目錄中文摘要1Abstract2內(nèi)容提要4第1章 選題構思51.1 課題設計背景51.2 設計目標及可行性分析6第2章 實驗部分82.1 試劑與儀器82.2 順-1, 2-環(huán)己烷二甲酸官能化的聚酰胺-胺樹枝狀大分子（PAMAM-CCA）的合成82.2 PAMAM-CCA的酸敏感性測定92.3 PAMAM-CCA包載疏水抗腫瘤藥物阿霉素（DOX）92.4 透明質(zhì)酸復合納米凝膠（PAMAM-CCAHA-NGs）的制備102.5 復合納米凝膠的降解性能102.6 載DOX的復合納米凝膠的制備及其體外藥物釋放行為11第3章 結果與討論123.1 PAMAM-CCA的合成與表征123.2 PAMAM-CCA的理化性能143.3 PAMAM-CCA對DOX的包載173.4 PAMAM-CCAHA-NGs復合納米凝膠的制備173.5 復合納米凝膠的降解性能193.6復合納米凝膠對DOX的包載與釋放20第4章 總結與展望224.1 本文總結224.2 研究展望22參考文獻24致謝27附錄28中文摘要惡性腫瘤嚴重威脅人類健康，納米藥物遞送系統(tǒng)的出現(xiàn)給腫瘤的精準治療帶來了更多的可能性。聚酰胺-胺（PAMAM）樹枝狀高分子具有水溶性好、尺寸小（納米級）和單分散性等特點，常被用作納米藥物載體。透明質(zhì)酸是一種具有很好生物相容性、酶降解性、腫瘤靶向性的天然多糖，也常被用于腫瘤的靶向治療。本文構建了含有順-1, 2-環(huán)己烷二甲酸官能化的PAMAM（PAMAM-CCA）的智能型透明質(zhì)酸復合納米凝膠（PAMAM-CCAHA-NGs），用于憎水性抗腫瘤藥物阿霉素（DOX）的有效包載和快速釋放。動態(tài)光散射儀測試的PAMAM-CCA的Zeta電位變化曲線顯示，在pH 4.0的環(huán)境中分散的PAMAM-CCA的電位逐步升高，證實了PAMAM-CCA能在弱酸刺激下響應性脫除CCA，具有明顯酸敏感特性。PAMAM-CCAHA-NGs復合納米凝膠的粒徑在150 nm左右，略大于HA-NGs納米凝膠的粒徑（135 nm）。降解實驗表明，該復合納米凝膠能在3 U/mL的透明質(zhì)酸酶作用下快速降解，并釋放出PAMAM-CCA載藥系統(tǒng)，這表明該復合納米凝膠能在富含透明質(zhì)酸酶的腫瘤微環(huán)境中快速釋放小粒徑的PAMAM-CCA納米藥物，從而利于納米藥物穿透進入整個腫瘤。體外藥物釋放實驗結果表明該復合納米凝膠穩(wěn)定，在pH 7.4的條件下，12小時內(nèi)藥物釋放量不足30 %；而在pH 4.0的條件下，相同時間內(nèi)藥物釋放量接近100 %，這說明載藥的PAMAM-CCA一旦進入腫瘤細胞，能在內(nèi)涵體/溶酶體中類似的酸性環(huán)境作用下，快速釋放包載的抗腫瘤藥物DOX。因此，該智能型PAMAM-CCAHA-NGs復合納米藥物在腫瘤高效靶向治療中具有很好的臨床應用潛力。關鍵詞：聚酰胺-胺樹枝狀高分子；透明質(zhì)酸；復合納米凝膠；酸敏感；酶降解；腫瘤治療 AbstractMalignant tumors pose a serious threat to human health. The emergence of nanosystems have brought more possibilities for the precise treatment of tumors. Polyamide-amine dendrimers have the characteristics of good water solubility, small size (nano-scale) and monodispersity, and are often used as nanocarriers. Hyaluronic acid is a natural polysaccharide with good biocompatibility, enzymatice degradability and tumor targeting, and has been often used for targeted therapy of tumors. In this project, a hybrid nanogel system (PAMAM-CCAHA-NGs) consisting of cis-1, 2-cycloheanedicarboxylic acid (CCA) functionalized PAMAM (PAMAM-CCA) and hyaluronic acid nanogels (HA-NGs) was constructed for effective encapsulation and rapid release of hydrophobic anticancer drug doxorubicin (DOX). The results showed that the Zeta potential of PAMAM-CCA dispersion in acid environment (pH 4.0) gradually increased, indicating that the PAMAM-CCA is pH-sensitive. The particle size of the hybrid nanogels is about 150 nm, which is slightly larger than that of HA-NGs (135 nm). Degradation experiments show that the hybrid nanogels can be rapidly degraded in the condition of 3 U/mL hyaluronidase, and achieve the release of PAMAM-CCA drug delivery system. It indicates that the hybrid nanogels can rapidly release the small-sized PAMAM-CCA nanomedicines in the tumor microenvironment rich in hyaluronic acid enzymes, which facilitating the penetration of nanomedicines into the entire tumor. Drug release experiments in vitro showed that the hybrid nanogels were stable. Under the conditions of pH 7.4, the drug release was less than 30% within 12 hours; while at pH 4.0, the drug release was nearly 100% under otherwise the same conditions. This shows that the DOX-loaded PAMAM-CCA can rapidly release DOX under the acidic environment of endosomes/lysosomes after entering the tumor cells. Therefore, the intelligent PAMAM-CCAHA-NGs hybrid nanomedicine has a great clinical application potential for cancer targeted therapy.Key words: Polyamide-amine dendrimers; Hyaluronic acid; Hybrid nanogels; Acid-sensitive; Enzymatic degradability; Cancer therapy 內(nèi)容提要本論文中，我們設計制備了含PAMAM-CCA的智能型透明質(zhì)酸復合納米凝膠藥物遞送系統(tǒng)（PAMAM-CCAHA-NGs）用于憎水性抗腫瘤藥物阿霉素（DOX）的有效包載和快速釋放。該復合納米凝膠能夠經(jīng)透明質(zhì)酸酶作用快速降解，其中PAMAM-CCA能夠酸響應性脫除CCA。因此該載DOX的復合納米凝膠能在富含透明質(zhì)酸酶的腫瘤微環(huán)境中快速降解并釋放小粒徑的PAMAM-CCA納米藥物，從而利于納米藥物穿透進入整個腫瘤，經(jīng)腫瘤細胞內(nèi)吞后，響應內(nèi)涵體/溶酶體的弱酸性信號實現(xiàn)DOX的遞送。全文共分為四章，第一章介紹了本設計的背景資料、設計目標和可行性分析；第二章主要介紹了初級載體PAMAM-CCA的合成、透明質(zhì)酸復合納米凝膠的構建，以及藥物包載實驗。第三章根據(jù)實驗結果詳細討論了PAMAM-CCA和復合納米凝膠的各項性能，包括酸敏感性、酶降解性、熒光性和藥物包載與釋放行為。第四章對設計內(nèi)容進行總結，并對如何進一步改進與完善該復合納米凝膠藥物遞送系統(tǒng)作了展望。第1章 選題構思1.1 課題設計背景全球范圍內(nèi)，惡性腫瘤是導致人類死亡和殘疾的主要原因1。從2005年至2013年，中國的癌癥發(fā)病率和死亡率急劇增長，給社會帶來了沉重的經(jīng)濟負擔1。目前腫瘤治療的主要手段包括手術治療、化療和放療。化療方法見效快、效果好，是除手術外最重要的腫瘤治療手段。但是由于小分子化療藥物缺乏特異性，具有嚴重的毒副作用，接受治療的患者常會出現(xiàn)疲倦、脫發(fā)、惡心以及腸胃不適等病癥2。相較于小分子化療藥物，大分子蛋白質(zhì)藥物具有特異性高、毒副作用小、腫瘤治療效果較好等特點3。近年來，蛋白質(zhì)藥物已用于惡性腫瘤、心血管疾病、糖尿病等疾病的治療。但是，蛋白藥物自身存在的物理、化學不穩(wěn)定性、易被降解失活以及細胞滲透性差等缺陷極大阻礙了臨床轉化4。為了實現(xiàn)高效低毒的腫瘤治療，科研工作者開發(fā)了多種新型納米藥物遞送系統(tǒng)，諸如脂質(zhì)體、聚合物囊泡、聚合物膠束、聚合物納米凝膠、聚合物納米粒等用于抗癌藥物的包載與遞送5-6。腫瘤的靶向治療一般是通過兩種形式實現(xiàn)，一種是基于實體瘤的高通透性和滯留效應（EPR effect），另外一種是抗體或受體介導的特異性腫瘤配體定位7-9。但是由于腫瘤異質(zhì)性的存在10，這兩種靶向治療形式都受到了一定的限制，具有環(huán)境刺激響應的納米藥物載體是優(yōu)化腫瘤給藥系統(tǒng)的良好手段。一方面納米藥物載體可以提高藥物的體內(nèi)穩(wěn)定性，降低毒副作用，延長藥物體內(nèi)血液循環(huán)時間。另一方面納米藥物載體的環(huán)境刺激響應性可以促使藥物載體在特定刺激信號（溫度、光、磁場、pH、氧化還原反應等）作用下快速釋放藥物，實現(xiàn)腫瘤的靶向治療。pH敏感型納米藥物載體是環(huán)境響應性納米藥物載體中一種重要的藥物載體。研究表明，由于實體瘤內(nèi)部缺氧，腫瘤細胞會發(fā)生無氧糖酵解產(chǎn)生乳酸。并且由于腫瘤內(nèi)部血管系統(tǒng)缺乏，產(chǎn)生的乳酸不能充分排出，使得腫瘤內(nèi)呈弱酸性11。腫瘤細胞中早期內(nèi)涵體的pH值在6.0左右，部分甚至低于5.4，而晚期內(nèi)涵體的pH值一般在5.0左右12-14。而溶酶體內(nèi)的pH值則更低，一般為4.05.015。與腫瘤組織不同，正常組織部位的pH值一般為7.4。pH敏感型納米藥物載體能夠識別腫瘤組織和正常組織的pH值差異，在腫瘤部位響應性釋放藥物，而在正常組織部位藥物不會釋放或只有少量釋放，從而實現(xiàn)對腫瘤的高效低毒治療。透明質(zhì)酸（Hyaluronic acid, HA）是存在于脊椎動物組織和體液以及一些細菌中的一種多糖16。透明質(zhì)酸因其優(yōu)異的生物相容性、酶降解性、無免疫原性以及CD44靶向性等特點，被廣泛用于組織修復、藥物輸送等生物醫(yī)學領域的應用與研究17-20。其中，基于HA設計的納米藥物載體可高效包載藥物，并能將藥物靶向遞送到CD44過表達的腫瘤細胞，顯著抑制腫瘤生長21-23。樹枝狀大分子是一種具有單分散性的高度支化球形大分子24。聚酰胺-胺（Polyamidoamine, PAMAM）就是一種典型的樹枝狀大分子，它具有內(nèi)腔疏水、外層親水的結構，而且具有納米級尺寸，這些使得PAMAM可以被設計為藥物輸送系統(tǒng)25-29。PAMAM對藥物的包載方式一般分為兩種，一是利用PAMAM表面豐富的官能團實現(xiàn)與藥物分子的共價偶聯(lián)，二是利用“主/客體”作用對藥物進行物理包載。例如Marcinkowska等30利用酰胺化反應經(jīng)烏頭酸酐過渡在PAMAM表面修飾上藥物阿霉素，設計了具有酸敏感特性的藥物載體。Fu等31在PAMAM表面修飾上聚乙烯醇-乳糖酸聚合物鏈構建了靶向藥物遞送系統(tǒng)，實現(xiàn)了基于親疏水作用的藥物包載。1.2 設計目標及可行性分析在本論文中，我們將構建含順-1, 2-環(huán)己烷二甲酸官能化的PAMAM（PAMAM-CCA）的智能型透明質(zhì)酸復合納米凝膠（PAMAM-CCAHA-NGs）用于憎水性抗腫瘤藥物阿霉素（DOX）的有效包載和快速釋放（圖1.1）。PAMAM-CCA是經(jīng)PAMAM表面氨基胺解1, 2-環(huán)己二甲酸酐（CCA）制得的高分子載體。納米凝膠（HA-NGs）是通過透明質(zhì)酸-甲基丙烯酸-2-氨基乙酯衍生物（HA-AMA）和透明質(zhì)酸-賴氨酸-二甲氨基四唑衍生物（HA-Lys-MTet）經(jīng)反向納米沉淀法和“四唑-烯”光點擊化學法聯(lián)用制得，將PAMAM-CCA與上述透明質(zhì)酸的衍生物共混依照相同的方法即可制得PAMAM-CCAHA-NGs。該設計的可行性基于以下幾點分析：1. PAMAM-CCA的合成步驟簡單，產(chǎn)率高。2. PAMAM-CCA可利用親疏水作用包載疏水性小分子藥物DOX，同時經(jīng)CCA修飾PAMAM表面帶上羧基，能夠降低其細胞毒性。3. 載DOX的PAMAM-CCA在弱酸性條件下可脫除CCA，PAMAM和DOX的氨基被質(zhì)子化后因靜電排斥作用可將DOX“擠”出載體，實現(xiàn)藥物釋放。4. 透明質(zhì)酸納米凝膠的空間網(wǎng)絡結構可形成豐富的空隙，能對載藥PAMAM-CCA高效包載，同時該載藥系統(tǒng)具有很好的尺寸穩(wěn)定性。5. 透明質(zhì)酸能在透明質(zhì)酸酶(HAase)的作用下發(fā)生降解，從而釋放初級載藥體系。6. 腫瘤微環(huán)境中HAase豐富，PAMAM-CCAHA-NGs的HA骨架被降解后，小粒徑的PAMAM-CCA能夠穿透整個腫瘤，進入腫瘤細胞后，在內(nèi)涵體/溶酶體內(nèi)的弱酸條件刺激下即可快速釋放藥物。7. 該納米凝膠具有熒光特性，可實現(xiàn)熒光標記追蹤?；谏鲜龇治觯覀冊O計的智能型透明質(zhì)酸復合納米凝膠可實現(xiàn)藥物的有效包載和快速釋放，且有望實現(xiàn)臨床應用。圖1.1 DOX-loaded PAMAM-CCAHA-NGs制備示意圖。第2章 實驗部分2.1 試劑與儀器4代聚酰胺-胺（G4-PAMAM，分子量：14214.17 g/mol，10 wt% in methanol，ALDRICH ）、1, 2-環(huán)己二甲酸酐（CCA，cis+trans 97%，Alfa Aesar）、2, 4, 6-三硝基苯磺酸（TNBSA，5 % w/v in metanol，Thermo Scientific）三乙胺（TEA，99.5%，阿拉?。?、阿霉素鹽酸鹽（DOXHCl，北京中碩醫(yī)藥科技開發(fā)有限公司）、透明質(zhì)酸酶（HAase，300 IU/mg，生工生物工程（上海）股份有限公司）。無水甲醇、丙酮、乙二胺都是分析純，買來后直接使用。透明質(zhì)酸-賴氨酸-二甲氨基四唑衍生物（HA-Lys-MTet）和透明質(zhì)酸-甲基丙烯酸-2-氨基乙酯衍生物（HA-AMA）均是根據(jù)文獻報道32合成得到。核磁共振氫譜（1H NMR）用Unity Inova 400型（400 MHz）共振波譜儀進行測定，使用氘帶水（D2O）作為溶劑，以殘留溶劑峰的化學位移作為標準進行譜圖分析。納米粒的尺寸使用Malvern公司生產(chǎn)的Zeta sizer Nano-ZS動態(tài)光散射粒度儀（DLS），溫度固定為25 ,光源是波長633 nm的He/Ne激光。Zeta電位是使用Zeta sizer Nano-ZS在標準毛細管電泳樣品池中進行測定。紫外光譜采用HITACHI UH5300的雙光束紫外-可見分光光度計。熒光光譜使用Agilent Cary Eclipse熒光分光光度計。2.2 順-1, 2-環(huán)己烷二甲酸官能化的聚酰胺-胺樹枝狀大分子（PAMAM-CCA）的合成PAMAM-CCA是用G4-PAMAM和1, 2-環(huán)己二甲酸酐（CCA）經(jīng)胺解反應制備得到（圖2.1）。按照理論取代度100%進行投料，在25 mL的單頸瓶中，氮氣保護下加入1.23 mL G4-PAMAM的甲醇溶液（100 mg，7.04 mol），補加無水甲醇至10 mL。再將1, 2-環(huán)己二甲酸酐（69.33 mg，450.19 mol）一并加入反應瓶中，開動攪拌，此時溶液呈白色。迅速滴入75 L三乙胺（過量20%）后，溶液變得澄清透明。密封，油浴30 ，持續(xù)反應24小時。反應結束后，先后在0.2 M NaCl溶液和純水中分別透析（Spectra/Pore，MWCO of 3500）12小時，每三小時更換一次透析介質(zhì)。透析結束后，經(jīng)冷凍干燥得到129.6 mg產(chǎn)物，產(chǎn)率83.3 %。按照此法，分別合成理論取代度（Degree of Subsitution, DS）為100 %、80 %和60 %的PAMAM-CCA（分別記為PAMAM-CCA64th、PAMAM-CCA51th、PAMAM-CCA38th）。利用核磁共振氫譜與TNBSA法表征CCA在PAMAM表面的取代度。圖2.1 PAMAM-CCA的合成路線圖。2.2 PAMAM-CCA的酸敏感性測定配制PAMAM的磷酸鹽緩沖溶液（10 mM，pH 7.4）、PAMAM-CCA64th磷酸鹽緩沖溶液（10 mM，pH 7.4）和PAMAM-CCA64th的乙酸/乙酸鈉緩沖溶液（10 mM，pH 4.0），濃度均為0.025 mg/mL，每個條件的溶液均分成三等份。將上述9個試樣置于37 ，轉速200 rpm的搖床中，模擬人體環(huán)境。在第0、2、4、6、8、12小時，每個試樣各取10 L用pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液稀釋到2 mL，利用DLS測定樣品的Zeta電位。根據(jù)樣品Zeta電位的變化，表征其酸敏感性。2.3 PAMAM-CCA包載疏水抗腫瘤藥物阿霉素（DOX）取4 mg阿霉素鹽酸鹽（DOXHCl）溶于300 L甲醇中，溶液呈渾濁狀，補加6倍摩爾量的三乙胺，即得紅色澄清透明溶液。攪拌12小時，取上層清液。將10 mg PAMAM-CCA溶于1.5 mL磷酸鹽緩沖溶液（10 mM，pH 7.4），加入處理好的DOX甲醇溶液，劇烈攪拌24小時，充分揮發(fā)除去甲醇和三乙胺。反應結束后，離心（2000 rpm）除去自由的疏水藥物阿霉素。經(jīng)冷凍干燥后，即得載藥PAMAM-CCA。按照上述方案比較PAMAM-CCA64th、PAMAM-CCA51th、PAMAM-CCA38th以及純PAMAM的載藥效果。DOX的濃度利用紫外光譜（吸收波長480 nm）測定，以不同濃度的DOXHCl水溶液作標準曲線，載藥PAMAM-CCA配制成水溶液進行定量測定。藥物包載量（DLC）和藥物包載效率（DLE）根據(jù)下面的等式計算：DLC (wt%) = （藥物包載量/聚合物和投入藥物的總量）× 100DLE (wt%) = （藥物包載量/藥物投入量）× 1002.4 透明質(zhì)酸復合納米凝膠（PAMAM-CCAHA-NGs）的制備透明質(zhì)酸納米凝膠（HA-NGs）的制備（圖1.1）是聯(lián)用反相納米沉淀法和“四唑-烯”光控點擊化學反應制備得到的22。首先將等當量（四唑與甲基丙烯酸-2-氨基乙酯摩爾比1:1）的透明質(zhì)酸-賴氨酸-二甲氨基四唑衍生物（HA-Lys-MTet）和透明質(zhì)酸-甲基丙烯酸-2-氨基乙酯衍生物（HA-AMA）共混配成聚合物濃度為1.25 mg/mL的水溶液。用注射器吸取1 mL聚合物溶液，針頭沒過液面，攪拌下緩慢將透明質(zhì)酸衍生物溶液注入到100 mL丙酮中。將混合溶液轉入培養(yǎng)皿（直徑15 cm, 高度3 cm）中，再在紫外固化箱（光源波長：320-390 nm，50 mW/cm2）中光照6分鐘。光照交聯(lián)后，旋蒸除去丙酮，再將水相在純水中透析（Spectra/Pore，MWCO of 3500）4小時，經(jīng)冷凍干燥即可得到HA-NGs的粉末。透明質(zhì)酸復合納米凝膠（PAMAM-CCAHA-NGs）的制備方法和HA-NGs的制備方法一致。只需將PAMAM-CCA與透明質(zhì)酸衍生物一起溶解配成溶液，其中透明質(zhì)酸衍生物濃度仍為1.25 mg/mL。2.5 復合納米凝膠的降解性能將新制得PAMAM-CCAHA-NGs溶液等體積分成兩組，比較兩種條件下的納米凝膠尺寸的變化來研究它的降解性能：（1）透明質(zhì)酸酶濃度3 U/mL和（2）無透明質(zhì)酸酶。將兩組樣品置于轉速200 rpm的37 搖床中，模擬人體環(huán)境。在預設的時間點，利用DLS測定納米凝膠粒徑的大小從而反映降解情況。2.6 載DOX的復合納米凝膠的制備及其體外藥物釋放行為載DOX的復合納米凝膠的制備方法也和HA-NGs的制備方法一致，只需將載DOX的PAMAM-CCA與透明質(zhì)酸衍生物一起溶解配成溶液，通過聯(lián)用反相納米沉淀法和“四唑-烯”光控點擊化學反應即可制得。模擬人體環(huán)境，考察兩種條件下載DOX的復合納米凝膠的藥物釋放行為：（1）含0.2 %吐溫80的磷酸鹽緩沖溶液（10 mM，pH 7.4）和（2）含0.2 %吐溫80的乙酸/乙酸鈉緩沖溶液（10 mM，pH 4.0）。將新制載藥復合納米凝膠的溶液在pH 7.4的磷酸鹽的緩沖溶液中透析（Spectra/Pore，MWCO of 3500）4小時，透析好的納米凝膠溶液分取六份裝入截留分子量14 kDa的釋放袋中，每份0.5 mL。釋放袋用釋放夾封好后裝入25 mL釋放介質(zhì)，置于搖床（37 ，轉速200 rpm）中震蕩模擬體內(nèi)釋放。在第1、2、4、6、8、12小時，取出5 mL釋放介質(zhì)，再補加5 mL對應釋放介質(zhì)。以不同濃度的DOX HCl水溶液作標準曲線，將各時刻取得的釋放介質(zhì)用熒光光譜（激發(fā)波長480 nm，發(fā)射波長550 nm）標定DOX的濃度。累加各時間段的藥物釋放量，繪制藥物釋放曲線，比較不同條件下的藥物釋放速率，同時測定復合納米凝膠的總藥物包載量和藥物包載效率。第3章 結果與討論3.1 PAMAM-CCA的合成與表征樹枝狀大分子G4-PAMAM末端帶有64個氨基，易與CCA發(fā)生胺解反應生成末端帶有大量羧基的樹枝狀大分子PAMAM-CCA（圖2.1）。三乙胺在反應中用作質(zhì)子捕捉劑，防止反應生成的羧基電離出質(zhì)子封閉氨基阻礙進一步的胺解反應。反應結束后經(jīng)透析除去小分子，即得PAMAM-CCA。比對PAMAM和PAMAM-CCA的1H NMR圖譜（圖3.1），發(fā)現(xiàn)在1.2-2.1 ppm出現(xiàn)新的峰群（i，j，k，l），此即CCA的六元環(huán)上3、4、5、6號位H的化學位移，可知CCA成功修飾到PAMAM上。PAMAM的末端-NH2被修飾成酰胺鍵后，原來PAMAM上-CONHCH2CH2NH2的部分g氫和全部f氫與-CONHCH2CH2N-的d氫合并成新的d，f峰，積分也隨之增加。PAMAM-CCA上剩余的g氫與a/e氫合并成新的a，e，g峰，積分隨之增加。修飾前后b氫（2.8 ppm）和c氫(2.4 ppm)的化學位移與積分基本不變，因此選用c氫的積分值作為標準來定量計算CCA的取代度。根據(jù)i，j，k，l峰群的積分值與c氫積分值的比即可算出CCA的取代度。同時利用TNBSA法也對PAMAM末端CCA的修飾情況進行了表征。標樣與樣品均是溶解在3 mL硼砂緩沖溶液（pH 9.3）中，補加20 L TNBSA甲醇溶液，并在37 搖床中震搖2小時后用紫外光譜（420 nm）測定吸光度。以不同濃度的乙二胺作標準曲線，測定PAMAM-CCA上殘留氨基濃度，從而得到PAMAM表面的被修飾情況。不同理論取代度的PAMAM-CCA合成結果匯總在表3.1，依據(jù)實際取代度分別記為PAMAM-CCA37、PAMAM-CCA47、PAMAM-CCA57。圖3.1 核磁共振氫譜（400 MHz，D2O）。A為PAMAM的1H NMR，B為PAMAM-CCA64th的1H NMR。紅色標記的N原子為該樹枝狀高分子的分支處，未繪出。表3.1 PAMAM的CCA取代度EntryTheoreticalDeterminedaDeterminedbNumberPercentageNumberPercentageNumberPercentage13860 %3758 %4265 %25180 %4773 %4875 %364100 %5789 %6094 %a由核磁共振氫譜（400 MHz，D2O）表征得到。b由TNBSA法（紫外吸收波長為420 nm）表征得到。由表3.1可知，兩種表征方法得到的取代度結果較為一致。核磁共振氫譜表征結果顯示，隨著理論取代度的提高，實際取代度越偏離理論取代度。這主要是由于反應中隨著取代度的提高，PAMAM表面氨基數(shù)目減少，體系中氨基濃度降低，反應基團碰撞概率降低，使得高取代度的PAMAM-CCA難以繼續(xù)胺解更多的CCA。3.2 PAMAM-CCA的理化性能G4-PAMAM作為樹枝狀大分子，本身具有很好的單分散特性，同時末端布滿氨基又使得PAMAM在生理條件（pH 7.4）下易被質(zhì)子化而帶正電，具有良好的水溶性。PAMAM及其衍生物的粒徑、Zeta電位均是溶解在pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液中由Zeta sizer Nano-ZS (Malvern Instruments)在25下測定，結果表明PAMAM經(jīng)CCA修飾后，粒徑和Zeta電位均發(fā)生了變化（表3.2，圖3.2），PAMAM的水溶性也發(fā)生了改變。純PAMAM的Zeta電位約為7.54 mV，PAMAM-CCA37、PAMAM-CCA47、PAMAM-CCA57的電位依次為-4.15 mV、-18.47 mV、-28.63 mV。Zeta電位由正到負的變化，反映了PAMAM被修飾后表面離子化程度的變化。PAMAM-CCA37的Zeta電位為-4.15 mV，最為趨向電中性，離子化程度低，在水溶液中呈渾濁狀。這在粒徑上也有著明顯的反映，相比于PAMAM，PAMAM-CCA37具有619.10 nm的超大粒徑，可見團聚嚴重，不宜用來包載藥物。PAMAM-CCA47的Zeta電位為-18.47 mV，離子化程度高，但是由于PAMAM-CCA47表面仍有較多氨基，因正負電荷的相互吸引作用，結構變得緊湊，粒徑相比于PAMAM有一定程度減小。PAMAM-CCA47外層結構緊湊，也不利于藥物的物理包載。PAMAM-CCA57的Zeta電位達到-28.63 mV，分子外層離子化程度很高，末端分子鏈舒張，粒徑和PAMAM相近，具有很好的水溶性，基于親疏水作用的藥物包載行為容易實現(xiàn)。雖然PAMAM本身也具有較好的水溶性，但是要包載同樣帶有氨基的疏水藥物時，會因同種電荷排斥作用使得載藥體系不穩(wěn)定。表3.2 PAMAM-CCA的粒徑與電位SampleSizea (nm)Zeta Potentialb (mV)PAMAM3.047.54PAMAM-CCA37619.10-4.15PAMAM-CCA472.52-18.47PAMAM-CCA573.19-28.63a由Zeta sizer Nano-ZS (Malvern Instruments)在pH 7.4，25條件下測定。其中粒徑值取Number結果，詳見圖3.2。b用Zeta sizer Nano-ZS在標準的毛細管電泳樣品池中測定。圖3.2 PAMAM-CCA的粒徑分布圖。由Zeta sizer Nano-ZS (Malvern Instruments)在pH 7.4, 25條件下測定,帶Number結果。PAMAM胺解CCA后形成的酰胺鍵具有酸敏感性，在弱酸刺激下可以發(fā)生斷裂33，如圖3.3所示。我們選用PAMAM-CCA57研究該載體的酸敏感特性，利用Zeta sizer Nano-ZS (Malvern Instruments)測定PAMAM-CCA的電位值隨時間的變化來表征CCA的pH響應性脫除。結果顯示（圖3.4）PAMAM-CCA57在pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液中的Zeta電位值穩(wěn)定在-27 mV左右，然而分散在pH 4.0的乙酸/乙酸鈉緩沖溶液中的PAMAM-CCA57電位值不斷升高，逐漸趨向于純PAMAM的電位值（約7 mV），在第12小時，電位值升高到4.81 mV。顯然，在pH 4.0的弱酸作用下，PAMAM與CCA間的酰胺鍵可以響應性斷裂。圖3.3 PAMAM-CCA的pH響應性斷鍵示意圖。圖3.4 PAMAM-CCA的酸響應性電位變化曲線。PAMAM、PAMAM-CCA57在對應的pH 7.4或pH 4.0的緩沖溶液中分散，樣品的Zeta電位均是裝在標準毛細管電泳樣品池中由Zeta sizer Nano-ZS (Malvern Instruments)在pH 7.4，25條件下測定。3.3 PAMAM-CCA對DOX的包載PAMAM-CCA具有樹枝狀球形結構，以及內(nèi)腔疏水、外層親水的特性?；谟H疏水性差異，PAMAM-CCA可以對疏水性小分子藥物實現(xiàn)包載。將疏水性抗腫瘤藥物阿霉素的甲醇溶液加入到PAMAM-CCA或PAMAM水溶液中，劇烈攪拌下?lián)]發(fā)盡甲醇。通過離心除去疏水的自由藥，上清液經(jīng)冷凍干燥即得載DOX的PAMAM或PAMAM-CCA。PAMAM與不同取代度的PAMAM-CCA的載藥效果對比如表3.3所示，結果與Zeta電位測試結果的分析一致。PAMAM表面與DOX都帶有氨基，被質(zhì)子化后，包載的藥物不能穩(wěn)定的存在疏水內(nèi)腔中，載藥體系不穩(wěn)定，載藥效率低。從產(chǎn)率上看，載DOX的PAMAM的產(chǎn)率最低，僅有10.2%?？梢娊?jīng)過離心后，絕大部分載DOX的PAMAM都沉淀析出了?？赡艿脑蚴牵琍AMAM本身水溶性不夠好，載藥后體系更加不穩(wěn)定，從而導致析出。在不同取代度的PAMAM-CCA中，PAMAM-CCA57載藥效率和產(chǎn)率都是最高的，是這組對比樣品中最理想的疏水小分子藥物載體。這主要是由于PAMAM-CCA57具有最好的水溶性，樹枝狀結構舒展，因此利用疏水內(nèi)腔包載疏水藥物的最為穩(wěn)定。表3.3 PAMAM/PAMAM-CCA載藥效果對比SampleDLC (wt.%)DLE (wt.%)Yield (%)TheoreticalDeterminedaPAMAM275.118.910.2PAMAM-CCA37270.62.261.1PAMAM-CCA47274.617.068.4PAMAM-CCA572715.055.672.0a由紫外光譜（吸收波長480 nm）以不同濃度的DOXHCl水溶液作標準曲線測定載體PAMAM-CCA中的DOX含量。3.4 PAMAM-CCAHA-NGs復合納米凝膠的制備HA-NGs的制備是將等當量的（四唑和雙鍵摩爾量相同）HA-Lys-MTet和HA-AMA混合，配制成聚合物總濃度為1.25 mg/mL的水溶液，用注射器注入丙酮中，經(jīng)紫外光照射后，四唑和雙鍵發(fā)生點擊化學反應形成納米凝膠。復合納米凝膠的制備選用載藥效果最好的PAMAM-CCA57，制備方法與HA-NGs的制備方法一致，只需一起共混在水溶液中即可。載DOX的PAMAM-CCA57和HA衍生物分別以質(zhì)量比0.6:1、0.8:1、1:1共混來制備納米凝膠。結果顯示（表3.4），以質(zhì)量比0.6:1的條件制得的納米凝膠粒徑最小，僅有149 nm，PDI為0.043，同時該復合納米凝膠粒徑只是略大于空納米凝膠的粒徑（Size=135 nm，PDI=0.055）（圖3.5），說明該透明質(zhì)酸納米凝膠對載DOX的PAMAM-CCA57有著很好的包載能力。此外點擊化學反應具有特異性的優(yōu)點，能夠避免在形成交聯(lián)網(wǎng)絡的過程中與被包載物質(zhì)發(fā)生化學反應。表3.4 載DOX的PAMAM-CCAHA-NGs的粒徑EntryWeight RatioaSizeb (nm)PDIb10.6:11490.04320.8:11940.14131:12290.109a載DOX的PAMAM-CCA57與HA的衍生物的質(zhì)量比。b由Zeta sizer Nano-ZS (Malvern Instruments)在25下測定。圖3.5 納米凝膠的尺寸分布。由Zeta sizer Nano-ZS (Malvern Instruments)在25下測定。如文獻中所述，該納米凝膠能夠自發(fā)熒光。我們利用Agilent Cary Eclipse熒光分光光度計對納米凝膠的熒光性進行了表征，激發(fā)波長設為365 nm，HA-NGs會在450 nm左右發(fā)射強熒光，但是未經(jīng)光照交聯(lián)的HA衍生物不具有熒光（圖3.6），這與文獻中報道的情況類似32。將HA-NGs的水溶液和HA衍生物水溶液用紫外燈照射，拍取照片。照片中HA-NGs具有明顯的綠色熒光，但是未發(fā)生交聯(lián)的HA衍生物不能觀察到任何熒光。利用HA-NGs的自發(fā)熒光，可以實現(xiàn)對NGs的追蹤。圖3.6 HA衍生物交聯(lián)前后的熒光光譜。由Agilent Cary Eclipse熒光分光光度計測定，激發(fā)波長為365 nm。3.5 復合納米凝膠的降解性能透明質(zhì)酸作為一種廣泛存在于人和動物體內(nèi)結締組織的粘多糖，是具有優(yōu)異生物相容性的天然材料。在人體內(nèi)HA可經(jīng)透明質(zhì)酸酶作用發(fā)生降解，我們希望設計的復合納米凝膠載藥體系能在腫瘤組織部位高濃度透明質(zhì)酸酶的作用下發(fā)生降解，從而釋放出的PAMAM-CCA載藥體系經(jīng)腫瘤細胞內(nèi)吞實現(xiàn)藥物輸送。實驗結果表明（圖3.7），PAMAM-CCAHA-NGs具有良好的降解性能。經(jīng)3 U/mL的透明質(zhì)酸酶作用4小時后，復合納米凝膠的透明質(zhì)酸骨架被部分降解，納米凝膠粒徑脹大到800 nm。繼續(xù)降解后納米凝膠結構更加松散，并且出現(xiàn)大量團聚。一直到第12小時，粒徑分布圖中出現(xiàn)10 nm左右的峰，占比26.7 %，可見包載的PAMAM-CCA能夠有效釋放。在沒有透明質(zhì)酸酶的環(huán)境中，經(jīng)過12小時搖床震搖后，PAMAM-CCAHA-NGs的粒徑基本不變，可見該復合納米凝膠具有很好的穩(wěn)定性。圖3.7 PAMAM-CCAHA-NGs的降解性能。通過Zeta sizer Nano-ZS (Malvern Instruments)在25下測定復合納米凝膠的粒徑來表征降解情況。3.6復合納米凝膠對DOX的包載與釋放透明質(zhì)酸納米凝膠的空間網(wǎng)絡結構具有豐富的納米級孔隙，對納米級尺寸的物質(zhì)具有很好的包載能力，為實現(xiàn)對疏水小分子藥物的包載，我們設計了含PAMAM-CCA的透明質(zhì)酸復合納米凝膠。因為PAMAM-CCA57載藥效果最好，我們選用載DOX的PAMAM-CCA57來制備復合納米凝膠的載藥體系。載DOX的PAMAM-CCA57與HA衍生物以質(zhì)量比0.6:1共混配制成HA衍生物濃度為1.25 mg/mL的水溶液，聯(lián)用反向納米沉淀法和光控點擊化學法制備成納米凝膠，透析除去自由藥即可實現(xiàn)載DOX的PAMAM-CCA57HA-NGs的制備。PAMAM-CCA57HA-NGs的理論載藥量為5.6 %，包封率為89.3 %，可見HA-NGs能對載藥PAMAM-CCA57實現(xiàn)高效包載。在搖床（37，200 rpm）中模擬人體環(huán)境進行藥物釋放實驗，結果表明（圖3.8），在pH 7.4的環(huán)境中，阿霉素僅依靠擴散作用有少量釋放，12小時后釋放量仍不足30 %。但是處于pH 4.0的弱酸性環(huán)境中，阿霉素釋放迅速，并且隨著CCA的脫除，釋放速率不斷加快。到第4小時藥物釋放量約有75 %，此后釋放速率減緩，12小時后藥物幾乎完全釋放。說明載DOX的PAMAM-CCA57HA-NGs可以在弱酸性條件刺激下快速釋放藥物。圖3.8 載DOX的PAMAM-CCA57HA-NGs分別在pH 7.4和pH 4.0緩沖溶液中的體外釋放實驗（n=3）。第4章 總結與展望4.1 本文總結本文中我們設計了含PAMAM-CCA的智能型透明質(zhì)酸復合納米凝膠，用于憎水性抗腫瘤藥物阿霉素（DOX）的有效包載和快速釋放。實驗表明，我們設計的PAMAM-CCAHA-NGs納米藥物遞送系統(tǒng)綜合性能優(yōu)異，具體分析如下：1. 酶降解特性。透明質(zhì)酸酶可以使得PAMAM-CCAHA-NGs的透明質(zhì)酸骨架斷裂，在HAase濃度3 U/mL的環(huán)境中12小時，PAMAM-CCA載藥系統(tǒng)可以從復合納米凝膠中釋放出來。在人體腫瘤微環(huán)境中透明質(zhì)酸酶濃度高，PAMAM-CCAHA-NGs能腫瘤組織中快速釋放出PAMAM-CCA，從而穿透整個腫瘤組織，并被腫瘤細胞內(nèi)吞。2. 酸敏感性。從PAMAM-CCA的電位變化曲線和PAMAM-CCAHA-NGs的藥物釋放曲線上可以看出：生理環(huán)境中（pH 7.4），PAMAM-CCA能夠穩(wěn)定存在，有效抑制了藥物的泄漏。在pH 4.0的條件下，CCA可以快速脫除，從而利用靜電排斥作用促使藥物快速釋放。腫瘤細胞內(nèi)涵體/溶酶體中pH值一般在4.06.0范圍內(nèi)，PAMAM-CCA載藥系統(tǒng)被內(nèi)吞到腫瘤細胞后即可快速釋放藥物。綜上所述，該智能型PAMAM-CCAHA-NGs納米藥物遞送系統(tǒng)具有巨大的臨床應用潛力。4.2 研究展望本文構建的智能型透明質(zhì)酸復合納米凝膠納米藥物遞送系統(tǒng)能夠實現(xiàn)小分子抗腫瘤藥物的有效包載和快速釋放，并在腫瘤臨床治療中存在巨大的應用潛力。但由于時間有限，本文構建的體系仍需進一步完善：1. 納米藥物遞送系統(tǒng)的載藥量影響著治療效果。4代的聚酰胺-胺樹枝狀高分子本身分子鏈短，尺寸僅有幾納米。我們可以在PAMAM表面修飾上具有合適鏈長的親水性分子鏈，提高親水段比例，同時增大分子尺寸，從而提高PAMAM對疏水小分子藥物的包載量與包載效率。2. 化藥與蛋白藥物聯(lián)用的治療方法已廣泛用于腫瘤臨床治療。我們可以將蛋白質(zhì)藥物一起引入到透明質(zhì)酸復合納米凝膠中，從而實現(xiàn)化藥與蛋白藥物的聯(lián)合治療。3. 透明質(zhì)酸本身具有腫瘤靶向性。接下來我們可以進一步研究驗證透明質(zhì)酸復合納米凝膠對CD44過表達的腫瘤細胞的靶向性，并研究動物體內(nèi)的治療效果。參考文獻1 Xu T, Wu J. 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