目標(biāo)導(dǎo)航預(yù)習(xí)導(dǎo)引 目標(biāo)導(dǎo)航預(yù)習(xí)導(dǎo)引一二三四一、PCR原理1.概念:是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù),它能以極少量的DNA為模板,在幾小時內(nèi)復(fù)制出上百萬份的DNA拷貝。2.DNA復(fù)制需要的條件解旋酶、DNA母鏈、4種脫氧核苷酸、DNA聚合酶和引物。3.DNA的熱變性:在 80100 的溫度范圍內(nèi),DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體,雙鏈分開,這個過程稱為變性;當(dāng)溫度緩慢降低后,兩條彼此分離的DNA鏈又會重新結(jié)合成雙鏈,這個過程稱為復(fù)性。 4.PCR反應(yīng)的條件一定的緩沖溶液;DNA模板;分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物;四種脫氧核苷酸;耐熱的DNA聚合酶,一般用Taq DNA聚合酶;控制溫度。 目標(biāo)導(dǎo)航預(yù)習(xí)導(dǎo)引一二三四二、PCR反應(yīng)過程1.變性:當(dāng)溫度上升到 90 以上時,雙鏈DNA解聚為單鏈,一般實驗溫度為95 。 2.復(fù)性:溫度下降到50 左右,兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對與兩條單鏈DNA結(jié)合,一般實驗溫度為 55 。 3.延伸:溫度上升到 72 左右,溶液中的四種脫氧核苷酸在TaqDNA聚合酶的作用下,根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則合成新的DNA鏈。 PCR的變性過程實質(zhì)上也是解旋,PCR的解旋和細(xì)胞內(nèi)的DNA解旋有何不同?提示：PCR在高溫條件下(90100 )解旋,而細(xì)胞內(nèi)的DNA在解 旋酶的作用下解旋。 目標(biāo)導(dǎo)航預(yù)習(xí)導(dǎo)引一二三四三、實驗操作1.PCR儀:能夠自動調(diào)控溫度的儀器,實現(xiàn)DNA的擴(kuò)增。如果沒有PCR儀,可用3個恒溫水浴鍋代替,操作時在3個水浴鍋中來回轉(zhuǎn)移PCR反應(yīng)的微量離心管。2.微量離心管:一種薄壁塑料管,總?cè)莘e為0.5 mL。 3.微量移液器:用于添加轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體。 目標(biāo)導(dǎo)航預(yù)習(xí)導(dǎo)引一二三四四、操作提示1.為避免外源DNA等因素的污染,實驗中使用的一些用具在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌。2.PCR所用的緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份,并在-20 儲存。 3.微量移液器的槍頭在吸取試劑后必須更換。DNA很容易吸附在玻璃的表面,而不容易吸附在塑料的表面,由此推測PCR用到的微量離心管是用何種材質(zhì)加工制作的?提示：是用塑料加工制作的。 知識精要典題例解遷移應(yīng)用一二知識架構(gòu)一、PCR的原理及反應(yīng)過程1.PCR原理(1)概念多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù),它能以極少量的DNA為模板,在幾小時內(nèi)復(fù)制出上百萬份的DNA拷貝。(2)PCR原理DNA變性:在80100 的溫度范圍內(nèi),DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體,雙鏈分開,這個過程稱為變性。DNA復(fù)性:當(dāng)溫度緩慢降低后,兩條彼此分離的DNA鏈又會重新結(jié)合成雙鏈,這個過程稱為復(fù)性。DNA合成:DNA聚合酶從引物3端開始延伸DNA鏈,DNA合成 方向總是從子鏈的5端向3端延伸。 知識精要典題例解遷移應(yīng)用一二知識架構(gòu)(3)條件模板:兩條DNA母鏈。引物:能分別與兩條模板鏈結(jié)合的兩種引物。原料:四種脫氧核苷酸。酶:耐熱的DNA聚合酶。其他條件:穩(wěn)定的緩沖溶液和能自動調(diào)節(jié)溫度的條件等。 知識精要典題例解遷移應(yīng)用一二知識架構(gòu)2.PCR的反應(yīng)過程(1)PCR過程變性當(dāng)溫度上升到90 以上時,雙鏈DNA解聚為單鏈。復(fù)性溫度下降到50 左右,兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對與兩條單鏈DNA結(jié)合。 知識精要典題例解遷移應(yīng)用一二知識架構(gòu)延伸溫度上升到72 左右,溶液中的四種脫氧核苷酸(A、T、C、G)在DNA聚合酶的作用下,根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則合成新的DNA鏈。(2)結(jié)果PCR一般要經(jīng)歷30多次循環(huán),每次循環(huán)可以分為變性、復(fù)性和延伸三步。兩引物間固定長度的DNA序列呈指數(shù)擴(kuò)增(即2 n)。 一二知識精要典題例解遷移應(yīng)用知識架構(gòu)【例1】 在實驗室內(nèi)模擬生物體內(nèi)的DNA復(fù)制,需要哪些條件?()酶游離的脫氧核苷酸ATPDNA分子引物tRNA適宜的溫度適宜的酸堿度A.B.C.D.解析：在實驗室內(nèi)模擬DNA復(fù)制時,需要DNA聚合酶催化合成DNA子鏈;四種脫氧核苷酸為合成子鏈的原料;DNA母鏈為DNA復(fù)制的模板;還需要引物、適宜的溫度、適宜的酸堿度等。答案：D 一二知識精要典題例解遷移應(yīng)用知識架構(gòu) 一二知識精要典題例解遷移應(yīng)用知識架構(gòu) 一二知識精要典題例解遷移應(yīng)用知識架構(gòu) 一二知識精要典題例解遷移應(yīng)用知識架構(gòu)下列有關(guān)PCR的描述,不正確的是()A.是一種酶促反應(yīng)B.引物決定擴(kuò)增的特異性C.擴(kuò)增的對象是氨基酸序列D.擴(kuò)增的對象是DNA序列解析：PCR是特異擴(kuò)增兩個引物間的脫氧核苷酸序列,而不是氨基酸序列。答案：C 一二知識精要典題例解遷移應(yīng)用知識架構(gòu)細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制與PCR擴(kuò)增技術(shù)的比較 一二知識精要典題例解遷移應(yīng)用知識架構(gòu)注:解旋酶的作用是使DNA兩條鏈的氫鍵斷開,而DNA聚合酶都是催化形成磷酸二酯鍵的。 知識架構(gòu)一二知識精要典題例解遷移應(yīng)用二、PCR實驗操作和結(jié)果分析評價1.PCR體外擴(kuò)增DNA片段的實驗流程 知識架構(gòu)一二知識精要典題例解遷移應(yīng)用 知識架構(gòu)一二知識精要典題例解遷移應(yīng)用2.實驗中DNA含量的測定DNA在260 nm的紫外線波段有一強(qiáng)烈的吸收峰,峰值的大小與DNA的含量有關(guān)?？梢岳肈NA這一特點(diǎn)進(jìn)行DNA含量的測定,具體方法如下:(1)稀釋:2 L PCR反應(yīng)液,加入98 L蒸餾水,即將樣品進(jìn)行50倍稀釋(2)對照調(diào)零:以蒸餾水作為空白對照,在波長260 nm 處,將紫外分光光度計的讀數(shù)調(diào)節(jié)至零(3)測定:取DNA稀釋液100 L至比色杯中,測定260 nm處的光吸 收值 知識架構(gòu)一二知識精要典題例解遷移應(yīng)用(4)計算:DNA含量(g/mL)=50(260 nm的讀數(shù))稀釋倍數(shù) 一二知識精要典題例解遷移應(yīng)用知識架構(gòu)【例2】 下列有關(guān)PCR操作過程的敘述,錯誤的是 ()A.PCR反應(yīng)中使用的微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌B.PCR緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份,在-20 儲存C.PCR所用緩沖液和酶從冰箱拿出之后,迅速融化D.在微量離心管中添加反應(yīng)成分時,每吸取一種試劑后,移液器上的吸液槍頭都必須更換解析：為了防止外源DNA的污染,PCR反應(yīng)中所用的微量離心管、槍頭、緩沖液及蒸餾水等,在使用前要進(jìn)行高壓滅菌;還要將所用的緩沖液和酶分裝成小份;并且使用一次性吸液槍頭,A、B、D三項都正確。在使用前,將PCR所需試劑從冰箱內(nèi)拿出來,放在冰塊上緩慢融化,C項錯誤。 答案：C 一二知識精要典題例解遷移應(yīng)用知識架構(gòu) 一二知識精要典題例解遷移應(yīng)用知識架構(gòu) 一二知識精要典題例解遷移應(yīng)用知識架構(gòu)下圖表示PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物,請分析它是哪次循環(huán)的產(chǎn)物?()A.第一次循環(huán)B.第二次循環(huán)C.第三次循環(huán)D.第四次循環(huán)解析：在PCR反應(yīng)中,以引物為標(biāo)記,第一次循環(huán)時,以加入的DNA為模板,兩條DNA鏈可分別由引物和引物與其結(jié)合并在DNA聚合酶的作用下延伸,所以形成的每個子DNA中只有一種引物;從第二次循環(huán)開始,上次產(chǎn)生的DNA分子又可作為模板參與反應(yīng),所以會形成DNA分子兩端均含有引物的情況。因此題干中所出現(xiàn)的情況是第一次循環(huán)的產(chǎn)物。 答案：A 一二知識精要典題例解遷移應(yīng)用知識架構(gòu)幾種PCR方法有反轉(zhuǎn)錄PCR、擴(kuò)增未知序列的PCR、致突變PCR、定量PCR、免疫PCR等方法,PCR還可與其他方法聯(lián)合使用,有很多新的聯(lián)合法。(1)反轉(zhuǎn)錄PCR反轉(zhuǎn)錄PCR就是把RNA提取后反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)DNA,并以此互補(bǔ)DNA鏈為模板進(jìn)行的PCR反應(yīng)。通常用于檢測某種RNA是否被表達(dá),或者比較其相對表達(dá)水平。 一二知識精要典題例解遷移應(yīng)用知識架構(gòu)(2)實時熒光定量PCR所謂的實時熒光定量PCR就是通過對PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個循環(huán)產(chǎn)物的熒光信號的實時檢測,從而實現(xiàn)對起始模板定量及定性的分析。在實時熒光定量PCR反應(yīng)中,引入了一種熒光化學(xué)物質(zhì),隨著PCR的進(jìn)行,PCR產(chǎn)物不斷累積,熒光信號強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán),收集一個熒光強(qiáng)度信號,這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化,從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線。(3)免疫PCR免疫PCR是利用抗原抗體反應(yīng)的特異性和PCR擴(kuò)增反應(yīng)的極高靈敏性而建立的一種微量抗原檢測技術(shù)。 一二知識架構(gòu) 誤以為PCR過程中DNA聚合酶能對最初的DNA模板進(jìn)行完整的復(fù)制。PCR過程中,第一次循環(huán)時,只能從引物結(jié)合的部位開始。由引物延伸而成的DNA單鏈會與引物結(jié)合進(jìn)行DNA的延伸,由引物延伸而成的DNA單鏈會與引物結(jié)合進(jìn)行DNA的延伸,之后,DNA聚合酶只能特異地復(fù)制處于兩個引物之間的DNA序列,使這段固定長度的序列呈指數(shù)擴(kuò)增。 【例題】 在進(jìn)行DNA親子鑒定時,需大量的DNA。PCR技術(shù)(多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))可以使樣品DNA擴(kuò)增,獲得大量DNA克隆分子。該技術(shù)的原理是利用DNA的半保留復(fù)制,在試管中進(jìn)行DNA的人工復(fù)制(如下圖,圖中短粗線是引物)。在很短的時間內(nèi)將DNA擴(kuò)增上百萬倍,使實驗室所需的遺傳物質(zhì)不再受限于活的生物體。 (導(dǎo)學(xué)號52260016)(1)圖中的變性、延伸分別是指、。 (2)假設(shè)PCR反應(yīng)中的DNA模板為P,第一輪循環(huán)的產(chǎn)物2個子代DNA為N1,第二輪的產(chǎn)物4個子代DNA為N2,N1、N2中分別含有模板DNA單鏈的DNA分別有個、個。若繼續(xù)循環(huán),該DNA片段共經(jīng)過30次循環(huán)后能形成個DNA片段。 (3)某樣品的一個DNA分子中共含3 000個堿基對,堿基數(shù)量滿足:(A+T)/(G+C)=1/2,若經(jīng)5次循環(huán),至少需要向試管中加入個腺嘌呤脫氧核苷酸(不考慮引物所對應(yīng)的片段)。 (4)若下圖為第一輪循環(huán)產(chǎn)生的產(chǎn)物,請繪出以a鏈和b鏈為模板經(jīng)PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物。 解析：(1)變性的實質(zhì)是DNA雙鏈解旋;延伸的實質(zhì)是以DNA單鏈為模板,按堿基互補(bǔ)配對原則合成子鏈的過程。(2)由于PCR原理為DNA雙鏈復(fù)制,其特點(diǎn)是半保留復(fù)制,所以無論復(fù)制幾次,模板鏈一直存在于2個DNA分子中。DNA復(fù)制的數(shù)量變化是指數(shù)式增長方式。(3)由(A+T)/(G+C)=1/2可知A T G C=1 1 2 2,所以A的比例為1/6,在該DNA分子中的數(shù)量為3 0002(1/6)=1 000個,5次循環(huán)形成的DNA數(shù)為32個,所以由原料合成的DNA數(shù)相當(dāng)于32-1=31個,至少需腺嘌呤脫氧核苷酸為311 000=31 000個。(4)畫圖的關(guān)鍵是注意引物A、B的位置和所對應(yīng)的模板鏈。 答案：(1)模板DNA雙鏈解旋形成單鏈在DNA聚合酶的作用下,原料脫氧核苷酸聚合形成新的DNA鏈(2)22230(3)31 000(4)如圖