劑 高 溫 （ 73 95 ） 變 性 雜 交 16小 時 （ 過 夜 ） 揭 去 橡 膠 水 泥 和 蓋 玻 片 ,進 入 雜 交 后 洗 滌 酒 精 脫 水 、 晾 干 。 滴 加 DAPI熒 光 封 片 劑 熒 光 顯 微 鏡 下 觀 察 五 、 FISH判 讀 標 準 乳 腺 癌 HER2基 因 檢 測 : 20個 腫 瘤 細 胞 HER2基 因 （ 紅 信 號 ） 點 數(shù) 總和 與 CEN-17（ 綠 信 號 ） 點 數(shù) 總 和 的 比 值 。 HER2/CEN-172.2 HER2基 因 有 擴 增 HER2/CEN-17 1.8 HER2基 因 無 擴 增 HER

21、2/CEN-17 1.82.2 定 為 不 確 定 結 果 。 需 重 新 再 進 行 另 外 20個 的 細 胞 計 數(shù) 或 重 復FISH檢 測 ， 如 仍 不 確 定 ， 則 建 議 臨 床 結 合 IHC檢測 HER2蛋 白 表 達 情 況 決 定 是 否 使 用 靶 向 治 療 。 CEN-17多 體 性 ： 計 算 以 上 計 數(shù) 的 20個 細胞 的 綠 信 號 點 數(shù) 均 值 。 CEN-17均 值 1.75 亞 二 體 性 CEN-17均 值 1.762.25 二 體 性 CEN-17均 值 2.263.75 低 多 體 性 CEN-17均 值 3.76 高 多 體 性 非

22、小 細 胞 肺 癌 EGFR基 因 檢 測 : 50個 腫 瘤 細 胞 EGFR基 因 （ 紅 信 號 ） 點 數(shù) 總和 與 CEN-7（ 綠 信 號 ） 點 數(shù) 總 和 的 比 值 。 EGFR基 因 擴 增 陽 性 ： EGFR基 因 簇 狀 擴 增 EGFR/CEN-72.0 40% 腫 瘤 細 胞 紅 色 信 號 4個 六 、 FISH檢 測 規(guī) 范 與 質(zhì) 控 影 響 FISH制 片 質(zhì) 量 的 因 素 組 織 處 理 的 規(guī) 范 化 : 及 時 固 定 :冷 缺 血 時 間 1h 4%中 性 緩 沖 甲 醛 6-48h 不 推 薦 微 波 固 定 乙 醇 脫 水 浸 蠟 溫 度 6

23、周 的 組 織 切 片 不 應 再 用 于 FISH檢 測 影 響 FISH判 讀 的 因 素 采 用 正 確 的 濾 光 片 觀 察 Orange/red 正 確 判 定 腫 瘤 細 胞 (HE IHC FISH) 腫 瘤 異 質(zhì) 性 表 達 導 管 內(nèi) 癌 /浸 潤 性 癌 浸 潤 性 癌 不 同 部 位 至 少 兩 位 閱 片 者 導 管 內(nèi) 癌 浸 潤 性 導 管 癌 免 疫 組 化 技 術 、 蛋 白 組 學 技 術 的 發(fā) 展21世 紀 初 蛋 白 質(zhì) 指 紋 圖 譜 技 術 建 立新 蛋 白 質(zhì) 種 類 的 發(fā) 現(xiàn)免 疫 組 化 抗 體 種 類對 臨 床 病 理 的 影 響10年 時 間 DNA測 序 技 術 的 進 步人 類 基 因 組 計 劃 初 步 完 成 于 2000年 完 成 測 定 人 體 23對 染 色 體 全 部 DNA序 列 ， 完 成 人 類 基 因 組 “ 工 作 框 架 圖 ” 。 2001年 公 布 了 人 類 基 因 組 圖 譜 及 初 步 分 析 結 果 。 人 類 基 因 組 研 究 進 入 規(guī) 模 化熒 光 原 位 雜 交 技 術 的 發(fā) 展FISH探 針 的 種 類對 臨 床 病 理 的 影 響