現(xiàn) 代 色 譜 分 離 技 術(shù)中 國 海 洋 大 學 醫(yī) 藥 學 院海 洋 藥 物 教 育 部 重 點 實 驗 室李 國 強 For 博 興 京 博 控 股 股 份 有 限 公 司2011-12-20 主 要 內(nèi) 容薄 層 色 譜 （ TLC） 柱 色 譜 （ CC）2 高 效 液 相 色 譜 （ HPLC）3 一 薄 層 色 譜 引 言 薄 層 色 譜 (Thin Layer Chromato-graphy)， 又 稱 薄 層 層 析 ， 常 用 TLC表 示 。 將 固 定 相 在 玻 璃 、 金 屬 或 塑 料 等 光 潔 的表 面 上 均 勻 的 鋪 成 薄 層 ， 試 樣 點 在 薄 層 的 一端 ， 流 動 相 借 毛 細 作 用 流 經(jīng) 固 定 相 ， 使 被 分離 的 物 質(zhì) 展 開 。固 定 相 ： 吸 附 劑 。流 動 相 ： 展 開 劑 。分 離 原 理 ： 吸 附 與 解 吸 附 。 薄 層 板v固 定 相 ： 硅 膠 為 使 用 最 廣 泛 的 薄 層 材 料 。 除 此 之 外 還 有 氧 化 鋁 、 硅 藻 土 等 。v常 用 薄 層 硅 膠 的 特 征 ：硅 膠 商 品 名稱 黏 合 劑 熒 光 添 加 劑 應(yīng) 用硅 膠 H 無 無 薄 層 色 譜 ， 柱 色 譜硅 膠 G 有 無 薄 層 色 譜 ， 柱 色 譜 硅 膠 GF254 有 有 在 254nm紫 外 燈 下 看 熒 光 薄 層 板 的 制 備 方 法濕 法 ： 平 鋪 法 和 涂 鋪 法 。 制 備 薄 層 色 譜 定 性 薄 層 色 譜 使用目的 薄 層 色 譜 分 類 （ 一 ） 定 性 薄 層 色 譜點 樣 展 開 定 位 與 顯 色 1 點 樣v樣 品 溶 解 ： 用 甲 醇 、 氯 仿 、 石 油 醚 、 丙 酮 等 揮 發(fā) 性 有 機 溶劑 ， 最 好 選 用 與 展 開 劑 極 性 相 似 的 溶 劑 。v點 樣 工 具 ： 玻 璃 毛 細 管 ， 微 量 點 樣 器 。v點 樣 量 ： 與 薄 層 的 厚 度 、 吸 附 劑 的 種 類 、 顯 色 劑 的 靈 敏 度等 因 素 有 關(guān) ， 若 因 樣 品 溶 液 太 稀 ， 可 重 復 點 樣 。v點 樣 位 置 ： 距 底 邊 約 1-2cm的 起 始 線 上 ， 點 與 點 的 距 離 為0.5-1cm。v點 樣 方 式 ： 定 性 分 析 -點 狀 點 樣 。 （ 直 徑 3-5mm的 圓 點 ） 制 備 薄 層 -條 狀 點 樣 。 2 展 開u石 油 醚u環(huán) 己 烷u四 氯 化 碳u苯u氯 仿u乙 醚u乙 酸 乙 酯u丙 酮u乙 醇 u甲 醇u水u乙 酸 極性增強 展 開 劑 選 用 原 則1 對 所 需 組 分 有 良 好 的 溶 解 性 （ 相 似 相 溶 ） 。2 可 使 成 分 間 分 開 。3 待 測 組 分 Rf在 0.20.8之 間 。常 用 展 開 劑 體 系一 元 ： 石 油 醚 ， 甲 醇 等 。二 元 ： 石 油 醚 ： 丙 酮 ， 石 油 醚 ： 乙 酸 乙 酯 ， 氯 仿 ： 甲 醇 等 。三 元 ： 氯 仿 ： 甲 醇 ： 水 等 。 應(yīng) 注 意 ：a 展 開 劑 不 淹 沒 樣 點 。b 薄 層 板 呈 傾 斜 狀 。C 展 開 過 程 應(yīng) 在 密 閉 容 器 中 進行 。d 展 開 劑 前 沿 上 升 到 一 定 高 度時 取 出 ， 盡 快 標 出 展 開 劑 前沿 位 置 ， 以 便 計 算 Rf值 。2 展 開 l展 開 后 將 溶 劑 吹 干 。l常 見 的 定 位 方 法 ：3 定 位 與 顯 色光 學 檢 出 法 254nm， 365nm（ 使 用 方 便 ， 被 檢 測 物 不 易 被 破壞 ）蒸 氣 檢 出 法 展 開 劑 揮 發(fā) 干 凈 后 放 入 儲 有 晶 體 碘 并 充 滿 碘 蒸 氣 的 密 閉容 器 中 ， 放 置 一 段 時 間 后 取 出 薄 層 板 ， 標 出 斑 點 位 置 。試 劑 檢 出 法 利 用 化 學 試 劑 與 被 測 物 質(zhì) 斑 點 在 薄 層 板 上 發(fā) 生 化 學 反 應(yīng)通 用 顯 色 劑 ： 10%硫 酸 乙 醇 、 茴 香 醛 、 香 草 醛 。 (二 )制 備 薄 層 色 譜 （ PTLC）特 點 ：1 較 分 析 薄 層 樣 品 液 的 濃 度 大 。2 板 較 大 ， 較 厚 （ 吸 附 劑 用 量 多 ）3 點 樣 多 點 成 直 線 。用 于 制 備 的 薄 層 色 譜 。 樣 品 的 檢 測v 有 色 物 質(zhì) 直 接 觀 察 斑 點 。v 熒 光 物 質(zhì) 紫 外 燈 下 觀 察 。v 如 必 須 采 用 化 學 試 劑 顯 色 時 ， 可 將 薄 層 板 的 大 部 分 用 另 一 塊玻 璃 板 蓋 住 ， 留 出 一 條 進 行 顯 色 ， 將 需 要 的 部 分 作 出 記 號 。 樣 品 的 收 集v切 割 ： 用 刮 刀 刮 下 帶 有 樣 品 的 吸 附 劑 。v回 收 ： 將 刮 下 的 吸 附 劑 裝 入 玻 璃 柱 中 ， 用極 性 盡 可 能 低 的 溶 劑 洗 脫 ， 丙 酮 和 氯 仿 常用 。 TLC的 特 點v方 法 簡 便 易 行 ,價 格 低 廉 ；v分 析 快 速 ；v檢 出 靈 敏 度 高 ；v分 離 能 力 強 ；v檢 測 手 段 多 樣 化 ；v應(yīng) 用 廣 泛 ； 二 柱 色 譜 柱 色 譜硅 膠 柱 色 譜凝 膠 柱 色 譜 ODS柱 色 譜大 孔 樹 脂 柱 色 譜 (一 )硅 膠 柱 色 譜 1 原 理 ： 根 據(jù) 物 質(zhì) 在 硅 膠 柱 上 的 吸 附 力 不 同 而 分 離 。一 般 情 況 下 極 性 較 大 的 物 質(zhì) 易 被 硅 膠 吸 附 ， 極 性較 弱 的 物 質(zhì) 不 易 被 硅 膠 吸 附 。 流 動 相 流 過 時 各 組分 以 不 同 的 速 率 向 下 移 動 ， 吸 附 弱 的 組 分 隨 著 流動 相 移 動 在 前 面 ， 吸 附 強 的 組 分 移 動 在 后 面 ， 各種 化 合 物 在 色 譜 柱 中 形 成 帶 狀 分 布 ， 實 現(xiàn) 化 合 物的 分 離 。 1 吸 附 劑 的 選 擇硅 膠 G 100200目 （ 拌 樣 用 ） 200300目 （ 上 柱 用 ）硅 膠 H 2 準 備 工 作 ：2 色 譜 柱 的 選 擇下 端 有 活 塞 的 玻 璃 柱 柱 子 大 小 視 分 離 樣 品 的 量而 定3 洗 脫 劑 的 選 擇 洗 脫 劑 多 一 般 由 一 元 或 二 元 溶 劑 按 一 定 的 比 例 配 比 組 成 ， 通 過 不 同 的 配 比 調(diào) 節(jié) 溶 劑 系 統(tǒng) 的 極 性 ， 較 復 雜 成 分 常 用 梯 度 洗 脫 。初 始 洗 脫 劑 配 比 的 選 擇 ： 薄 層 試 驗 ， 使 待 分 離 組 分 的 Rf值 介于 0.10.2之 間 的 展 開 系 統(tǒng) 可 選 為 柱 色 譜 的 洗 脫 劑 。 3 操 作 步 驟加 樣洗 脫 檢 測 合 并裝 柱 將 色 譜 柱 洗 凈 、 干 燥 ， 底 部 塞 一 小 塊 脫 脂 棉 。（ 1） 干 裝 法 ： 將 硅 膠 通 過 小 漏 斗 倒 入 柱 內(nèi) ， 應(yīng) 不 間 斷地 形 成 一 細 流 慢 慢 加 入 柱 內(nèi) ， 同 時 用 橡 皮 槌 輕 輕 敲 打 色 譜柱 ， 使 裝 填 均 勻 。 柱 裝 填 好 后 ， 打 開 下 端 活 塞 ， 從 上 端 倒入 洗 脫 劑 沖 柱 ， 以 排 盡 柱 內(nèi) 空 氣 ， 并 保 留 一 定 液 面 。（ 2） 濕 裝 法 ： 將 硅 膠 加 入 適 量 最 初 使 用 的 洗 脫 劑 ， 超聲 攪 拌 ， 調(diào) 成 混 懸 液 ， 打 開 柱 子 下 端 活 塞 ， 徐 徐 將 混 懸 液倒 入 柱 子 ， 使 洗 脫 劑 慢 慢 流 出 ， 帶 動 硅 膠 緩 慢 沉 于 柱 的 下端 。 待 加 完 吸 附 劑 后 ， 繼 續(xù) 使 洗 脫 劑 流 出 ， 直 到 硅 膠 的 沉降 不 再 變 動 。 注 意 整 個 操 作 過 程 要 慢 慢 進 行 ， 不 要 將 氣 泡壓 入 硅 膠 中 ， 而 且 要 始 終 保 持 吸 附 劑 上 端 有 溶 劑 ， 切 勿 流干 。 最 后 在 硅 膠 上 面 加 少 許 棉 花 ， 將 多 余 洗 脫 劑 放 出 至 上面 保 持 有 1cm高 液 面 為 止 ， 關(guān) 上 活 塞 。 裝 柱洗 脫 檢 測合 并 加 樣3 操 作 步 驟多 采 用 干 法 加 樣 （ 拌 樣 法 ） ： 將 樣 品 用 盡量 少 的 易 揮 發(fā) 溶 劑 溶 解 ， 加 入 樣 品 約 5倍 量的 硅 膠 拌 勻 ， 置 空 氣 中 揮 盡 溶 劑 ， 或 在 旋轉(zhuǎn) 蒸 發(fā) 器 里 于 適 溫 下 蒸 干 ， 研 勻 后 均 勻 置于 裝 好 硅 膠 的 柱 頂 ， 盡 量 使 樣 品 平 整 ， 并在 柱 頂 放 一 塊 圓 形 濾 紙 。 裝 柱 加 樣洗 脫 檢 測合 并3 操 作 步 驟將 通 過 TLC選 擇 好 的 洗 脫 劑 加 入分 液 漏 斗 或 者 加 液 球 中 ， 使 之 不斷 緩 慢 加 于 樣 品 之 上 ， 注 意 始 終保 持 洗 脫 劑 液 面 在 硅 膠 之 上 ， 切勿 流 干 。打 開 色 譜 柱 下 端 活 塞 ， 控 制 流 速 ，等 份 收 集 洗 脫 液 ， 也 可 用 自 動 收集 器 收 集 。通 過 上 端 加 壓 或 者 下 端 減 壓 可 以提 高 洗 脫 速 度 ， 但 是 可 能 會 降 低塔 板 數(shù) 影 響 分 離 效 果 。 裝 柱 加 樣洗 脫 檢 測合 并3 操 作 步 驟 每 份 洗 脫 液 采 用 薄 層 色 譜 法 檢 查 。 裝 柱 加 樣洗 脫 檢 測合 并3 操 作 步 驟 成 分 相 同 （ 斑 點 相 同 ） 的 洗脫 液 合 并 ， 回 收 溶 劑 。 1 2 3 4 5 6 7小 極 性 的 組 分 先 被 洗 脫 下 來大 極 性 組 分 后 被 洗 脫 下 來 （ 二 ） 凝 膠 柱 層 析 1 原 理 2 凝 膠 層 析 中 常 用 的 凝 膠 瓊 脂 糖 凝 膠聚 丙 烯 酰 胺 凝 膠 葡 聚 糖 凝 膠（ Sephadex） 3 凝 膠 柱 的 使 用 溶 脹 裝 柱 上 樣 洗 脫羥 丙 基 葡 聚 糖 凝 膠 （ Sephadex LH-20） 為 干 粉 ， 裝 柱 前 量好 柱 體 積 ， 再 根 據(jù) 凝 膠 的 吸 水 量 計 算 干 重 ， 稱 重 后 足 量用 有 機 溶 劑 （ 常 用 氯 仿 ： 甲 醇 =1： 1） 溶 脹 。將 層 析 柱 垂 直 固 定 在 鐵 架 上 ， 打 開 柱 下 口 開 關(guān) 。 將 溶 脹 好的 凝 膠 放 在 燒 杯 中 ， 使 凝 膠 表 面 的 水 層 與 凝 膠 體 積 相 等 。用 玻 璃 棒 攪 勻 凝 膠 液 ， 順 玻 璃 棒 灌 入 柱 內(nèi) 。 此 時 柱 下 口 一邊 排 水 ， 上 口 一 邊 加 入 攪 勻 的 凝 膠 ， 可 見 凝 膠 連 續(xù) 均 勻 地沉 降 ， 逐 步 形 成 凝 膠 柱 。 當 到 達 所 需 凝 膠 高 度 時 ， 立 即 關(guān)閉 下 口 ， 使 凝 膠 完 全 沉 降 。濕 法 上 樣 ： 打 開 層 析 柱 的 下 口 開 關(guān) ， 放 出 凝 膠 柱 面 上 的 多 余 溶 液 ，使 液 面 與 凝 膠 表 面 相 平 齊 。 將 樣 品 加 在 凝 膠 表 面 ， 打 開 下 口 開 關(guān) ， 控 制 流 速 ， 使 樣品 慢 慢 滲 入 凝 膠 內(nèi) 。 當 慢 慢 滲 入 凝 膠 的 樣 品 溶 液 面 與 凝 膠 柱面 相 平 齊 時 ， 關(guān) 閉 下 口 ， 完 成 上 樣 。 然 后 在 凝 膠 柱 面 上 加 一層 （ 3 5cm） 洗 脫 液 ， 接 上 洗 脫 瓶 準 備 洗 脫 。控 制 流 速 ， 過 快 或 過 慢 影 響 分 離 效 果 。流 出 液 分 步 收 集 ， 分 析 、 合 并 。 1 原 理 ： 大 孔 樹 脂 為 新 型 非 離 子 型 分 子 聚 合 物 吸 附 劑 ，白 色 球 形 顆 粒 ， 每 個 顆 粒 都 是 由 許 多 彼 此 間 存 在孔 穴 的 微 觀 小 球 組 成 ， 稱 之 為 “ 大 孔 ” 。 （ 三 ） 大 孔 樹 脂 柱 色 譜 大 孔 樹 脂 色 譜 是 以 大 孔 樹 脂 為 吸 附 劑 ， 利 用其 對 不 同 成 分 的 選 擇 性 吸 附 和 篩 選 作 用 ， 通 過 選用 適 宜 的 吸 附 和 解 析 條 件 以 分 離 、 提 純 某 一 或 某一 類 化 合 物 的 色 譜 。 可 分 為 極 性 、 中 極 性 、 非 極 性 三 大 類 ， 根 據(jù)分 離 物 質(zhì) 極 性 的 大 小 ， 通 過 所 選 擇 的 與 之 相 適 應(yīng)的 大 孔 樹 脂 的 選 擇 性 吸 附 而 達 到 分 離 目 的 。 2 特 點v理 化 性 質(zhì) 穩(wěn) 定 。v分 離 性 質(zhì) 優(yōu) 良 。v溶 劑 用 量 小 。v可 重 復 使 用 。v對 天 然 產(chǎn) 物 化 學 成 分 如 皂 苷 、 生 物 堿 、 黃 酮及 其 他 一 些 苷 類 成 分 都 有 一 定 的 吸 附 作 用 ，對 色 素 吸 附 作 用 較 強 。 3 操 作 步 驟預(yù) 處 理上 樣洗 脫再 生 乙 醇 浸 泡 24h ， 充 分 溶 脹 濕 法 裝 柱 ， 用 乙 醇 洗 至 流 出 液 加 等量 蒸 餾 水 無 白 色 渾 濁 蒸 餾 水 洗 至 無 醇 味 且 水 液 澄 清 。將 樣 品 溶 于 少 量 水 中 ， 以 一 定 的 流 速 加 到 柱 的 上 端 進 行 吸 附 。上 樣 液 以 澄 清 為 好 ， 上 樣 前 要 配 合 一 定 的 處 理 工 作 ， 如 上 樣 液的 預(yù) 先 沉 淀 、 濾 過 處 理 、 PH調(diào) 節(jié) ， 使 部 分 雜 質(zhì) 在 處 理 過 程 中除 去 ， 以 免 堵 塞 樹 脂 床 或 在 洗 脫 中 混 入 成 品 。一 般 先 用 水 洗 ， 再 用 梯 度 遞 增 的 乙 醇 溶 液 進 行 洗 脫 ， 并 控 制 洗脫 液 的 用 量 與 流 速 ， 使 提 取 液 由 上 而 下 通 過 樹 脂 柱 。 收 集 、 合并 洗 脫 液 ， 減 壓 蒸 餾 ， 回 收 溶 劑 至 干 ， 低 溫 真 空 干 燥 ， 得 精 制 產(chǎn) 品 。95%乙 醇 洗 脫 至 無 色 ， 再 用 2%鹽 酸 浸 泡 ， 用 水 洗 至 中 性 ， 再用 2%NaOH浸 泡 ， 再 用 水 洗 至 中 性 。 (四 ) ODS反 相 柱 層 析1填 料 : O DS(octadecyl bonded silica) ,十 八 烷 基 鍵 合 硅 膠 ， 是 以 硅 膠 為 基 質(zhì)鍵 合 的 C18填 料 , O DS適 用 于 分 離 中 等偏 大 的 化 合 物 。 與 HPLC不 同 ， 開 放 式 ODS是 將 ODS裝 入 玻 璃 柱 內(nèi) ， 不 加 壓 或 者 用 加 壓 泵加 壓 。 2 操 作 步 驟將 ODS用 甲 醇 浸泡 ， 具 體 裝 柱 方 法 與 硅 膠 柱 相 同 。用 甲 醇 裝 柱 完 成后 ， 置 換 成 起 始 流動 相 系 統(tǒng) 。裝 柱 上 樣 洗 脫濕 法 ： 用 起 始 流動 相 溶 解 樣 品 裝 柱。干 法 ： 對 于 一 些溶 解 性 較 差 的 樣 品， 用 揮 發(fā) 性 溶 劑 拌入 ODS中 ， 揮 干溶 劑 。 常 用 梯 度 洗 脫 ：10%甲 醇 /水 30%甲 醇 /水 50%甲 醇 /水 70%甲 醇 /水 90%甲 醇 /水 100%甲 醇 。根 據(jù) 樣 品 情 況 細 分調(diào) 整 。 三 高 效 液 相 色 譜 引 言 以 液 體 為 流 動 相 的 色 譜 法 稱 為 液 相 色 譜法 。 HPLC是 以 經(jīng) 典 的 液 相 柱 色 譜 為 基 礎(chǔ) ， 流動 相 改 為 高 壓 輸 送 ， 采 用 高 效 固 定 相 及 在 線檢 測 等 手 段 ， 發(fā) 展 而 成 的 分 離 分 析 方 法 。 該法 具 有 分 離 效 能 高 、 分 析 速 度 快 及 儀 器 化 等特 點 ， 因 而 稱 為 高 效 液 相 色 譜 法 。 （ 一 ） HPLC工 作 原 理檢 測 過 程 是 非 破 壞 性 的 ， 經(jīng) 過 檢 測 的 洗 提 液 可 以 依 次收 集 起 來 ， 制 成 純 品 ， 供 進 一 步 化 學 定 性 和 結(jié) 構(gòu) 鑒 定 。 液 相 色 譜 柱 分 類正 相 柱 ： 以 硅 膠 為 填 料 。 或 者 硅 膠 表 面 鍵 合 -CN,-NH2等 官 能 團 。反 相 柱 ： 以 硅 膠 為 基 質(zhì) ， 在 其 表 面 鍵 合 碳 十八 （ ODS） 、 碳 八 、 碳 四 等 官 能 團 的 非 極性 填 料 。 制 備 型 HPLC 分 析 型 HPLC （ 二 ） HPLC分 類使用目的 分 析 型 HPLC 制 備 型 HPLC 分 析 HPLC 制 備 HPLC色 譜 柱 柱 內(nèi) 徑 15mm 柱 內(nèi) 徑 110mm（ 或 更大 ）進 樣 量 僅 夠 檢 測 用 即 可 盡 可 能 加 大 進 樣 量目 的 獲 得 樣 品 組 成 信 息 ， 研究 大 部 分 或 全 部 樣 品 組分 純 品 的 制 備 ， 只 對 一 種或 幾 種 樣 品 組 分 感 興 趣 。檢 測 DAD全 波 長 檢 測 ， 以 保證 色 譜 峰 分 離 度 分 析 HPLC確 定 條 件 后VWD單 波 長 檢 測 即 可分 析 HPLC與 制 備 HPLC比 較 （ 三 ） HPLC的 使 用初 步純 化優(yōu) 化 色 譜 條 件 （ 分 析 HPLC） 制 備 (制 備 HPLC)未 經(jīng) 預(yù) 純 化 的 樣 品 ， 尤 其 是 天 然 產(chǎn) 物 ， 含 有大 量 可 能 在 填 料 表 面 不 可 逆 吸 附 的 組 分 ， 直接 進 樣 ， 可 導 致 昂 貴 的 填 料 很 快 失 效 。此 外 ， 大 量 的 雜 質(zhì) 降 低 對 目 標 產(chǎn) 物 的 分 離 度 ，因 此 限 制 了 進 樣 量 和 生 產(chǎn) 效 率 。因 此 ， HPLC前 利 用 薄 層 色 譜 、 柱 色 譜 等 進 行初 步 純 化 很 有 必 要 。常 用 流 動 相 ： 甲 醇 ： 水 (酸 水 ) 乙 腈 ： 水 （ 酸 水 ）常 用 色 譜 柱 ： C18， C8 半 制 備 柱 波 長 ： 全 波 長 分 析 ， 確 定 最 優(yōu) 制 備 波 長 。目 標 ： 通 過 改 變 流 動 相 的 配 比 ， 在 盡 量 短 的 時 間 內(nèi) ， 使 目 的 組 分 的 分 離 度 達 到 1.5。按 用 分 析 HPLC確 定 的 色 譜 條 件 ，逐 漸 增 大 進 樣 量 ， 通 過 監(jiān) 測 檢測 譜 圖 ， 依 次 收 集 洗 提 液 ， 制成 純 品 。 min0 5 10 15 20 25 30 mAU 05001000 150020002500 DAD1 A, Sig=254,10 Ref=360,10 (ZHY11051001.D) DAD1 B, Sig=230,10 Ref=360,10 (ZHY11051001.D) DAD1 C, Sig=210,10 Ref=360,10 (ZHY11051001.D) DAD1 D, Sig=320,10 Ref=360,10 (ZHY11051001.D) DAD1 E, Sig=280,10 Ref=360,10 (ZHY11051001.D) min0 5 10 15 20 25 mAU 0100200 300400500 600 DAD1 A, Sig=254,10 Ref=360,10 (ZHY11051004.D) DAD1 B, Sig=230,10 Ref=360,10 (ZHY11051004.D) DAD1 C, Sig=210,10 Ref=360,10 (ZHY11051004.D) DAD1 D, Sig=320,10 Ref=360,10 (ZHY11051004.D) DAD1 E, Sig=280,10 Ref=360,10 (ZHY11051004.D) min0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 mAU -200-100 0100 200300400500 DAD1 A, Sig=254,10 Ref=360,100 (ZHY11060309.D) DAD1 B, Sig=230,10 Ref=360,100 (ZHY11060309.D) DAD1 C, Sig=210,10 Ref=360,100 (ZHY11060309.D) DAD1 D, Sig=280,10 Ref=360,100 (ZHY11060309.D) DAD1 E, Sig=320,10 Ref=360,100 (ZHY11060309.D) YMC C181 0%甲 醇80%甲 醇 60%甲 醇 min0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 mAU -200-1000 100200300 400500 DAD1 A, Sig=254,10 Ref=360,100 (ZHY11060309.D) DAD1 B, Sig=230,10 Ref=360,100 (ZHY11060309.D) DAD1 C, Sig=210,10 Ref=360,100 (ZHY11060309.D) DAD1 D, Sig=280,10 Ref=360,100 (ZHY11060309.D) DAD1 E, Sig=320,10 Ref=360,100 (ZHY11060309.D) min0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 mAU -200-1000 100200300 400500 DAD1 A, Sig=254,10 Ref=360,100 (ZHY11060309.D)254nm