氣相色譜法（ GC）在 2010版 中國藥典 中的應用 孫仁爽 單位：通化師范學院 電話： 13624355398 QQ： 804590217 檢測器 進樣器 色譜柱 GAS 氣源 柱溫箱 數(shù)據(jù)處理 一、氣相色譜儀的配置 氣源的配置 配 FID檢測器需購買 N2、 H2和 Air三種氣體。 提供氣體兩種方式： 鋼瓶 （需提前準備好）和 氣體發(fā)生器 （購買儀器的時候從廠家訂購）。鋼瓶純度高，但氫氣鋼 瓶易泄露發(fā)生危險，可購買氫氣報警器或放室外小房子。 發(fā)生器氣體純度稍低，安全性高。通化購買不到高純氣體， 一般到長春購買。標配為氮氣用鋼瓶，氫氣和空氣用發(fā)生 器。目前有氮氫空一體機， FID和 TCD可滿足要求， ECD 達不到要求。 氣體凈化裝置： 脫氧管、脫水管、脫烴管 。 進樣系統(tǒng)：包括 樣品引入裝置 和 氣化室 （進樣口）。 樣品引入裝置： 10uL微量注射器、自動進樣器和頂空進樣 器（做溶劑殘留、樹脂殘留需配置）。 進樣口：標配為前進樣口為填充柱進樣口、后進樣口為分 流不分流進樣口。 柱子的選擇（填充柱和毛細管柱） 根據(jù)標準要求購買，購買的時候明確柱子型 號最好，毛細管柱主要為 聚硅氧烷類 和 聚乙二醇 類。開發(fā)新方法時，首選 非極性固定相 ，柱效高， 對氧不敏感、最高使用溫度高、柱壽命長優(yōu)點。 檢測器 標配為 I （大多數(shù)有機化合物） /TCD（微量 水分測定）和 CD（有機氯農(nóng)殘）。 氮磷檢測器 （有機磷農(nóng)藥殘留方法已被 05藥典附錄收載，但 具體品種的檢驗尚未開展） 工作站：廠家自帶工作站，可要求廠家安裝。 N2000。 通化師范學院有氣相、頂空、分流、農(nóng)殘檢測器，藥典標 準要求的氣相條件已完全具備，可以委托做樣和開發(fā)方法。 儀器標準配置 氣源：氮氣鋼瓶、氫氣發(fā)生器和空氣發(fā)生器。 凈化裝置：無 ECD可不配。 進樣口：填充柱進樣口和分流 /不分流進樣口 樣品引入裝置：手動進樣器（ 10uL）和頂空 進樣器 柱子：根據(jù)標準要求。 檢測器： FID和 ECD（農(nóng)殘） 工作站：廠家工作站或 N2000 需要購買儀器的情況 無氣相色譜儀：一般為委托檢驗。 建議：根據(jù)樣品和藥典、局頒標準和企業(yè) 標準按標配配齊，節(jié)省成本。 現(xiàn)有標準無法滿足標準要求如有 GC，未配 置分流不分流進樣口和頂空、 ECD， 建議：對儀器進行升級。 任務重， GC不夠用。建議：買同型號（可 替換）或不同型號（方法學驗證）均可。 二、合格的 GC操作者應具備的知識 1. 保管好安裝光盤和說明書，熟悉配件。 2.使用純度合乎要求的氣體，防止檢測器和柱子 被污染。 購買要告訴氣體生產(chǎn)廠家要五個 9氣體 或高純氣體。填充柱以 FID為檢測器也可以用四個 9氣體。氣體剩下 0.2Mpa就不要再用，如果有管 路泄露或氣體用盡，鋼瓶易被污染，灌裝前需凈 化處理，需要幾百元費用，而一瓶氣體一般價值 幾百元，因此定期用肥皂水做泄露檢查。 3.使用性能可靠的二級減壓閥（氧氣表） 。氣體發(fā)生 器不需要，一般需藥廠自己準備好，避免工程師調試 的時候無法安裝，要求高，一般在外地購買，氧氣表 右邊的表顯示鋼瓶氣體壓力，左邊表顯示減壓輸出后 氣體壓力。 4.定期更換氣體凈化器填料（氣源與儀器之間，配 ECD檢測器最好配置）變色硅膠變紅時需要活化， 140 加熱 2h。分子篩等吸附有機物的凈化器就不好 用肉眼判斷了，須定期更換。空氣壓縮機有機雜質高 一些，最好 3個月更換一次，馬福爐 400600加熱 4- 6h。 5.會測定氣體的流速和計算分流比 氣體的流速單位一般用 mL/min表示，一般用皂膜 流量計測定。氫氣的流速 30-40之間，空氣的流速 一般在 300-400之間，載氣的流速根據(jù)樣品和色 譜柱的種類決定，測完氫氣、空氣、尾吹氣的流 速減掉載氣流速。隔膜吹掃（用途）一般是 1。尾 吹氣（用途）是 20-30之間。分流出口流量根據(jù)需 要測定。分流比 =（分流出口流量 +柱流量） /柱流 量。氮氣：氫氣：空氣 =1:1:10FID靈敏度最高。 6.進樣口的維護 能更換進樣口隔墊、清洗進樣口襯管（玻璃毛）、 襯管上端的 O形硅橡膠密封圈、清洗分流平板。 每 6-12個月或當指示 型捕集阱顏色改變時 更換時間取決于捕集 阱的容量與氣體純度 每 1-2年校準一 次 每 3個月 當發(fā)現(xiàn)注射器中有明顯的清 洗不掉的污染物 , 或推桿難 以抽動 , 或當推桿粘連時 , 或 進樣口隔墊穿刺出現(xiàn)異常 , 或當針頭被堵塞時 每 60針樣品 裂口 , 進樣口襯管內(nèi) 有碎屑 , 保留時間偏 移 , 柱壓降低等等 每月 與襯管一起更換 , 或視磨損情況更換 每周 經(jīng)常檢查 , 當襯 管內(nèi)有可見的 污染物或色譜 性能下降時更 換 每月 經(jīng)常檢查 , 當有劃痕 , 腐蝕或非揮發(fā)性組分 造成堵塞 , 污染時更換 每次更換色譜柱 , 進樣口 /檢測器部 件時更換 GC消耗品更換時間表 7. 及時清洗注射器，取樣的時候會排氣泡， 注射速度越快越好，且每次注射的過程重 現(xiàn)性要好，取樣之前用溶劑洗 3次（每次抽 滿 2/3），樣品溶液洗 3次，然后取樣。 8. 會更換柱子（插入進樣口和檢測器的深 度，用換下的隔墊插到柱子上。換下的柱 子堵上盲堵，第一次沒有方向，一般讓牌 子從正面看到，用過一次就有方向）。 柱子安裝 進樣口端使色譜柱穿過墊圈伸出 4-6mm， 把隔墊向上滑到柱螺帽將柱插入進樣口， 把柱上的螺帽和墊圈向上滑到進樣口底部， 用手擰緊柱螺帽至柱固定，調節(jié)色譜柱的 位置，使柱上隔墊正好在柱螺帽底部扳 手擰緊 1/4-1/2圈。 檢測器一端：將柱螺母和墊圈插入到檢測 器接頭底部，接頭用手擰緊，再將柱子下 拉 1mm，扳手擰緊 -1/4圈，檢漏。 （液相柱區(qū)別） 切割柱子、切割銅管，及時更換毛細管柱 密封墊。安裝完色譜柱做泄露檢查，尤其 是連檢測器的一端。準備一份色譜柱測試 標樣，做柱效測定，看色譜柱是否合格以 及確定問題是否在色譜柱。柱子牌子信息： 長度、內(nèi)徑、固定液厚度、溫度范圍。柱 子的老化（ 40 -50 /10 /min 升至最高 使用溫度 2-3h，不連接檢測器，不用氫氣 作為老化載氣。何時老化？新柱子和長時 間未用的柱子或色譜峰異常）。老化目的 除去填充物中殘留揮發(fā)性成分，并使固定 液再一次均勻牢固地分布在載體表面上。 9.檢測器的維護 點火線圈的更換、噴嘴的清洗、注意不要 燙傷。開機先開載氣，檢測到柱子流量后 再升溫，否則將破壞柱子和檢測器。 FID檢 測器溫度達到 150度才能點火，判斷是否已 經(jīng)點著火。關機是先關氫氣和空氣，再降 溫度，最后關載氣（保護檢測器和柱子）。 熱導檢測器注意通電之前，確保載氣通過 了檢測器，否則，錸鎢絲易被燒斷。關機 先關檢測器電源，然后關載氣。注意錸鎢 絲易被氧化。電子捕獲注意放射性危害， 不允許自己拆卸，廠家工程師或專業(yè)人員， ECD出口排到室外。 10.會數(shù)據(jù)處理 內(nèi)標法 （內(nèi)標校正因子法和內(nèi)標工作曲線法） 可消除進樣量不準確誤差， GC進樣量一 般為 1uL，液相是 10uL、 20uL， GC更 易出現(xiàn)進樣誤差，自動進樣器準確度可 滿足要求，手動進樣最好用內(nèi)標法定量。 需要內(nèi)標物。 廣藿香 注意結果要求： mg/g、每片含、標示百分含量 / /RR As C sf AC /ss AxC x f AC 對照品溶液得標準曲線 AR/AS=aCR+b，將 Ai/As代入曲線計算。 得標準曲線：工作站、計算器、 EXCEL 外標法 （外標一點法和工作曲線法） R R AxC x C A 面積歸一化法 粗略考察，需全部出峰且都被檢測到，溶劑峰去 掉，不易用于微量雜質的檢查，一般用于同系物 的含量測定。 11 1 1 1 2 2 % f f f f n A X A A A n 硬脂酸鎂中硬脂酸含量、大豆油（供注射用） 標準溶液加入法 （頂空進樣） 頂空中供試品和對照品處于不相同基質中，如有不同，加入法為準 配置適當濃度對照品溶液（ 0.5mg/ml），取一定量 （ 2mL）加入到供試品溶液（ 8mL）中，對照品加 入前后各進樣 2uL。 Ax=40， Ais=60。 三、 15版藥典的總體構想 將凡例、附錄（制劑通則、通用分析方法、指導 原則）、藥用輔料整合成公共部分，稱為總則。 藥品正文保留一部、二部、三部。 一部分為上下兩卷，上卷收載藥材、飲片、植物 油脂與提取物；下卷收載成方制劑。 將應用廣泛、成熟的相關測定方法，以附錄形式 收入中藥一部。如黃芩苷、芍藥苷升格為附錄。 二部為化學藥 三部為生物制品 解決系列品種多標準并列問題。合并同類項，建 立系列品種的通用標準，統(tǒng)一鑒別、檢查、含量 測定如六味地黃系列、藿香正氣系列。 15版藥典原則上不再收載新方法，主要加強 10版 新收載方法的推廣。如一測多評、特征圖譜和指 紋圖譜、 DNA分子鑒定、薄層生物自顯影技術等。 重視引導、推廣、支持國產(chǎn)檢驗儀器的發(fā)展和應 用，開展了國產(chǎn)儀器驗證工作（與國外對比試驗， 進行重復性、 檢測限等 ）。檢測限 (與靈敏度區(qū)別 ) 和定量限的計算。如進一個濃度 0.1ug/mL的對照 品溶液，得到該組分的信噪比為 60:1，檢測限為 3 倍信噪比，定量限為 10倍信噪比。 按照藥典勘誤改正藥典。 四、執(zhí)行藥典之配套及參考圖書 中國藥典 英文版 中國藥典注釋 90版有， 10版即將出版。 臨床用藥須知 中國藥典中藥材粉末顯微鑒別圖鑒 中國藥典中藥薄層色譜圖集 中國藥典中藥材及原植物彩色圖鑒 中藥飲片炮制規(guī)范 ， 15年 全國中藥飲片炮制 規(guī)范 五、 GC法在 2010版 中國藥典 中的應用 凡例： 藥典凡例第十條關于溶劑殘留。 正文 一部中藥材與飲片：冰片中龍腦含量、 農(nóng)藥殘留 （甘草、 黃芪） 植物油脂和提取物：三七三醇皂苷的樹脂殘留、燈盞花 素 溶劑殘留 、滿山紅油 特征圖譜 、薄荷素油 指紋圖譜 中成藥：西瓜霜潤喉片冰片、小兒感冒口服液百秋李醇 冰片（合成龍腦） 本品含龍腦不得少于 55.0% 滿山紅油 特征圖譜 從中藥指紋圖譜中選取若干專屬性強的色譜峰組成特征 指紋圖譜，用于中藥的專屬性鑒別。 薄荷素油指紋圖譜 斜率靈敏度： 平直的色譜基線其斜率為 0，當出現(xiàn) 色譜峰時斜率會快速增大，當斜率大于或等于設 定值，積分儀就認為是出峰了，便開始積分。當 斜率由正變負，即為色譜峰的最大值即峰高。峰 出完后，斜率的絕對值變小，低于設定值時，積 分儀認為峰結束，停止積分。 峰寬： 設定采集數(shù)據(jù)速率的。峰寬設定越小，采 集速率越快。對于很窄的峰，采集速率應足夠快， 否則會使峰形畸變，甚至丟失；對于很寬的峰， 采集速率可慢一些。否則信號的微小波動也作為 峰處理，將峰分裂為幾個峰。 最小峰高： 符合斜率標準，信號大于最小峰高時 開始積分。閥值越大，色譜峰開始積分點推后， 結束點越提前。 最小峰面積： 當積分結束后，某一色譜峰是否參 與最后的計算，取決于最小峰面積的設定值。 前三個決定積分的準確性。三者要相互配合。 如基線噪聲大而色譜峰也都較大時，斜率的設置 難以有效除去噪聲，將峰寬或最小峰高設大一些。 對很小的色譜峰積分時，將最小峰高設小一些， 峰寬設大一些，色譜峰一般比基線噪聲的寬度大。 程序升溫分析時，高溫下基線會出現(xiàn)不同程度的 漂移，將斜率設大一些，避免誤將基線漂移作為 峰來處理。 最小峰面積積分后計算時才使用，對于歸一化法 要注意最小峰面積的設定。 中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng) 本軟件系統(tǒng)包括兩個應用版本：研究版（ 2004 A）和檢驗 版（ 2004 B）。研究版主要用于科學研究工作，具有生成 對照圖譜功能。檢驗版?zhèn)戎赜谏V指紋圖譜的檢驗工作， 功能簡化，不具有生成對照圖譜的功能。 本系統(tǒng)支持三種格式文件的導入： AIA(即 *.cdf)文件，文 本文件（ *.txt）和 Scp(*.Scp)格式文件的導入。 建議采用 通用的 AIA（ *.cdf）格式文件導入。注意 AIA（ *.cdf）文 件中應包含樣本圖譜的峰面積信息，在色譜工作站導出 AIA（ *.cdf）文件前應現(xiàn)進行積分。否則導出的 AIA （ *.cdf）文件可能因不包含峰面積信息而無法導入。 文件導入 設參照圖譜 自動匹配 對照圖譜生成 相似 度評價 打印報告 如需要開發(fā)指紋圖譜的新方法和進行相似度評價可以免費 代做。 二部 乙醇中揮發(fā)性雜質的檢查 (藥典勘誤 )、 明膠空心膠囊中氯乙醇和環(huán)氧乙烷的檢查、 吐溫類、聚乙二醇類的雜質檢查、纖維素 類甲氧基、乙氧基和羥丙氧基、丙二醇中 有關物質的檢查、溶劑殘留檢查。 明膠空心膠囊（腸溶明膠空心膠囊）的限量檢查 氯乙醇為空心膠囊用環(huán)氧乙烷消毒過程衍生的有 機物質，為親肝性毒物，沸點 128-130 。 C=2ug/mL V=1mL S=2.0g 1 2 / 0.0001% 2 10 6 V C ug mLL S 附錄 制劑通則 ：流浸膏、藥酒、酊劑的乙醇、藥酒和口 服酊劑的甲醇檢查。 通用檢測方法： 乙醇量檢查法 甲醇量檢查法 水分測定法第四法 -氣相色譜法（一部） 溶劑殘留檢查法 農(nóng)藥殘留檢查法 桉油精含量測定方法 甲氧基、乙氧基和羥丙氧基測定法 附錄 IX M 乙醇量測定法 （蒸餾法與 GC法不一致，以后者為準） 以正丙醇為內(nèi)標物 (在不含內(nèi)標物的供試品溶液中， 內(nèi)標物的位置不得出現(xiàn)雜質峰 )， FID測定各種制劑 （藥酒、酊劑、流浸膏劑）在 20 時乙醇的含量 （ %）（ mL/mL ）。 如藿香正氣水 檢查 乙醇量應為 40-50%（附錄 IX M） 標準溶液的制備 量取恒溫至 20 無水乙醇 4、 5、 6mL，置 100mL量 瓶中，分別精密加入恒溫至 20 正丙醇 5mL，加 水定容。進樣得校正因子。 (CR=4%、 5%、 6%， CS=5%) 供試品溶液的制備 量取恒溫至 20 的供試品（ 約相當于乙醇 5mL，如藿 香正氣水含 40-50%， 10 mL）置 100mL量瓶中，分別 精密加入恒溫至 20 正丙醇 5mL，加水定容，進 樣測含量。 （ CS=5%) 注意：毛細管柱法稀釋 100倍后進樣。計算過程一樣。 /ss AxC x f AC / /RR As C sf AC 系統(tǒng)適應性實驗 毛細管法（ INNOWAX， 0.53mm，氣液色譜） 上述 3份標準溶液各進樣 3次， 9個校正因子 RSD2.0%，塔板數(shù)正丙醇 8000， Rs 2.0 (出現(xiàn)峰形變差可提高柱溫老化柱子 ) 填充柱法（ GDX， 2m，氣固色譜） 塔板數(shù)正丙醇 700（如不滿足，改變進樣口、柱、檢測器溫度） 規(guī)定 :重復性（內(nèi)標） -80%、 100%、 120%，至少做 2次，校正因子 RSD2.0%。 (外標 )-同一溶液進 5次。 各品種項下規(guī)定的色譜條件，除檢測器種 類、固定液品種及特殊指定的色譜柱材料 不得改變外，其余如色譜柱內(nèi)徑、長度、 載體牌號、粒度、固定液涂布濃度、載氣 流速、柱溫、進樣量、檢測器的靈敏度等， 均可適當改變，以適應系統(tǒng)適應性試驗的 要求。 補 充 為滿足系統(tǒng)適用性要求，有時需要調整流動相組 分的比例。以組分比例較低者 (小于或等于 50%) 相對改變量不超過 30%且絕對改變量不超過 10%為限，如 30%相對改變量的數(shù)值超過 10% 時，則改變量以 10%為限。 二元流動相系統(tǒng) 50： 50 50%的最大相對改變量為 15%，已超過了絕對改 變量允許的范圍，比例調節(jié)的范圍是 10%，即 40： 60至 60： 40。 2： 98 2%的最大相對改變量為 0.6%，比例調節(jié)的范圍 是 1.4： 98.6至 2.6： 97.4 三元流動相系統(tǒng)（ 60： 35： 5） 可每次調節(jié)比例較低的兩個組分。 對于 35%的組分，其最大相對改變量為 10.5%，已超過了絕對改變量允許的范圍， 故該組分比例調節(jié)的范圍是 10%，即 25%-45%，則流動相系統(tǒng)比例的調節(jié)范圍 是 50： 45： 5至 70： 25： 5 對于 5%的組分 ,其最大相對改變量為 1.5%, 該組分比例調節(jié)的范圍是 1.5%，即 3.5%- 6.5%，則流動相系統(tǒng)比例的調節(jié)是 58.5： 35： 6.5至 61.5： 35： 3.5 結果判斷 測 2份供試品溶液， RDS2.0%，否 則應重新測定。根據(jù)測定結果的平 均值判斷是否符合規(guī)定，不符合應 復測。 附錄 IN 甲醇量測定法 （酒劑、口服酊劑） 藿香正氣水 檢查 其它 -應符合酊劑下有關的各項規(guī)定（附錄 IN ） 柱子同乙醇量測定法 毛細管柱用頂空進樣，外標法計算含量。 填充柱用手動進樣，內(nèi)標法計算含量，內(nèi)標物相應 位置出現(xiàn)雜質峰，改用外標法。 計算注意最后濃度的換算 供試品溶液的制備：取內(nèi)標 1mL置 10mL容量瓶中，加供試品溶液定容。 結果判斷：兩次測定結果 RSD10%,否則應重新測定。 根據(jù)測定結果的平均值判斷是否符合規(guī)定，除另有 規(guī)定外，甲醇量 0.05%。 附錄 IX H水分測定法 第四法氣相色譜法 以純化水為對照，無水乙醇為溶劑， 熱導 檢測器（ TCD）， 測定貴重藥材及其制劑 中的含水量。 色譜柱：高分子多孔小球填充柱。 （ 可改用毛細管柱，系統(tǒng)適應性實驗須滿足要求 ） 對照品溶液的制備 取純化水約 0.2g，置 25mL量瓶中加 無水乙醇 定容。 供試品溶液的制備 取 供試品適量 （含水量約 0.2g），置錐形瓶中加 無水乙醇 50mL，密塞 （防空氣中水分進入） ，超聲，傾取上清液。 測定 取無水乙醇、對照溶液和供試品溶液各 1-5微升 。 先計算 K值 外標法計算供試品水分，扣除無水乙醇的含水量。 高分子多孔微球（ GDX）屬于氣固色譜。 用于分離水及含羥基（醇）化合物和永久 性氣體如 H2、 O2、 N2等。 GDX由苯乙烯和二乙烯基苯共聚而成，屬 于非極性固定相，分析醇、醛、水和其它 短鏈極性化合物，可得到對稱的色譜峰。 它對含 OH化合物的親和力很弱，可使水在 有機化合物出峰之前出峰，而所得水峰對 稱，適合有機溶劑中痕量、微量水的測定。 永久性氣體在氣液色譜中不能分離，在固 定液中溶解度極小，分配系數(shù)幾乎相同而 固體吸附劑對永久性氣體有好的吸附能力。 附錄 IX Q 農(nóng)藥殘留量測定法（痕量） 用 GC法測定藥材（甘草、黃芪）、飲片、制劑 中有機氯、有機磷、擬除蟲菊酯類農(nóng)藥。 難點 痕量 分析，要求極高的檢測靈敏度。 中藥樣品種類各異， 基體成分復雜 高、中等含水量的樣品（提取加無水 NaSO4） 根和鱗莖類：甘草、貝母 葉綠素含量低：豆蔻、陳皮 葉綠素含量高：大青葉、薄荷 含糖量高的樣品：枸杞、麥冬（提取加水） 含脂肪高的樣品：酸棗仁 對試驗操作、儀器操作技術 要求高 硬件條件和檢測 成本較高 毒性強，檢測 風險大 農(nóng)藥的分類 按照用途： 殺蟲劑、殺螨劑、殺菌劑、除草劑、植物生長 調節(jié)劑等。 按照結構特點 礦物類農(nóng)藥 -無機化合物： 有機氯、有機磷 、氨基甲酸酯類 化學合成農(nóng)藥 -有機化合物： 擬除蟲菊酯類 生物類農(nóng)藥 -天然有機物（ 有機氮類 ）、抗生素（ 雜環(huán) 類 ）、生物類農(nóng)藥（ 有機金屬類 ） 世界上正使用的農(nóng)藥超過 750種，對人類健康造成巨大威脅 -農(nóng)殘分 析日益受到重視。 農(nóng)殘分析的一般程序 樣品收集：采樣具科學性、代表性 前處理： 預處理 （粉碎） -提取 （超聲提取，不單獨采用非極 性溶劑，常與極性溶劑合用或用極性溶劑如 70%丙酮、乙酸乙酯、石 油醚 -丙酮） -凈化 （磺化法、液液分配法、低溫冷凍法、柱層析法） -濃縮 （真空旋轉蒸發(fā)法、氮吹儀、自然揮發(fā)法） 儀器分析： GC-ECD、 NPD、 FPD(70%以上 ) GC/MS-EI、 CI HPLC-UV、 DAD、 FLD（氨基甲酸酯類） 一、有機磷農(nóng)藥殘留量測定法 六六六（ 4 種）、 DDT （ 4 種）、五氯硝基苯 有機氯農(nóng)藥是農(nóng)藥中使用量最大，使用歷史最長的一 類農(nóng)藥，性質穩(wěn)定，殘效期長（達 3050年），易在 脂肪組織中蓄積，造成慢性中毒。 2000版中國藥典 開始收載有機氯農(nóng)藥。 儀器： GC、手動進樣器、 ECD、載氣為高純氮（安脫 氧管）、旋轉蒸發(fā)儀（負壓液體沸點降低）、 柱子： SE-54（弱極性）、 DB-1701（中等極性）毛細 管柱，均為不分流進樣（ 0.75min）和程序升溫，二 者進樣口和柱溫不同。 試劑：農(nóng)殘級試劑或分析純重蒸餾。 注意：只有分流進樣靈敏度達不到要求才采用不分 流進樣。分流不分流采用的是同一個進樣口。 時間設置 90-120s，保證全部組分進入色譜柱，選 擇一個待測組分的峰面積為指標，該面積代表 100%進入了色譜柱。然后逐步縮短不分流時間如 70、 50、 30s分別進樣分析，計算與第一次的峰 面積比值只到小于 0.95.95%-99%為最佳吹掃時間。 對照品儲備液：分別制成 4-5ug/mL。 混合對照品儲備液：稀釋 20倍。 混合對照品溶液：石油醚 （ 60-90 ） 制成 0、 1、 5、 10、 50、 100、 250ug/L。 7個濃度均做，最后用與樣品面積最接近那個濃度 按外標法計算含量。 5 7 0 1 1 2 3 5 100% 2 . 1 1 0 0 0 X ml g 總 BHC 、總 DDT低于千 萬分之二， PCNB低于千 萬分之一 70%丙酮超聲提取，二氯甲烷、丙酮 /水液 液萃取，濃硫酸進行磺化處理，利用脂肪、 蠟質等雜質與濃硫酸磺化生成極性大的物 質與農(nóng)藥分離。對易分解或發(fā)生反應的有 機磷、氨基甲酸酯類農(nóng)藥不可使用。注意 加入硫酸后量取的上清液要用水洗，除盡 硫酸，減少對儀器和柱子的破壞。 加氯化鈉后應充分攪拌使其溶解，使二氯 甲烷、丙酮 /水溶液徹底分層，不加氯化鈉 三者不分層。 無水硫酸鈉目的是除去水分，不可以用太多， 一般為 5-6g，否則會影響回收率。 補足重量為部分取樣法，完全取樣法一般為 回收溶劑定容。 近干一般為剩下一滴，不要全干，避免農(nóng)藥 損失。氮吹儀濃縮農(nóng)藥損失率低，但溶劑處 理量小。 實驗用器皿應嚴格清洗，不能殘存鹵素離子。 操作應避光，光線使許多農(nóng)藥降解。 二、有機磷農(nóng)藥殘留量測定法 有機磷農(nóng)藥具有毒性，其殘留嚴重危及人體健康。 2010中國藥典一部收載 12種有機磷農(nóng)藥測定方法。 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 彈性石英毛細管柱 (30m 0.25mm 0.25m)DB-17MS(或 HP-5)， 氮磷檢測器 （ NPD）。進樣口溫度 230 ；檢測 器溫度 300 ， 不分流進樣 。 程序升溫 ：初始 120 ，每分鐘 10 升至 220 ，每分鐘 5 升至 240 ，保持 2分鐘，每分鐘 20 升至 270 ，保 持 0.5分鐘。理論板數(shù)按敵敵畏峰計算不低于 6000， 兩個相鄰色譜峰的分離度應大于 1.5。 對照品儲備液制備 稱取對硫磷、甲基對 硫磷、樂果、氧化樂果、甲胺磷、久效磷、 二嗪農(nóng)、乙硫磷、馬拉硫磷、殺撲磷、敵 敵畏、乙酰甲胺磷農(nóng)藥對照品適量，用乙 酸乙酯分別制成約 100ug/mL的溶液。 混合對照品儲備液的制備 量取上述各對照 品儲備液 1ml，置 20ml棕色 量瓶中 ,加乙酸 乙酯定容。 混合對照品溶液的制備 精密量取上述混合 對照品儲備液，用乙酸乙酯制成每 1mL含 0.1g、 0.5g、 1g、 2g、 5g的溶液， 即得。 供試品溶液制備 取供試品約 5g，加無水硫酸鈉 5g，加入 乙酸乙酯 50100ml， 冰浴超聲 處理 3分 鐘，放置，取上層液濾過。取濾液于 40 以下 減 壓濃縮至近干，用乙酸乙酯轉移至 5ml量瓶中，并 稀釋至刻度，精密量取 1ml，置 活性炭小柱 （乙酸 乙酯 5ml預洗），置真空樣品處理器上，用 正己烷 -乙酸乙酯 （ 1： 1）混合液 5ml洗脫，收集洗脫液， 置氮吹儀上濃縮至 近干 ，加入乙酸乙酯 1ml使溶解。 測定及結果計算 進 1uL對照品溶液和供試品溶液，分別進樣 3次， 取平均值，外標法計算 12種有機磷含量。 5.1 1000 51 11 x mL 100% 玻璃儀器不能用 含磷 洗滌劑洗滌，應用洗液 浸泡洗滌，使用前用丙酮蕩洗并揮干溶劑。 無水硫酸鈉脫水，劇烈振搖后如有固體硫酸 鈉存在，說明所加無水硫酸鈉已夠。 國際上多用乙腈作為有機磷農(nóng)藥的提取試劑 及分配凈化試劑，但其毒性較大，用乙酸乙 酯。一般提取 3次。 冷凍法使藥材中蠟質等沉淀析出，而農(nóng)藥留 在溶液中，超聲時候加冰塊，溫度高有機磷 損失。 活性炭對植物色素有很強的吸附作用。 擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留量測定 與 DDT同屬軸突毒劑，中毒癥狀相似。菊酯類毒 理作用迅速，危害人體健康。 10版收載三種。三 類農(nóng)藥都是神經(jīng)毒劑，阻斷神經(jīng)傳導，不直接殺 死神經(jīng)細胞。 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 彈性石英毛 細管柱（ 30m*0.32mm*0.25um)SE-54(或 DB-5）， 63Ni-ECD電子捕獲檢測器 。進樣 口溫度 270 ，檢測器溫度 330 。分流 比 20： 1； 5： 1（或根據(jù)儀器設置選擇最佳的 分流比）。程序升溫。 對照品貯備液的制備 稱取 氯氰菊酯、氰 戊菊酯及溴氰菊酯 農(nóng)藥對照品適量，用石 油醚（ 6090 ）分別制成約 2025ug/ml 的溶液。 混合對照品儲備液的制備 精密量取上述 各對照品儲備液 1ml，置 10ml量瓶中， 用 石油醚稀釋至刻度。 混合對照品溶液的制備 精密量取上述混 合對照品貯備液，用石油醚稀釋制成每 1L 分別含 0ug、 4ug、 8ug、 40ug、 200ug的 溶液，即得。 供試品溶液的制備 取供試品于 60 干燥 4小時， 粉碎成細粉，取約 12g，精密稱定，置 100ml具 塞錐形瓶中，加 石油醚（ 6090 ） -丙酮 （ 4： 1） 混合溶液 30ml， 超聲 處理 15分鐘，濾過，藥渣再 重復上述操作 2次后，合并濾液。濾液加入適量 無 水硫酸鈉 脫水后，于 4045 減壓濃縮至近干， 用少量石油醚反復操作至丙酮除凈，殘渣加適量 石油醚溶解，置 混合小柱 從下至上依次為無水 硫酸鈉 2g、弗羅里硅土 4g（ 祛除色素 ）、微晶纖 維素 1g、氧 化鋁 1g（ 除糖苷類 ）、無水硫酸鈉 2g 上，用石油醚 -乙醚（ 4： 1）混合溶液 90ml洗脫， 收集洗脫液，于 4045 減壓濃縮至近干，再用 石油醚 34ml重復 操作至乙醚除凈，用石油醚溶 解轉移至 5ml量瓶中，并定容。 1.8 1000 51x mL 100% 測定法 分別精密吸取供試品溶液和與之 相對應濃度的混合對照品溶液各 1ul，分別 連續(xù)進樣 3次，取 3次平均值，按外標法計 算供試品中 3種擬除蟲菊酯農(nóng)藥殘留量。 殘留溶劑測定法 藥典凡例第十條：對于生產(chǎn)過程中引入的 有機溶劑，應在后續(xù)的生產(chǎn)環(huán)節(jié)予以有效 去除。除正文已明確列有“殘留溶劑”檢 查的品種必須依法進行該項檢查外，其他 未在“殘留溶劑”項下明確列出的有機溶 劑與未在正文中列有此項檢查的各品種， 如生產(chǎn)過程中引入或產(chǎn)品中殘留有機溶劑， 均應按附錄“殘留溶劑測定法”檢查并應 符合相應溶劑的限度規(guī)定。 藥物中的殘留溶劑指在原料藥或輔料的生 產(chǎn)中，以及制劑制備過程中使用的，但在 工藝過程中未能完全去除的有機溶劑。 2010版中國藥典參考了國際協(xié)調大會（ ICH） 頒布的殘留溶劑研究指導原則，所監(jiān)測的 四類有機溶劑和限量值見限度標準一覽表。 中國藥典的限量要求與日本藥典、美國藥 典（ USP 467）歐洲藥典（ EP）中的規(guī)定 基本相同。 儀器： GC、頂空進樣裝置 供試品中殘留溶劑種類的確定 進甲烷氣體做為色譜的死時間 t0 稱取丁酮，溶劑稀釋作為內(nèi)標溶液。 稱取供試品，用內(nèi)標溶液稀釋成 0.1-0.5g/mL的供試 品溶液。 采用推薦的程序升溫法，在 SPB-1和 HP-INNOWAX 測定，時間窗為 5%。 10 0 R R ttRART tt 供試品溶液的制備 頂空進樣：供試品常以水為溶劑，對于非水性藥 物，用 N， N-二甲基甲酰胺、二甲基亞砜。 溶液直接進樣 對照品溶液的制備 制備同上，濃度應注意： 限度檢查 -根據(jù)殘留溶劑的限度確定對照品溶液濃度； 含量測定 -根據(jù)樣品中實際殘留量， A對照品 2倍供試 品 A色譜峰 測定法 消旋卡多曲原料藥有機殘留檢驗方法改進實驗方 案 公司現(xiàn)行方法：氯仿和二氯甲烷由于使用的檢測 器和色譜條件不同，分別檢測，對實際操作造成 麻煩。 氯仿 用 HP -5毛細管色譜柱， FID檢測器 ，進樣口溫度 200 ，檢測器溫度 300 ；程序升溫： 35 保持 8分鐘，以每分鐘 100 的升溫速度升溫至 230 ， 保持 8分鐘。 二氯甲烷 采用固定液為二甲基聚烷氧烷的石英毛細管柱， 電子捕獲檢測器 ，程序升溫，在 45 保持 5分鐘， 再以每分鐘 10 的速率升至 180 ，保持 3分鐘， 檢測器溫度 250 ，進樣口溫度 200 。 新方法的基本思路：由于 FID檢測器對鹵素 的靈敏度較差，對氯仿實際檢測過程中色 譜圖峰型較差，常常拖尾，且二氯甲烷檢 測需要換條件檢測，檢測過程較繁瑣。采 用 ECD檢測器，有較好的靈敏度，可以保 證很好的峰型，因此，基于上述缺點，本 方法改進的目的是配制氯仿和二氯甲烷混 合的對照品溶液和供試品溶液，放頂空瓶 進樣，以外標法計算。選擇合適的色譜條 件一次進樣將氯仿和二氯甲烷分開，分離 度大于 1.5，節(jié)約時間，節(jié)省溶劑。 方法學驗證檢驗項目（參考 2010版藥典附 錄 194藥品質量標準分析方法驗證指導原 則）：準確度、精密度、專屬性、檢測限、 定量限、線性、范圍、耐用性等雜質測定 項要求。 頂空進樣法 頂空進樣法為頂空裝置與氣相色譜儀聯(lián)用 的儀器。它利用被測樣品（氣 -液和氣 -固） 加熱平衡后，取其揮發(fā)氣體部分進入氣相 色譜儀。它專用于分析易揮發(fā)的微量成分， 如對甲醇、乙醇等易揮發(fā)的殘留溶劑類， 帶有易揮發(fā)成分的中草藥類等均可用它進 行定量分析。 頂空進樣分為溶液頂空和固體頂空。 靜態(tài)頂空、動態(tài)頂空。 頂空進樣過程示意圖 頂空注意事項 平行樣應該放兩個頂空瓶中，分別進樣。 一個頂空瓶只允許進樣一次。 用標準溶液加入法操作時候，對照品加入 到供試品前需要把供試品拿跟加入對照品 溶液體積相同的溶劑稀釋一下。否則會改 變相比。計算的時候注意稀釋倍數(shù)的轉換。 參數(shù)主要包括 GC參數(shù)和頂空參數(shù)（平衡溫 度、平衡時間、管線溫度）。管線溫度一 般稍高于平衡溫度，防止在管線中冷凝。