氧化亞鐵硫桿菌的分離及生物學(xué)特性研究摘要氧化亞鐵硫桿菌(Thiobacillus ferrooxidans,簡(jiǎn)稱(chēng)T. f)屬革蘭氏陰性無(wú)機(jī)化能自養(yǎng)菌、嗜酸、專(zhuān)性好氧,靠氧化基質(zhì)中的Fe2 +為Fe3+和低價(jià)態(tài)硫?yàn)榱蛩岣@取能量。它廣泛存在于土壤海水、淡水、垃圾、硫磺泉和沉積硫內(nèi),尤以金屬硫化礦和煤礦等酸性礦坑水中最為常見(jiàn)。因此，本論文從T.f菌的分離純化出發(fā)，進(jìn)行了T. f菌的生理生化及其生物活性的研究。本文從浸礦溶液中分離得到的氧化亞鐵硫桿菌進(jìn)行研究，結(jié)果表明硫酸亞鐵相對(duì)于硫來(lái)說(shuō)是一種速效能源，單質(zhì)硫是長(zhǎng)效能源，并且能提供比亞鐵更高的能量。關(guān)鍵詞：氧化亞鐵硫桿菌，微生物冶金，生物浸礦，分離純化Isolation of Thiobacillus and biological characteristics AbstractFerrooxidans (Thiobacillus ferrooxidans, called T. f) ,an inorganic chemoautotroph Gram negative bacteria, acidophilus, specific aerobic, relying on substrate oxidation in Fe3+ and Fe2+ for the low state of sulfur to sulfuric acid roots and obtain energy，which is widely found in soil water, fresh water, waste, and deposition of sulfur in sulfur springs, especially in sulfide minerals such as acid mine water and coal the most common . Therefore, this paper from the T.f purification and identification of bacteria in conducting the physiological strain Af its biological activity. This separation from the leaching solution obtained ferrooxidans study results show that compared with ferrous sulfate sulfur is a kind of quick energy, sulfur is a long-lasting energy, and can provide more energy than the ferrous .Key words: Thiobacillus ferrooxidans , microbioleaehin ,Biological leaching ,isolation目 錄摘要IAbstractII一、 前 言11.1生物冶金的概念11.2碲礦的生物冶金21.3氧化亞鐵硫桿菌的作用31.4 本實(shí)驗(yàn)研究?jī)?nèi)容3二、實(shí)驗(yàn)部分52.1實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備52.1.1菌種采集52.1.2實(shí)驗(yàn)試劑52.1.3實(shí)驗(yàn)儀器52.1.4培養(yǎng)基62.2研究方法72.2.1菌種富集培養(yǎng)72.2.2分離純化72.2.3單層平板的制作82.2.4雙層平板的制作92.2.5革蘭氏染色92.2.6 pH測(cè)定92.2.7細(xì)菌計(jì)數(shù)方法92.4生物特性研究112.4.1生長(zhǎng)曲線112.4.2氧化亞鐵硫桿菌菌株對(duì)能源的利用情況112.4.3最適生長(zhǎng)溫度的測(cè)定112.4.4最適初始pH值的測(cè)定11結(jié)果與討論12結(jié)論15致謝16參考文獻(xiàn)17一、 前 言礦物質(zhì)是在工業(yè)生產(chǎn)中不可缺少的物質(zhì)，是經(jīng)濟(jì)建設(shè)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。我國(guó)含有的礦產(chǎn)資源種類(lèi)豐富，礦產(chǎn)已探明儲(chǔ)量豐富。我國(guó)是一個(gè)地大物博的強(qiáng)大國(guó)家，但由于人口基數(shù)大，導(dǎo)至各種資源人均占有量低于世界平均水平。所以我國(guó)礦產(chǎn)資源相對(duì)緊缺，富礦多數(shù)已開(kāi)發(fā)利用，還有很多貧瘠礦，礦含量相對(duì)低于其它富礦，開(kāi)采難度大?，F(xiàn)有開(kāi)采技術(shù)的開(kāi)采方式對(duì)環(huán)境的破壞程度大，提取礦物質(zhì)也不完全正確，很多礦仍不能開(kāi)采。針對(duì)目前的情況，微生物浸礦是一種新的開(kāi)采方式，具有溶礦率高，不污染環(huán)境等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。1.1生物冶金的概念 生物冶金是利用礦物為營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)的微生物的作用，將礦物中金屬溶解，進(jìn)分離、富集、純化而提取金屬的濕法冶金技術(shù)。該技術(shù)具有流程短、成本低、環(huán)境友好和低污染等特點(diǎn)，特別適于處理貧礦、廢礦、表外礦及難采、難選、難冶礦的堆浸和就地浸出。從文獻(xiàn)記載來(lái)看，中國(guó)是世界上最早采用生物冶金技術(shù)的國(guó)家，早在公元前六、七世紀(jì)，就在采銅、鐵過(guò)程中不自覺(jué)地利用了自發(fā)生長(zhǎng)的某些自養(yǎng)細(xì)菌。而在歐洲，這種技術(shù)的應(yīng)用至少始于公元二世紀(jì)，從1687年開(kāi)始，瑞典中部Falun礦山的銅礦至少已經(jīng)浸出了2百萬(wàn)噸銅1。在國(guó)外，銅，鈾的生物提取以及含砷金礦的預(yù)氧化已實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。在銅的生物提取方面，目前用生物法提取的銅約占世界總銅產(chǎn)量的25%，在美國(guó)、加拿大、澳大利亞、智利等20多個(gè)國(guó)家實(shí)現(xiàn)了生物提銅產(chǎn)業(yè)化。在我國(guó)，也有2座銅的生物氧化提取廠投入生產(chǎn)。在含砷金礦的生物預(yù)氧化方面，隨著自然金開(kāi)采的日益枯竭，含砷難處理金礦己成為開(kāi)采對(duì)象，含砷金礦的主要礦物是黃鐵礦、毒砂，金以微粒成亞顯微形態(tài)包裹在硫化物中或浸染在黃鐵礦、毒砂的晶格中，細(xì)磨和直接氰化法很難提取。而使用氧化亞鐵硫桿菌等細(xì)菌分解外部的包裹層，可使金裸露出來(lái)，有利于化學(xué)浸出，從而提高金的回收率2。目前國(guó)外至少有10個(gè)生物氧化提金廠己經(jīng)籌建投產(chǎn)，國(guó)內(nèi)也建成了2個(gè)生物預(yù)氧化黃金生產(chǎn)廠。在鈾的生物提取方面，加拿大利用細(xì)菌浸鈾的規(guī)模最大、歷史最久，法國(guó)、美國(guó)、葡萄牙等國(guó)家也實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌浸鈾的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。目前世界范圍內(nèi)，生物冶金成功應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)的主要是銅、鈾和金銀等,使用范圍從堆浸法逐步擴(kuò)展到了地浸法和原地破碎浸礦法，正在向銅、鈾、錳、鉛、鎳、鉻、鉆、鐵、砷、鋅、鋁等幾乎所有硫化礦的浸出擴(kuò)大。產(chǎn)業(yè)化相對(duì)領(lǐng)先的國(guó)家有智利、澳大利亞、美國(guó)、南非、日本等，中國(guó)、歐盟也從近幾年先后投入大量資金開(kāi)展生物冶金領(lǐng)域的研究?？v觀全球，生物冶金業(yè)化主要在三個(gè)方面，并形成兩大技術(shù)3。1.2碲礦的生物冶金碲是一種稀有，但有很大利用價(jià)值的非金屬資源。在地殼中的含量很少, 僅有2×10-7，其應(yīng)用相當(dāng)廣泛，主要是用作鋼鐵有色金屬的添加劑, 其次是石油, 化工生產(chǎn)的催化劑,橡膠的硫化劑、促凝劑, 且在玻璃電子工業(yè)中有獨(dú)特用途。目前，碲已經(jīng)成為世界戰(zhàn)略需求資源，從軍事到民用，碲都發(fā)揮著不可替代的作用。碲礦物有碲金礦（AuTe2）、輝碲鉍礦(Bi2TeS2)和碲銅礦等，都很稀少。輝碲鉍礦（tetradymite）是一種鉍和碲的硫化物礦物，它具有的淺灰色帶有金屬光澤，并且還會(huì)褪色變暗。有葉、粒、塊狀等。輝碲鉍礦是一種較難獨(dú)立成礦的碲硫化物。在我國(guó)四川石棉縣大水溝發(fā)現(xiàn)的世界罕見(jiàn)的碲原生礦，有很大開(kāi)發(fā)前景。此礦石含碲一般在1%到12%，個(gè)別高達(dá)36.6%；含鉍一般在3%到20%，個(gè)別達(dá)40%以上4。由于碲礦分布相對(duì)分散，是一種低品位、難開(kāi)采礦，同時(shí)統(tǒng)開(kāi)采方式易造成資源浪費(fèi)、環(huán)境污染、能源消耗過(guò)大等問(wèn)題。而生物冶金正是能夠解決上述困難的新發(fā)展方向12。本文所用的礦樣為原礦經(jīng)浮選獲得的低品位碲精礦，是以輝碲鉍礦為主的混合硫化礦，用單因子實(shí)驗(yàn)法進(jìn)行不同pH條件下?lián)u瓶浸出試驗(yàn)，探究生物浸出時(shí)的一系列適宜條件，以期提高碲礦的生物浸出率。圖 11輝碲鉍礦（tetradymite）1.3氧化亞鐵硫桿菌的作用氧化亞鐵硫桿菌是嗜酸性化能自養(yǎng)型細(xì)菌, 專(zhuān)性好氧, 最佳生長(zhǎng)pH值為2.02.5, 最佳生長(zhǎng)溫度2835, 能以氧化Fe2 + 、元素S及金屬硫化物等來(lái)獲得生命過(guò)程中所需能量, 并以O(shè)2 作為氧化過(guò)程中的最終電子受體。這類(lèi)細(xì)菌很早就被應(yīng)用于貴金屬的浸出和回收, 適合于從低品位的礦石中浸出稀有貴金屬。細(xì)菌浸出的方法由于具有成本低、能耗小、無(wú)污染等特點(diǎn)而獲得廣泛應(yīng)用, 據(jù)報(bào)道美國(guó)有25%左右的銅是通過(guò)這種方法開(kāi)采的5。此外在含硫廢水處理和煤的脫硫、以及脫去硫化氫和二氧化硫等方面也有重要的應(yīng)用前景。然而由于氧化亞鐵硫桿菌的野生菌氧化Fe2 + 、元素S以及金屬硫化物的速度慢, 生長(zhǎng)條件要求苛刻, 以及對(duì)某些金屬離子缺乏耐受能力等, 從而限制了其應(yīng)用范圍。所以人們?cè)噲D通過(guò)各種馴化與誘變育種的方法來(lái)提高氧化亞鐵硫桿菌的適應(yīng)范圍和應(yīng)用價(jià)值。在生物浸礦中，最常用的菌種是氧化亞鐵硫桿菌。由于各地的氧化亞鐵硫桿菌不一樣，生長(zhǎng)狀況不一樣，在各種環(huán)境中的含量也不同。所以在將其運(yùn)用到工業(yè)生產(chǎn)中，首先要分離得到純的氧化亞鐵硫桿菌菌株。1.4 本實(shí)驗(yàn)研究?jī)?nèi)容通過(guò)對(duì)氧化亞鐵硫桿菌的一些文獻(xiàn)資料的分析，總結(jié)前人已有的成果，從實(shí)驗(yàn)室的浸礦溶液中分離出氧化亞鐵硫桿菌，前對(duì)其的一些基本生物活性進(jìn)行分析。調(diào)整培養(yǎng)基的各種理化條件，使其最適合氧化亞鐵硫桿菌的生長(zhǎng)，從而將此生產(chǎn)條件調(diào)節(jié)到此環(huán)境，以使氧化亞鐵硫桿菌最大程度的進(jìn)行生物浸礦。(1) 分離到氧化亞鐵硫桿菌菌株。(2) 分析氧化亞鐵硫桿菌的生物學(xué)活性。 (2)本文研究?jī)?nèi)容：技術(shù)路線：二、實(shí)驗(yàn)部分2.1實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備2.1.1菌種采集本實(shí)驗(yàn)所用菌液為本實(shí)驗(yàn)室以前浸礦培養(yǎng)液。 2.1.2實(shí)驗(yàn)試劑蒸餾水，（NH4）2SO4(分析純)，KCI(分析純)，K2HPO4(分析純)，MgSO4·7H2O(分析純)，Ca(N03)2(分析純)，F(xiàn)eSO4·7H2O (分析純)，K 2Cr2O7(化學(xué)純)，AgNO3(化學(xué)純)，二苯胺磺酸鈉(分析純)，KSCN(分析純)。2.1.3實(shí)驗(yàn)儀器本章實(shí)驗(yàn)所用到的主要儀器及其型號(hào)和生產(chǎn)廠家如表2一1所示: 表2一1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備儀器名稱(chēng)型號(hào)產(chǎn)地電子天平Y(jié)J2502上海精密科學(xué)儀器有限公司精密pH計(jì)PHS-3 C上海雷磁儀器廠臺(tái)式高速離心機(jī)5804R德國(guó)漢堡EppendorfCor.空氣浴振蕩器HZQ-C哈爾濱市東明醫(yī)療器械廠數(shù)控恒溫浴鍋DK-98-1天津市泰斯特儀器有限公司電子分析天平FA1104N上海精密科學(xué)儀器有限公司立式壓力蒸汽滅菌鍋YXQ-S-301上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠電熱恒溫培養(yǎng)箱DHP一9052上海一恒科技有限公司電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱DHG9070A上海一恒科技有限公司圖2-1 部分儀器2.1.4培養(yǎng)基氧化亞鐵硫桿菌的代表培養(yǎng)基是9K培養(yǎng)基和利森(Leathen)培養(yǎng)基，其組成見(jiàn)圖2-2。圖2-2 利森(Leathen)和9K培養(yǎng)基的組成69K富集培養(yǎng)基配置方法:9K鹽溶液: （NH4）2SO4,3.00g;KCl,0.10g; K2HPO4,0.50g;MgSO4·7H2O 0.50g; Ca(N03)2 0.01g;按此配方加蒸餾水配溶液1000mL。9K培養(yǎng)基:為9K鹽溶液加入FeSO4·7H2O 44.6g/L。改進(jìn)的9K固體培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基由A液、B液和C液三部分組成:A液: （NH4）2SO4 1.5g;KCI 0.1g，K2HPO40.5g; MgSO4·7H2O 0.5g，Ca(N03)2 0.01g，KSCN15.4g，蒸餾水200mL，121oC滅菌30min;B液: FeSO4·7H2O 22g蒸餾水300mL，pH2.0，用微孔濾膜(0.22um)過(guò)濾滅菌;C液:瓊脂糖10g，蒸餾水500mL，1210C滅菌20min。2.2研究方法2.2.1菌種富集培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中選用液體9K培養(yǎng)基對(duì)菌液進(jìn)行富集篩選。在250mL錐形瓶加入200mL滅菌后的9K鹽溶液和4.46g FeSO4·7H2O，用50%的H2SO4調(diào)到pH2.0左右，接種處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的菌種5mL，于30、160r/min搖床中恒溫震蕩培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)三到四次傳代培養(yǎng)，使得嗜酸氧化亞鐵硫桿菌成為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌7。培養(yǎng)基由淺綠色逐漸加深，最后變?yōu)樽丶t色，溶液混濁，且有沉淀出現(xiàn)。這表明液體培養(yǎng)基中Fe2+被氧化成了Fe3+，即有細(xì)菌生長(zhǎng)。對(duì)該菌液進(jìn)行計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)菌濃度己達(dá)到107108個(gè)/ml。2.2.2分離純化目前分離菌種主要采用以瓊脂(或瓊脂糖)作凝固劑的固體培養(yǎng)基進(jìn)行8。本實(shí)驗(yàn)采用稀釋涂布平板法，步驟如下:取菌液1mL，用pH=2.5的稀硫酸按每次稀釋10倍，依次稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6濃度的稀釋液。吸取稀釋度為10-4、10-5、10-6稀釋樣各0.2mL，分別接種到三個(gè)預(yù)先準(zhǔn)備好的9K瓊脂固體培養(yǎng)基，涂布均勻，正置于30恒溫生化培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，次日把培養(yǎng)皿倒置繼續(xù)培養(yǎng)，直至固體培養(yǎng)基表面出現(xiàn)圓形凸起狀小菌落(直徑大約1mm)，一般需要兩周9。將單獨(dú)小菌落挑起，每個(gè)小菌落分別接種到裝有5mL9K液體培養(yǎng)基的小錐形瓶(或試管)中，以棉球封口，放在30搖床中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。這樣培養(yǎng)出的即為單一菌的純培養(yǎng)10。如此反復(fù)，直到純化為止。操作均在無(wú)菌工作臺(tái)上進(jìn)行，所有器皿均經(jīng)高壓濕熱滅菌，接種環(huán)用酒精燈灼燒消毒。圖2-3 分離過(guò)程圖2.2.3單層平板的制作培養(yǎng)基分為三部分制作：(1)9K固體培養(yǎng)基(Fe2+=9g/L)A液:9K無(wú)鐵液體培養(yǎng)基42mL，pH3.0B液:1.5%瓊脂溶液40mLC液:14.78%FeS04·7H20溶液18mL(2)9K固體培養(yǎng)基(Fe2+=4.5g/L)A液:9K無(wú)鐵液體培養(yǎng)基42mL，pH.30B液:1.5%瓊脂溶液40mLC液:7.39%FeS04·7H20溶液18mL2.2.4雙層平板的制作在無(wú)菌平皿中倒入已溶化并冷卻至60的瓊脂作底層，待平板凝固后，用無(wú)菌吸管取0.1mL處于對(duì)數(shù)期的酵母菌菌液于底層平板并放置1-2h。再分別將用于分離T.f菌的固體培養(yǎng)基A、B、C液3者混合，迅速倒入混勻，作上層平板，凝固后備用11。2.2.5革蘭氏染色（1）用接種針挑取單個(gè)菌落，涂布于干凈載玻片上的一滴無(wú)菌水中，風(fēng)干（2）滴加結(jié)晶紫染色液染1-2 min，水洗，吸干；（3）用碘液沖去殘水，并用碘液覆蓋處理1 min，水洗，吸干；（4）用95%乙醇脫色，流滴至洗脫液無(wú)色，一般2030 s；（5）用番紅染液復(fù)染23 min，水洗；（6）風(fēng)干后用顯微鏡油鏡觀察。2.2.6 pH測(cè)定1、溶液pH值用奧立龍818型酸度計(jì)測(cè)定。2、使用pH試紙進(jìn)行測(cè)定。2.2.7細(xì)菌計(jì)數(shù)方法在測(cè)定細(xì)菌濃度時(shí)，細(xì)菌的計(jì)數(shù)方法較多，有顯微鏡直接測(cè)定法、平板計(jì)數(shù)法、光電比濁法、生物量測(cè)定法及DNA含量測(cè)定法等12?？紤]到直觀、起見(jiàn)，本實(shí)驗(yàn)在菌種性質(zhì)的研究中，細(xì)菌計(jì)數(shù)采用顯微鏡直接計(jì)數(shù)法，這包括計(jì)數(shù)板法、涂片染色法、比例計(jì)數(shù)法等，以計(jì)數(shù)板法最為常用，但該較費(fèi)時(shí)。該法是根據(jù)測(cè)定對(duì)象選用特制的載玻片(即計(jì)數(shù)板)，其上刻有己知面積的大小方格(即計(jì)數(shù)格)，當(dāng)蓋上蓋玻片后，蓋玻片與計(jì)數(shù)格間的高度為已知，因此計(jì)數(shù)格的容積為一定。根據(jù)在顯微鏡下測(cè)得的該計(jì)數(shù)格中的微生物個(gè)數(shù)，可算出單位體積待測(cè)液中所含微生物數(shù)13。該方法操作和步驟如下：(1)備片:取清潔干燥的計(jì)數(shù)板與蓋玻片(必要時(shí)，可微微烘干，以除去其上附著的水分)，蓋上蓋玻片。注意蓋玻片要蓋在計(jì)數(shù)室兩側(cè)14。(2)鏡檢計(jì)數(shù)室:在加樣前，先對(duì)計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室進(jìn)行鏡檢。若有污物，則需清洗后才能進(jìn)行計(jì)數(shù)。(3)加樣:用無(wú)菌吸管吸取充分搖勻并打散開(kāi)的待測(cè)菌液，小心滴一小滴于蓋玻片邊緣，菌液自行滲入并布滿(mǎn)計(jì)數(shù)室，注意避免產(chǎn)生氣泡。(4)顯微計(jì)數(shù):加樣后靜置35分鐘，鏡檢。根據(jù)受檢微生物個(gè)體大小選用適宜的物鏡頭，先用低倍物鏡找好計(jì)數(shù)室位置，然后換用高倍物鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)前如發(fā)現(xiàn)菌液過(guò)濃，可做一定倍數(shù)稀釋后再制片鏡檢計(jì)數(shù)，一般每個(gè)小方格內(nèi)有510個(gè)菌體為宜。一個(gè)計(jì)數(shù)室選5個(gè)中格(可選4個(gè)角和中央的中格)中的菌體進(jìn)行計(jì)數(shù)。位于格線上的菌體一般只數(shù)上方和右邊線上的。計(jì)數(shù)時(shí)注意轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)調(diào)節(jié)器，使液層上下菌數(shù)都可測(cè)到。每份菌液樣品至少計(jì)數(shù)兩次取其均值8。(5)清洗血球計(jì)數(shù)板:使用完畢后，將血球計(jì)數(shù)板在水龍頭上用水柱沖洗，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹風(fēng)機(jī)吹干。鏡檢，觀察每小格內(nèi)是否有殘留菌體或其他沉淀物。若不干凈，則必須重復(fù)洗滌至干凈為止。(6)結(jié)果計(jì)算:一個(gè)計(jì)數(shù)室就是一個(gè)大方格，分為25個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成16個(gè)小方格，所以每個(gè)計(jì)數(shù)室中的小方格數(shù)都是16X25=400個(gè)。每一個(gè)大方格邊長(zhǎng)為1mm，則每一個(gè)計(jì)數(shù)室的面積為1mm2，蓋上蓋玻片后，載玻片與蓋玻片之間的高度為0.1mm，所以計(jì)數(shù)室的容積為0.1mm3。在計(jì)數(shù)時(shí)，通常數(shù)五個(gè)中方格的總菌數(shù)，然后求得每個(gè)中方格的平均值，再乘上25，就得出一個(gè)計(jì)數(shù)室中的總菌數(shù)，然后再換算成1mL菌液中的總菌數(shù)。設(shè)五個(gè)中方格中總菌數(shù)為A，菌液稀釋倍數(shù)為B，那么，一個(gè)計(jì)數(shù)室的總菌數(shù)（即0.1mm3中的總菌數(shù)）為（A/5）*25*B；因此1mL=1000mm3，故1mL菌液中的總菌數(shù)=（A/5）*25*B*10*1000=50000A*B個(gè)。2.4生物特性研究2.4.1生長(zhǎng)曲線將預(yù)先培養(yǎng)好的細(xì)菌分別接種于亞鐵和元素硫的培養(yǎng)基中(接種終濃度為1·0×106個(gè)/mL),在2560或30及pH 1·05·0的條件下?lián)u床培養(yǎng),2天后每隔48 h取樣,用血小板計(jì)數(shù)法測(cè)定細(xì)菌的數(shù)量15。2.4.2氧化亞鐵硫桿菌菌株對(duì)能源的利用情況在100 mL基本鹽培養(yǎng)基中分別加入1 g除菌的單質(zhì)硫或4·31 g FeSO4·7H2O和1 g單質(zhì)硫的混合物、硫代硫酸鈉、葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、黃鐵礦和鐵閃鋅礦,分別配成含硫或亞鐵和硫、硫代硫酸鈉、不同碳源、不同礦樣的特別基質(zhì).然后,按2.4.1方法接種,在30條件下分別培養(yǎng)5天后,觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)情況.2.4.3最適生長(zhǎng)溫度的測(cè)定將相同數(shù)量的氧化亞鐵硫桿菌株接種到多份9 K葡萄糖液體培養(yǎng)基中，分別置于不同溫度條件下，經(jīng)170 r/min振蕩培養(yǎng)，第72 h時(shí)，在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)，確定不同溫度下菌株的生長(zhǎng)情況16。2.4.4最適初始pH值的測(cè)定將相同數(shù)量的氧化亞鐵硫桿菌株接種到不同初始pH值的9K葡萄糖液體培養(yǎng)基中，經(jīng)30、170 r/min振蕩培養(yǎng)，第72 h時(shí)于顯微鏡下直接計(jì)數(shù)，確定不同pH條件下細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。結(jié)果與討論通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)，綜合各項(xiàng)數(shù)據(jù)，進(jìn)行分析：1、菌種來(lái)源：本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)驗(yàn)室原有的浸礦溶液對(duì)研究者與使用者來(lái)說(shuō)，工業(yè)微生物即浸礦菌種的獲得一般有兩種方法：（1）從微生物保存單位直接購(gòu)買(mǎi)。這樣可以節(jié)省時(shí)間，并減少工作量，但這樣獲得的菌種常常沒(méi)有從自然界采集的野生菌適應(yīng)性強(qiáng)12。（2）直接從自然界中采集野生菌。這種細(xì)菌適應(yīng)性強(qiáng)，故人們常常從自然界中采集。2、細(xì)菌形態(tài)結(jié)構(gòu)革蘭氏染色，觀察細(xì)菌形態(tài)。菌體形態(tài)特征：該菌在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí),培養(yǎng)基的顏色由最初的淺綠色變?yōu)辄S綠色,約10天左右在培養(yǎng)皿上長(zhǎng)出小菌落,該菌落為黃褐色、圓形,直徑約0. 50. 8mm,中部突起,被水合高鐵包裹,質(zhì)地堅(jiān)硬,較難挑起17。在顯微鏡下該菌為短桿狀,兩端鈍圓,以單個(gè)、雙個(gè)或幾個(gè)呈短鏈狀存在,能運(yùn)動(dòng),革蘭氏染色陰性。圖2-4 細(xì)菌顯微結(jié)構(gòu)3、9K固體培養(yǎng)基制作固體培養(yǎng)基本可由液體培養(yǎng)基中加入一定比例的瓊脂直接制成，但因瓊脂在酸性環(huán)境中易于水解，在本實(shí)驗(yàn)中只有將培養(yǎng)基與瓊脂分開(kāi)滅菌后混合制平板。A、B液121濕熱滅菌15min，C經(jīng)0.22um微孔濾膜過(guò)濾除菌，待A、B液冷卻到60與C液混合后倒平板，待平板冷卻凝固后即可進(jìn)行菌液的涂布。4、營(yíng)養(yǎng)類(lèi)型：化能自養(yǎng)菌在富集培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)中,隨著菌體的生長(zhǎng), 9K液體培養(yǎng)基的顏色由淺綠色依次變?yōu)橥咙S色和紅棕色,這是由于溶液中Fe2+被氧化成Fe3+,最終有淡黃色黃鉀鐵礬沉淀生成;實(shí)驗(yàn)還表明該菌能利用亞鐵和單質(zhì)硫生長(zhǎng),但在蛋白胨培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng),所以該菌屬專(zhuān)性化能自養(yǎng)菌。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該菌具有氧化亞鐵硫桿菌的特性。5、生長(zhǎng)曲線生物氧化過(guò)程中Fe2+濃度以及細(xì)胞數(shù)目隨時(shí)間變化如圖，T.f生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期，細(xì)菌濃度達(dá)到最大值1.3x107個(gè)/mL。穩(wěn)定期可以持續(xù)到第7d，然后進(jìn)入衰亡期18。與對(duì)照相比，接種處理的培養(yǎng)液中Fe2+氧化主要發(fā)生在延滯期間，兩天后Fe2+基本耗盡。圖 2-4 氧化亞鐵菌菌株的生長(zhǎng)曲線6能源利用情況圖2-5為氧化亞鐵菌菌株亞鐵培養(yǎng)基和硫培養(yǎng)基中的典型生長(zhǎng)曲線.由圖2可知,培養(yǎng)早期細(xì)菌在亞鐵培養(yǎng)基中的增長(zhǎng)速度明顯比在硫培養(yǎng)基中的快,但100 h后,在硫培養(yǎng)基中的細(xì)菌濃度明顯高于在亞鐵培養(yǎng)基中的細(xì)菌濃度,細(xì)菌濃度達(dá)到108個(gè)/mL.細(xì)菌在利用元素硫時(shí),需要經(jīng)過(guò)一段時(shí)間誘導(dǎo)自身表達(dá)或合成分泌性疏水胞外物質(zhì),以利于與元素硫接觸,因而在開(kāi)始階段細(xì)菌的濃度較低.但一旦接觸好后,硫氧化比亞鐵氧化可提供更多的能量,所以培養(yǎng)后期細(xì)菌的濃度較高。圖 2-5 氧化亞鐵菌菌株在亞鐵和硫培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線結(jié)論本次實(shí)驗(yàn)，通過(guò)將氧化亞鐵硫桿菌菌液進(jìn)行倒平板，采用劃線分離法，得到氧化亞鐵菌株，再進(jìn)行生物特性的研究，得出以下結(jié)論：（1）從實(shí)驗(yàn)室樣品中分離純化得到細(xì)菌菌株，觀察：固體培養(yǎng)10天后出現(xiàn)菌落，均為黃褐色，圓形，直徑1mm，中部突出，質(zhì)地堅(jiān)硬?？梢岳脕嗚F和單質(zhì)硫作為能源。（2）T.ferrooxidans菌在亞鐵培養(yǎng)基中遲緩時(shí)間短，比生長(zhǎng)速率高，倍增時(shí)間短，說(shuō)明硫酸亞鐵相對(duì)于單質(zhì)硫是一種速效能源。(3)在硫培養(yǎng)基中T.ferrooxidans菌出現(xiàn)二次，甚至更多次的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)，最終細(xì)菌濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于亞鐵培養(yǎng)基中的細(xì)菌濃度，說(shuō)明單質(zhì)硫是一種長(zhǎng)效能源，能提供比亞鐵更高的能量。(4)對(duì)最佳生長(zhǎng)條件的研究表明,在初始pH 值為22. 5 ,溫度在3035 范圍內(nèi),初始Fe2+度為9 g/ L ,接種量為10 %時(shí),菌株既能維持良好的生長(zhǎng),又能對(duì)Fe2+的氧化速率保持較高水平。下一步將通過(guò)傳統(tǒng)誘變技術(shù)和現(xiàn)代基因工程手段改良該菌株,使其滿(mǎn)足工業(yè)化生產(chǎn)的需求。 參考文獻(xiàn) 1Bower Eva, Milne Annabel. 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