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2.2 動物細胞工程,【知識梳理】 一、動物細胞培養(yǎng) 1.操作流程： 組織 單個細胞的懸浮液 _____培養(yǎng) _____培養(yǎng),原代,傳代,2.培養(yǎng)條件： (1)無菌、無毒的環(huán)境：對_______和所有培養(yǎng)用具進行無菌處理， 添加_______，定期更換培養(yǎng)液以_____________。 (2)營養(yǎng)：除正常的有機和無機營養(yǎng)外，加入___________等一些 天然成分。 (3)適宜的溫度和pH：溫度為____________(哺乳動物)，pH為 _________。 (4)氣體環(huán)境：含95%空氣加_____的混合氣體，其中后者的作用是 _______________。 3.應(yīng)用：生物制品的生產(chǎn)，檢測_________，醫(yī)學(xué)研究。,培養(yǎng)液,抗生素,清除代謝產(chǎn)物,血清、血漿,36.50.5℃,7.2～7.4,5%CO2,維持培養(yǎng)液的pH,有毒物質(zhì),二、動物體細胞核移植技術(shù)和克隆動物 1.動物核移植：將動物一個細胞的_______移入一個已經(jīng)去掉細胞 核的_________中，使其重組并發(fā)育成一個新的胚胎，這個新的胚 胎最終發(fā)育為_________。,細胞核,卵母細胞,動物個體,2.過程： 3.原理：動物體細胞核具有_______。 4.結(jié)果：獲得與供體_________基本相同的個體。 5.克隆動物：用核移植方法得到的動物。,全能性,供體細胞培養(yǎng),遺傳物質(zhì),去核,重組細胞,胚胎移植,供體,三、動物細胞融合 1.原理：_______________。 2.融合方法：聚乙二醇(PEG)、___________、電激等。 3.意義：突破了_____________的局限，使_________成為可能， 也為制造___________開辟了新途徑。,細胞膜的流動性,滅活的病毒,有性雜交方法,遠緣雜交,單克隆抗體,四、單克隆抗體 1.制備過程：,雜交瘤細胞,能分泌所需,抗體,2.優(yōu)點：特異性強、_________，并可大量制備。 3.用途：作為_________，用于治療疾病和_________。,靈敏度高,診斷試劑,運載藥物,【速記卡片】 1.動物細胞培養(yǎng)過程： (1)分散細胞方法：組織塊剪碎，用胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理。 (2)生長特點：貼壁生長、接觸抑制。 (3)分瓶。 (4)原代培養(yǎng)：動物組織消化后的初次培養(yǎng)。 (5)傳代培養(yǎng)：分瓶繼續(xù)培養(yǎng)。,2.動物細胞培養(yǎng)的條件： (1)無菌、無毒的環(huán)境。 (2)營養(yǎng)：糖、氨基酸、促生長因子、無機鹽、微量元素、動物血清、血漿等。 (3)溫度和pH：與動物體溫相近，pH為7.2～7.4。 (4)氣體環(huán)境：CO2的主要作用是維持培養(yǎng)液的pH。 3.動物細胞融合： (1)原理：細胞膜的流動性。 (2)融合方法：聚乙二醇(PEG)、滅活的病毒、電激等。,4.單克隆抗體制備： (1)涉及的三種細胞作用不同。 B淋巴細胞：能分泌單一抗體，但不能無限增殖。 骨髓瘤細胞：能大量增殖，但不能產(chǎn)生抗體。 雜交瘤細胞：既能產(chǎn)生單一抗體，又能大量增殖。 (2)兩次篩選的目的不同。 第一次篩選是得到雜交瘤細胞。 第二次篩選是得到能分泌所需抗體的雜交瘤細胞。,考點一 植物組織培養(yǎng)、動物細胞培養(yǎng)和細胞核移植 1.三者比較：,2.動物細胞核移植的疑難解析： (1)卵母細胞選擇時期及原因：MⅡ中期的卵母細胞，此時具備受精能力，細胞質(zhì)中合成與分裂、分化有關(guān)的物質(zhì)能刺激融合后重組細胞進行分裂分化，形成重組胚胎。 (2)選卵細胞作為受體細胞的原因。 ①卵細胞大，易于操作。 ②卵黃多，營養(yǎng)豐富，為發(fā)育提供充足的營養(yǎng)。 ③能激發(fā)重組細胞分裂分化。,(3)供體細胞：取供體動物的體細胞培養(yǎng)，一般選用傳代10代以內(nèi)的細胞，因為10代以內(nèi)的細胞一般能保持正常的二倍體核型，保證了供體細胞正常的遺傳基礎(chǔ)。 (4)動物體細胞不能經(jīng)培養(yǎng)直接發(fā)育成完整個體的原因：動物體細胞的全能性受到限制。 (5)該過程用到的技術(shù)手段：動物細胞培養(yǎng)、動物細胞融合、早期胚胎培養(yǎng)和胚胎移植。,【高考警示】動物細胞培養(yǎng)和核移植技術(shù)的理解誤區(qū) (1)動物細胞培養(yǎng)中兩次使用胰蛋白酶的作用不同：第一次用胰蛋白酶處理剪碎的組織使之分散成單個細胞，第二次使貼壁細胞從瓶壁上脫落下來。 (2)核移植產(chǎn)生的克隆動物與提供細胞核的親本可能不同。 ①克隆動物細胞質(zhì)基因來源于另一個親本，與植物組織培養(yǎng)不同(來自一個親本)，即克隆動物遺傳物質(zhì)來自兩個親本。 ②在發(fā)育過程中可能發(fā)生基因突變、染色體變異導(dǎo)致性狀改變。 ③外界環(huán)境條件的影響引起不可遺傳的變異。,【考題回訪】 1.(2015銀川模擬)回答下列有關(guān)動物細胞培養(yǎng)的問題： (1)在動物細胞培養(yǎng)過程中，當貼壁細胞分裂生長到細胞表面______ 時，細胞會停止分裂增殖，這種現(xiàn)象稱為細胞的 。 此時，瓶壁上形成的細胞層數(shù)是 。要使貼壁的細胞從瓶壁上 分離下來，需要用酶處理，常用的酶是 。,(2)隨著細胞傳代次數(shù)的增多，絕大部分細胞分裂停止，進而出現(xiàn) 的現(xiàn)象；但極少數(shù)細胞可以連續(xù)增殖，其中有 些細胞會因遺傳物質(zhì)發(fā)生改變而變成 細胞，這種細胞 的黏著性 ，細胞膜表面蛋白質(zhì)(糖蛋白)的量 。 (3)用某種大分子染料對細胞進行染色時，觀察到死細胞被染色， 而活細胞不染色，原因是___________________________________ ________________________________________________________。,(4)檢查某種有毒物質(zhì)是否能改變細胞染色體的數(shù)目，最好選用分裂到 期的細胞用顯微鏡進行觀察。 (5)在細胞培養(yǎng)過程中，通常在 條件下保存細胞。因為在這種條件下，細胞中 的活性降低，細胞新陳代謝的速率降低。 (6)給患者移植經(jīng)細胞培養(yǎng)形成的皮膚后，發(fā)生了排斥現(xiàn)象，這是因為機體把移植的皮膚當作 進行攻擊。,【解題指南】解答本題需明確三個方面： (1)細胞貼壁生長與接觸抑制。 (2)胰蛋白酶和糖蛋白的作用。 (3)器官移植與排斥反應(yīng)。,【解析】(1)在動物細胞培養(yǎng)過程中，細胞會表現(xiàn)出接觸抑制現(xiàn)象，此時是單層細胞。用胰蛋白酶處理可以使貼壁的細胞從瓶壁上分離下來。 (2)隨著細胞傳代培養(yǎng)代數(shù)的增多，絕大部分細胞分裂停止，進而出現(xiàn)衰老甚至死亡的現(xiàn)象，但極少數(shù)細胞可以連續(xù)增殖，有些細胞會因遺傳物質(zhì)改變而變成不死性細胞，這種細胞細胞膜表面糖蛋白減少，細胞黏著性降低。 (3)由于活細胞的膜具有選擇透過性，大分子染料不能進入活細胞內(nèi)，而死細胞的細胞膜喪失了選擇透過性，大分子染料能夠進入死細胞內(nèi)而著色。,(4)由于細胞分裂中期染色體形態(tài)固定、數(shù)目清晰，因此最好選用分裂到中期的細胞用顯微鏡觀察染色體數(shù)目。 (5)由于在冷凍、超低溫或液氮條件下，細胞中酶的活性降低，細胞新陳代謝的速率降低，通常在此條件下保存細胞。 (6)機體把移植的皮膚當作抗原攻擊，會發(fā)生排斥現(xiàn)象。,答案：(1)相互接觸 接觸抑制 單層(或一層) 胰蛋白酶 (2)衰老甚至死亡 不死性 降低 減少 (3)活細胞的膜具有選擇透過性，大分子染料不能進入活細胞內(nèi)，故活細胞不能著色(或死細胞的膜喪失了選擇透過性，大分子染料能夠進入死細胞內(nèi)而著色) (4)中 (5)冷凍(或超低溫、液氮) 酶 (6)抗原,2.(2015安徽名校聯(lián)考)如圖所示是利用現(xiàn)代生物工程技術(shù)治療遺傳性糖尿病(基因缺陷導(dǎo)致胰島B細胞不能正常合成胰島素)的過程設(shè)計圖解，請據(jù)圖回答下列問題：,(1)圖中①、②所示的結(jié)構(gòu)分別是 、 。 (2)圖中③、④所示的生物工程技術(shù)分別是 、 ，此外圖示過程還應(yīng)用的工程技術(shù)有_______(只需寫一種)。 (3)過程③通常用去核卵母細胞做受體細胞的原因除了它體積大、 易操作外，還因為 。,(4)過程④通常用②作受體細胞的原因是這些細胞沒有分化， 具有 ，可以定向誘導(dǎo)分化成各類細胞、組織和器官。 (5)過程④的完成需要用到的基因操作工具有 。 (6)圖示方法與一般的異體移植相比最大的優(yōu)點是 。,【解析】圖中①～④依次為細胞核、內(nèi)細胞團、核移植技術(shù)、轉(zhuǎn)基因技術(shù)。圖中涉及的技術(shù)包括核移植技術(shù)、早期胚胎培養(yǎng)(動物細胞培養(yǎng))、轉(zhuǎn)基因技術(shù)、胚胎干細胞移植等。,答案：(1)細胞核 內(nèi)細胞團 (2)核移植技術(shù) 轉(zhuǎn)基因技術(shù) 細胞培養(yǎng)(早期胚胎培養(yǎng)、胚胎干細胞移植、顯微操作技術(shù)等) (3)營養(yǎng)物質(zhì)豐富且含有促進細胞核全能性表達的物質(zhì) (4)全能性 (5)限制性核酸內(nèi)切酶、DNA連接酶和載體 (6)沒有排斥反應(yīng),【加固訓(xùn)練】現(xiàn)有A和B兩個肉牛品種，A品種牛的細胞組成可表示為 A細胞核、A細胞質(zhì)，B品種牛則為B細胞核、B細胞質(zhì)。 (1)如果要獲得一頭克隆牛，使其細胞由A細胞核和B細胞質(zhì)組成，基 本步驟是：從A品種牛體內(nèi)取出體細胞，進行體外培養(yǎng)，然后再從培 養(yǎng)細胞中取出 注入B品種牛的 卵母細胞，經(jīng)過某種 刺激和培養(yǎng)后，可形成胚胎，該胚胎被稱為 ，將該胚胎移 入代孕母牛的 中，通過培育可達到目的。,(2)克隆牛的產(chǎn)生說明 具有全能性?？寺∨５男誀钪饕憩F(xiàn) 品種牛的特征。由A、B兩品種牛雜交得到的牛與克隆牛相 比，雜交牛細胞核的遺傳物質(zhì)來自 個親本，細胞質(zhì)來自 性親本，克隆牛和雜交牛的遺傳物質(zhì)組成 (填“相 同”或“不同”)。,【解析】(1)依據(jù)題意可知，要獲得由A細胞核和B細胞質(zhì)組成的重組細胞，就要提取A細胞核然后與去掉細胞核的B細胞質(zhì)進行重組，得到重組細胞，進一步培養(yǎng)得到重組胚胎，再進行胚胎移植，移植到代孕母牛的子宮里進行培育。 (2)克隆動物利用的是動物細胞細胞核的全能性，得到的新個體的性狀主要由細胞核決定，與供核母牛的性狀基本一致，雜交牛是由精子和卵細胞融合得到受精卵，細胞核來自兩個親本，由于精子含有很少的細胞質(zhì)，受精卵的細胞質(zhì)主要來自卵細胞，所以雜交牛和克隆牛的遺傳物質(zhì)是不同的。,答案：(1)細胞核 去核 重組胚胎 子宮 (2)動物體細胞核 A 兩 雌 不同,考點二 動物細胞融合、單克隆抗體 1.植物體細胞雜交和動物細胞融合的比較：,2.單克隆抗體的制備：,【高考警示】植物體細胞雜交和動物細胞融合過程中所選酶和結(jié)果的辨析 (1)植物體細胞雜交與動物細胞融合中酶的作用對象不同，纖維素酶和果膠酶作用于細胞壁，而胰蛋白酶作用于細胞間的蛋白質(zhì)。 (2)植物雜交細胞在激素誘導(dǎo)下能表達出全能性，但動物雜交細胞的全能性不能表達。 (3)取相應(yīng)B淋巴細胞前必須先注射相應(yīng)抗原，否則不能獲得單克隆抗體。,【考題回訪】 1.(2014新課標全國卷Ⅰ)某研究者用抗原(A)分別免疫3只同種小鼠(X、Y和Z)，每只小鼠免疫5次，每次免疫一周后測定各小鼠血清抗體的效價(能檢測出抗原抗體反應(yīng)的血清最大稀釋倍數(shù))，結(jié)果如圖所示。若要制備雜交瘤細胞，需取免疫后小鼠的B淋巴細胞(染色體數(shù)目40條)，并將該細胞與體外培養(yǎng)的小鼠骨髓瘤細胞(染色體數(shù)目60條)按一定比例加入試管中，再加入聚乙二醇誘導(dǎo)細胞融合，經(jīng)篩選培養(yǎng)及抗體檢測，得到不斷分泌抗A抗體的雜交瘤細胞。,回答下列問題： (1)制備融合所需的B淋巴細胞時，所用免疫小鼠的血清抗體效價需達 到16 000以上，則小鼠最少需要經(jīng)過 次免疫后才能有符合 要求的。達到要求后的X、Y、Z這3只免疫小鼠中，最適合用于制備B 淋巴細胞的是 小鼠，理由是 。,(2)細胞融合實驗完成后，融合體系中除含有未融合的細胞和雜交 瘤細胞外，可能還有_____________________________________ ，體系中出現(xiàn)多種類型細胞的原因是___________ _______________________________________________________。 (3)雜交瘤細胞中有 個細胞核，染色體數(shù)目最多是 條。 (4)未融合的B淋巴細胞經(jīng)多次傳代培養(yǎng)后都不能存活，原因 是 。,【解題指南】 (1)題干關(guān)鍵詞：“效價”“雜交瘤細胞”“傳代培養(yǎng)”。 (2)隱含信息：柱形圖中效價越高，能檢測出抗原抗體反應(yīng)的血清最大稀釋倍數(shù)越大，說明免疫后小鼠的B淋巴細胞產(chǎn)生抗體的能力越強。 (3)關(guān)鍵知識：制備單克隆抗體的技術(shù)流程和動物細胞體外培養(yǎng)的過程。,【解析】本題考查制備單克隆抗體的相關(guān)知識。 (1)據(jù)圖中數(shù)據(jù)分析，第四次注射后Y、Z小鼠的血清抗體效價均達到16 000以上，免疫后小鼠Y的B淋巴細胞產(chǎn)生抗體效價最高，最適用于制備單克隆抗體。 (2)B淋巴細胞與骨髓瘤細胞混合在一起融合時，可能發(fā)生B淋巴細胞之間的融合，骨髓瘤細胞之間的融合和B淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，故體系中會出現(xiàn)多種類型的細胞。,(3)雜交瘤細胞形成后，小鼠的B淋巴細胞核與其骨髓瘤細胞核會融合形成一個細胞核。染色體可達100條，有絲分裂后期染色體數(shù)目最多為200條。 (4)未融合的B淋巴細胞經(jīng)多次傳代培養(yǎng)后，仍然不是能惡性增殖的細胞，分裂次數(shù)是有限的。,答案：(1)四 Y Y小鼠的抗體效價最高 (2)B淋巴細胞相互融合形成的細胞，骨髓瘤細胞相互融合形成的細胞 細胞融合是隨機的，沒有特異性且融合率達不到100% (3)1 200 (4)不能無限增殖,2.(2015濰坊模擬)人絨毛膜促性腺激素(HCG)是女性懷孕后胎盤滋養(yǎng)層細胞分泌的一種糖蛋白，制備抗HCG單克隆抗體可用于早孕的診斷。如圖是抗HCG單克隆抗體制備流程示意圖，請分析回答問題。,(1)制備單克隆抗體過程中要用到 和 技術(shù)。 (2)制備單克隆抗體過程中，給小鼠注射的HCG相當于 ， 使小鼠產(chǎn)生分泌相應(yīng) 的淋巴細胞，此過程屬于特異性免 疫中的 免疫。,(3)在細胞內(nèi)DNA的合成一般有兩條途徑，主要途徑是在細胞內(nèi)由糖 和氨基酸合成核苷酸，進而合成DNA，而氨基嘌呤可以阻斷此途徑。 另一輔助途徑是在次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情況下，經(jīng)酶的 催化作用合成DNA，而骨髓瘤細胞的DNA合成沒有此輔助途徑。 ①利用DNA合成途徑不同的特點配制的HAT培養(yǎng)基含有多種成分，其 中添加的 具有篩選雜交瘤細胞的作用。 ②最終篩選獲得的雜交瘤細胞的特點是 。 (4)此過程生產(chǎn)的單克隆抗體可以與__________________________ 特異性結(jié)合，從而診斷早孕。,【解題指南】解答本題的關(guān)鍵： (1)明確單克隆抗體的制備過程。 (2)熟知在培養(yǎng)基中能夠生長增殖的細胞是具有DNA復(fù)制途徑的細胞。,【解析】(1)制備單克隆抗體過程中要用到動物細胞培養(yǎng)和動物細胞融合技術(shù)。(2)給小鼠注射HCG，使小鼠進行體液免疫，產(chǎn)生能分泌抗體的B淋巴細胞。(3)骨髓瘤細胞的DNA合成只有一條途徑，在培養(yǎng)基中加入氨基嘌呤，阻斷了骨髓瘤細胞與骨髓瘤細胞融合體的增殖。雜交瘤細胞有兩條合成DNA的途徑，因此在選擇培養(yǎng)基上雜交瘤細胞能生存并無限增殖。B淋巴細胞和骨髓瘤細胞融合后的雜交瘤細胞既能無限增殖，又能產(chǎn)生單一抗體。(4)此單克隆抗體是針對人絨毛膜促性腺激素(HCG)作抗原產(chǎn)生的，可以與人絨毛膜促性腺激素(HCG)特異性結(jié)合。,答案：(1)動物細胞培養(yǎng) 動物細胞融合 (2)抗原 抗體 體液 (3)①氨基嘌呤 ②能無限增殖并分泌特異性抗體 (4)人絨毛膜促性腺激素(或HCG),【延伸探究】題中(3)經(jīng)過氨基嘌呤處理后，能夠存活的細胞類型有哪些？ 提示：由于骨髓瘤細胞沒有DNA合成的輔助途徑，而氨基嘌呤阻斷主要途徑，所以經(jīng)處理后，能夠存活的細胞是B淋巴細胞和B淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合后的細胞。,【加固訓(xùn)練】如圖為制備單克隆抗體和多克隆抗體的示意圖，據(jù)圖回答下列問題：,(1)圖中向小鼠注射包含多種抗原決定簇的抗原后，所獲得的免疫 抗血清實際上是含有 (填寫抗體的名稱)的混合 物，這種方法制備的多克隆抗體不僅產(chǎn)量低、而且純度低。 (2)圖中選用B淋巴細胞和骨髓瘤細胞融合成雜交瘤細胞，說明細胞 膜具有 ，如果僅考慮細胞的兩兩融合，其融合細胞有 種類型。,(3)圖中兩次篩選的目的不同，其中篩選①的目的是篩選出 ，篩選②的目的是篩選出 。 (4)科學(xué)工作者正在研究的用于治療癌癥的“生物導(dǎo)彈”就 是 。用“生物導(dǎo)彈”治療癌癥的方法優(yōu) 于化療的原因是_________________________________________ _______________________________________________________。,【解析】(1)結(jié)合題圖可看出獲得的免疫抗血清實際上是Ab1、Ab2、Ab3、Ab4多種抗體的混合物。 (2)動物細胞融合的過程體現(xiàn)了細胞膜的流動性；僅考慮兩個細胞的融合，可得到B淋巴細胞+B淋巴細胞、骨髓瘤細胞+骨髓瘤細胞及B淋巴細胞+骨髓瘤細胞3種類型的融合細胞。 (3)在單克隆抗體的制備過程中，篩選①的目的是篩選出雜交瘤細胞，篩選②的目的是獲得能分泌所需抗體的雜交瘤細胞。,(4)把單克隆抗體跟抗癌藥物相結(jié)合制成“生物導(dǎo)彈”，注入患者體內(nèi)，借助單克隆抗體的導(dǎo)向作用，能將藥物定向帶到癌細胞所在位置，在原位殺死癌細胞。這樣既不損傷正常細胞，又減小了用藥劑量，而且療效高、毒副作用小。 答案：(1)Ab1、Ab2、Ab3、Ab4 (2)流動性 3 (3)雜交瘤細胞 能分泌所需抗體的雜交瘤細胞 (4)單克隆抗體上連接抗癌藥物 可以原位殺死癌細胞，還不損傷正常細胞，且用藥劑量小，療效高、毒副作用小,