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成才之路 生物,路漫漫其修遠兮 吾將上下而求索,人教版 選修3,基因工程,專題一,第二節(jié) 基因工程的基本操作程序,專題一,1．了解目的基因獲取的常見方法。 2．理解基因表達載體的構(gòu)建是基因工程的核心。(重、難點) 3．掌握將目的基因?qū)胧荏w細胞的方法。(重點) 4．理解目的基因的檢測與鑒定。,基因工程的基本操作程序主要包括四個步驟：①____________________、②_____________________、③_______________________、④_________________________。 一、目的基因的獲取 1．從基因文庫中獲取目的基因：將含有某種生物⑤________的許多DNA片段，導入受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的⑥________，稱為基因文庫?；蛭膸炜纱罂尚?，如果它包含了一種生物所有的基因，就叫⑦___________；如果它只包含一種生物的一部分基因，就叫⑧______________，如⑨__________。,目的基因的獲取,基因表達載體的構(gòu)建,將目的基因?qū)胧荏w細胞,目的基因的檢測與鑒定,不同基因,不同基因,基因組文庫,部分基因文庫,cDNA文庫,2．從基因文庫中獲取目的基因的具體方法：可根據(jù)基因的⑩________序列、基因的功能、基因在染色體上的位置、基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA以及基因翻譯產(chǎn)物?________等特性來獲取目的基因。 3．利用PCR技術(shù)擴增目的基因：PCR技術(shù)是一項在生物體外?________特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。 (1)原理：利用?______________原理，將基因的核苷酸序列不斷加以復制，使其呈指數(shù)方式增加。指數(shù)擴增約為2n(n為擴增循環(huán)的次數(shù))。,核苷酸,蛋白質(zhì),復制,DNA雙鏈復制,(2)條件：已知目的基因的一段?________序列、?________、?________、?___________。 (3)過程：目的基因DNA受熱變性后解鏈為?________，與引物結(jié)合，然后在?____________的作用下進行延伸形成DNA。 4．人工合成法：?________比較小，核苷酸序列已知，可以人工合成。,核苷酸,引物,模板DNA,DNA聚合酶,單鏈,DNA聚合酶,基因,是使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并可以遺傳給下一代，同時，使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用,結(jié)構(gòu)基因,啟動子,DNA片段,RNA聚合酶,蛋白質(zhì),為了鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細胞篩選出來,抗生素抗性基因,農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,Ti質(zhì)粒的T－DNA,表達,基因槍法,花粉管通道法,顯微注射技術(shù),繁殖快、多為單細胞、遺傳物質(zhì)相對較少等,鈣離子,重組表達載體,DNA分子,目的基因,DNA分子雜交技術(shù),轉(zhuǎn)錄出mRNA,mRNA與DNA雜交技術(shù),翻譯成蛋白質(zhì),抗原—抗體雜交法,[思維激活] 1．為什么要用同一種限制酶切割質(zhì)粒和含目的基因的DNA分子？ 2．用于構(gòu)建基因表達載體的質(zhì)粒為什么必須具有啟動子和終止子？ 3．植物基因工程常用的受體細胞為什么可以是體細胞，而動物基因工程一般只用受精卵？,[答案] 1．目的是產(chǎn)生相同的黏性末端，便于兩者完全拼接。 2．導入到受體細胞的目的基因的表達需要調(diào)控序列，因此在插入目的基因的部位之前需有啟動子，之后需有終止子。 3．植物細胞的全能性較高，可經(jīng)植物組織培養(yǎng)過程成為完整植物體，因此受體細胞可以是受精卵也可以是體細胞；動物體細胞的全能性受到嚴格限制，因此動物基因工程中的受體細胞一般只用受精卵。,一、目的基因的獲取 目的基因的獲取概括地說主要有兩條途徑： ①可以從自然界中已有的物種中分離出來 ②可以用人工的方法合成,1．從基因文庫中獲取目的基因： 基因文庫的構(gòu)建實際上就遵循基因工程的基本操作程序。做法是：將某種生物體內(nèi)的DNA全部提取出來，選用適當?shù)南拗菩院怂醿?nèi)切酶，將DNA切成一定范圍大小的DNA片段，然后，將這些DNA片段分別與載體連接起來，導入受體菌的群體中儲存，每個受體菌都包含了一段不同的DNA片段。也就是說，這個群體包含了這種生物的所有基因，構(gòu)成了這種生物的基因組文庫。如果用某種生物發(fā)育的某個時期的mRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的多種互補DNA(也叫cDNA)片段，與載體連接后儲存在一個受體菌群中，那么，這個受體菌群體就叫做這種生物的cDNA文庫。cDNA文庫與基因文庫的區(qū)別可具體參閱教材中的“生物技術(shù)資料卡”。,2．利用PCR技術(shù)擴增目的基因： PCR技術(shù)是利用DNA雙鏈復制的原理，將基因的核苷酸序列不斷地加以復制，使其數(shù)量呈指數(shù)方式增加。利用PCR技術(shù)獲取目的基因的前提，是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引物。擴增的過程是：目的基因DNA受熱變性后解鏈為單鏈，引物與單鏈相應互補序列結(jié)合，然后在DNA聚合酶作用下進行延伸，如此重復循環(huán)多次。上述過程可以在PCR擴增儀中自動完成。,3．人工合成目的基因： 人工合成目的基因的方法主要有兩種。 (1)反轉(zhuǎn)錄法：主要用于相對分子質(zhì)量較大而又不知其序列的基因，它是以目的基因的mRNA為模板，借助反轉(zhuǎn)錄酶合成堿基互補的單鏈DNA，然后在DNA聚合酶的作用下合成雙鏈DNA。 (2)化學合成法：即依照某一蛋白質(zhì)的氨基酸序列，通過密碼子推算出其基因序列，然后直接合成目的基因。 知識貼士：由于真核細胞的基因含有不表達的DNA片段，不能直接用于基因的擴增和表達，因此，在獲取真核細胞中的目的基因時，一般是用人工合成目的基因的方法。,目的基因的分離是基因工程研究中的主要方面和操作關(guān)鍵。下面甲、乙圖表示從真核生物細胞中獲取目的基因的兩種方法，請回答下列問題。,,(1)在甲圖中，a過程是在________酶的作用下完成的。如果用該類酶中的一種，不一定能獲取目的基因，其原因是__________________________________________。 (2)在乙圖中，c過程在遺傳學上稱為________，d過程稱為________，d過程需以mRNA為模板，________為原料，還需要的條件是ATP、________、DNA聚合酶等。 (3)除了上述兩種方法可以獲取目的基因外，請你再寫出一種方法：__________________________________________。,[解析] 獲取目的基因的方法較多，甲是通過限制酶獲取目的基因，但由于切割位點可能在基因內(nèi)部，故可能得不到想要的目的基因；乙是通過信使RNA逆轉(zhuǎn)錄形成DNA(目的基因)的過程；此外，還可通過蛋白質(zhì)中氨基酸的排列順序推測基因的脫氧核苷酸序列，再進行化學合成。 [答案] (1)限制性核酸內(nèi)切 一種限制性核酸內(nèi)切酶只能對特定的堿基序列進行切割，此序列若在目的基因內(nèi)部，則不能得到目的基因 (2)轉(zhuǎn)錄 逆轉(zhuǎn)錄 脫氧核苷酸 逆轉(zhuǎn)錄酶 (3)根據(jù)已知蛋白質(zhì)中的氨基酸序列，可以推知基因的脫氧核苷酸序列，再進行化學合成,下列獲取目的基因的方法中需要模板鏈的是( ) ①從基因文庫中獲取目的基因 ②利用PCR技術(shù)擴增目的基因 ③反轉(zhuǎn)錄法 ④通過DNA合成儀利用化學方法人工合成 A．①②③④ B．①②③ C．②③④ D．②③ [答案] D,[解析] PCR利用的是DNA雙鏈復制原理。即將雙鏈DNA之間的氫鍵打開，變成單鏈DNA，作為聚合反應的模板。反轉(zhuǎn)錄法則是以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，先反轉(zhuǎn)錄形成互補的單鏈DNA，再合成雙鏈的DNA。①④則均不需要模板。,二、基因表達載體的構(gòu)建 基因表達載體的構(gòu)建是實施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。 1．構(gòu)建目的：其目的是使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。,2．表達載體的組成：啟動子＋目的基因＋終止子＋標記基因。 (1)目的基因 外源DNA分子的有效片段。 (2)啟動子 一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶的識別和結(jié)合部位，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得所需的蛋白質(zhì)。,(3)終止子 位于基因的尾端，也是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA短片段。終止子相當于一盞紅色信號燈，使轉(zhuǎn)錄到此終止。 (4)標記基因 鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細胞篩選出來，如抗生素抗性基因就可以作為這種基因。,3．目的基因與載體的結(jié)合： 將目的基因與載體結(jié)合的過程，實際上是不同來源的DNA重新組合的過程。如果以質(zhì)粒為載體，將目的基因與質(zhì)粒結(jié)合的步驟是： (1)用一定的限制酶切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個有黏性末端的切口。 (2)用同種限制酶切斷目的基因，產(chǎn)生相同的黏性末端。 (3)將切下的基因片段，插入到質(zhì)粒的切口處，再加入適量DNA連接酶，使質(zhì)粒與目的基因結(jié)合成重組質(zhì)粒。,4．差異性：由于受體細胞有動物、植物、微生物之分，加之目的基因?qū)胧荏w細胞的方法不同，所以表達載體的構(gòu)建也會有差異性。 知識貼士：①生物之間進行基因交流，需使用啟動子和終止子才能比較有利于基因的表達。如通過cDNA文庫獲得的目的基因沒有啟動子，只將編碼序列導入受體生物中，此目的基因無法進行轉(zhuǎn)錄。 ②目的基因是否導入受體生物中需要有篩選標記。 ③為了增強目的基因的表達水平，往往還要增加一些其他調(diào)控元件，如增強子等。,④有時需要確定目的基因表達的產(chǎn)物存在于細胞的什么部位，往往要加上可以標記存在部位的基因(或做成目的基因與標記基因的融合基因)，如綠色熒光蛋白基因等。,下表中列出了幾種限制酶識別序列及其切割位點，圖1、圖2中箭頭表示相關(guān)限制酶的酶切點。請回答下列問題：,,,(1)一個圖1所示的質(zhì)粒分子經(jīng)SmaⅠ切割前后，分別含有________個游離的磷酸基團。 (2)若對圖中質(zhì)粒進行改造，插入的SmaⅠ酶切位點越多，質(zhì)粒的熱穩(wěn)定性越________。 (3)用圖中的質(zhì)粒和外源DNA構(gòu)建重組質(zhì)粒，不能使用SmaⅠ切割，原因是________。 (4)與只使用EcoRⅠ相比較，使用BamHⅠ和HindⅢ兩種限制酶同時處理質(zhì)粒、外源DNA的優(yōu)點在于可以防止________。 (5)為了獲取重組質(zhì)粒，將切割后的質(zhì)粒與目的基因片段混合，并加入________酶。 (6)重組質(zhì)粒中抗生素抗性基因的作用是為了________。,[解析] (1)切割前質(zhì)粒為環(huán)狀，不含游離的磷酸基團。切割后質(zhì)粒成了一個鏈狀的雙鏈DNA分子，含兩個游離的磷酸基團。(2)因為SmaⅠ識別序列中均為G—C堿基對，G、C之間含三個氫鍵，熱穩(wěn)定性高。(3)據(jù)題圖可知，SmaⅠ既會破壞標記基因，也會破壞目的基因。(4)若用同種限制性內(nèi)切酶切割質(zhì)粒和外源DNA中的目的基因，因為兩端的黏性末端能夠互補配對，會出現(xiàn)自身環(huán)化的情況。而用兩種限制性內(nèi)切酶切割，因為兩端形成的黏性末端不能夠互補配對，不會出現(xiàn)自身環(huán)化。(5)DNA連接酶可以連接具有能夠互補配對黏性末端的DNA片段。(6)標記基因可以鑒別受體細胞是否含有目的基因。,[答案] (1)0、2 (2)高 (3)SmaⅠ會破壞質(zhì)粒的抗生素抗性基因、外源DNA中的目的基因 (4)質(zhì)粒和含目的基因的外源DNA片段自身環(huán)化 (5)DNA連接 (6)鑒別和篩選含有目的基因的細胞,(2015聊城檢測)下列關(guān)于基因表達載體的構(gòu)建描述錯誤的是( ) A．基因表達載體的構(gòu)建是基因工程的核心 B．基因表達載體的構(gòu)建包括目的基因、啟動子、終止子、標記基因等部分 C．目的基因主要是指編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因 D．構(gòu)建的基因表達載體都是相同的 [答案] D,[解析] 基因表達載體的構(gòu)建是基因工程的第二步，也是基因工程的核心；一個基因表達載體的組成除目的基因外還必須具有啟動子、終止子、標記基因等部分；目的基因主要是指編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因；由于受體細胞不同，基因表達載體的構(gòu)建也會有差別，不可能都是相同的。,三、將目的基因?qū)胧荏w細胞 將目的基因?qū)胧荏w細胞是實施基因工程的第三步。目的基因進入受體細胞內(nèi)，并且在受體細胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達的過程稱為轉(zhuǎn)化。 將目的基因?qū)胧荏w細胞的方法很多，應具體情況具體分析。不同受體細胞導入方法不同。,知識貼士：①農(nóng)桿菌是一種在土壤中生活的微生物，能在自然條件下感染雙子葉植物和裸子植物，而對大多數(shù)單子葉植物沒有感染力。此外，將目的基因?qū)胫参锛毎€可采用基因槍法和花粉管通道法。 ②以上介紹的幾種方法，在導入受體細胞之前，都必須進行目的基因表達載體的構(gòu)建，也就是說導入受體細胞的必須是重組DNA分子，而不能直接導入目的基因。,采用基因工程的方法培育抗蟲棉，下列導入目的基因的做法正確的是( ) ①將毒素蛋白注射到棉受精卵中 ②將編碼毒素蛋白的DNA序列，注射到棉受精卵中 ③將編碼毒素蛋白的DNA序列，與質(zhì)粒重組，導入細菌，用該細菌感染棉的體細胞，再進行組織培養(yǎng) ④將編碼毒素蛋白的DNA序列，與細菌質(zhì)粒重組，注射到棉的子房并進入受精卵 A．①② B．②③ C．③④ D．①④,[解析] 考查基因工程的操作步驟?；蚬こ痰牟僮鞑襟E是：目的基因的獲取―→基因表達載體的構(gòu)建―→目的基因?qū)胧荏w細胞―→目的基因的檢測和鑒定。本題著重考查基因工程步驟中的第三步：目的基因必須與細菌質(zhì)粒重組，形成目的基因表達載體，方可導入棉受精卵中。 [答案] C,(2015濰坊檢測)下列關(guān)于目的基因?qū)胛⑸锛毎臄⑹鲋?，不正確的是( ) A．常用原核生物作為受體細胞，是因為原核生物繁殖快，且多為單細胞、遺傳物質(zhì)相對較少 B．受體細胞所處的一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)稱為感受態(tài) C．感受態(tài)細胞吸收DNA分子需要適宜的溫度和酸堿度 D．感受態(tài)細胞吸收重組表達載體DNA分子的液體只要調(diào)節(jié)為適宜的pH即可，沒必要用緩沖液,[答案] D [解析] 由于原核生物繁殖快，且多為單細胞、遺傳物質(zhì)相對較少等特點，所以早期的基因工程通常用原核生物作為受體細胞；受體細胞經(jīng)Ca2＋處理后，處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)，稱為感受態(tài)；感受態(tài)細胞吸收DNA分子需要在適宜的溫度和酸堿度的緩沖液中完成。,四、目的基因的檢測與鑒定 目的基因?qū)胧荏w細胞后，是否可以穩(wěn)定維持和表達其中遺傳特性，只有通過檢測與鑒定才能知道。這是基因工程的第四步工作，也是檢查基因工程是否做成功的一步。 目的基因的檢測內(nèi)容和方法的比較如下表：,知識貼士：①目的基因在受體細胞中的存在與表達是有區(qū)別的。目的基因被受體細胞攝取是表達的前提，但是被攝取并不意味著被表達。由于各種因素的影響，有時還需要采取一定的措施去促使目的基因的表達。 ②DNA探針的應用所依據(jù)的原理是DNA分子雜交。DNA分子雜交是指DNA片段在適合的條件下能和與之互補的另一個片段結(jié)合。如果對最初的DNA片段進行標記，即成為探針。,目的基因?qū)胧荏w細胞后，是否可以穩(wěn)定維持和表達其遺傳特性，只有通過鑒定和檢測才能知道。下列屬于目的基因檢測和鑒定的是( ) ①檢測受體細胞是否有目的基因 ②檢測受體細胞是否有致病基因 ③檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄 ④檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì) A．①②③ B．②③④ C．①③④ D．①②④,[解析] 本題考查目的基因的檢測與鑒定。目的基因的檢測首先要檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因，方法是用DNA分子雜交技術(shù)，使DNA探針與基因組DNA雜交；其次檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA，方法是用基因探針與mRNA雜交；最后檢測目的基因是否翻譯成了蛋白質(zhì)，方法是用抗原—抗體雜交。 [答案] C,利用外源基因在受體細胞中表達，可生產(chǎn)人類所需要的產(chǎn)品。下列各項中能說明目的基因完成了在受體細胞中表達的是( ) A．棉花二倍體細胞中檢測到細菌的抗蟲基因 B．大腸桿菌中檢測到人胰島素基因及其mRNA C．山羊乳腺細胞中檢測到人生長激素DNA序列 D．酵母菌細胞中提取到人干擾素蛋白 [答案] D,一、易混淆概念辨析 1．基因、基因文庫、目的基因 (1)基因是有遺傳效應的DNA片段，是控制性狀的遺傳物質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)和功能單位，基因的脫氧核苷酸序列代表遺傳信息。,(2)基因文庫是將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導入受體菌的群體中通過克隆而儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，叫做基因文庫。建立基因文庫的目的就是為獲得大量的目的基因作準備。如果基因文庫中含有一種生物的所有基因，這個基因文庫就叫做基因組文庫。如果基因文庫中含有一種生物的部分基因，這個基因文庫就叫做cDNA文庫?；蛭膸炀拖喈斢谀撤N生物的基因倉庫，儲備著大量的同種基因。 (3)目的基因是基因工程操作中需要的外源基因，它是編碼某種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因，如生物的抗逆性基因、抗蟲基因等。,2．DNA復制、PCR技術(shù)與基因克隆 (1)DNA復制與PCR技術(shù)的比較,(2)克?。河枚喾N限制性核酸內(nèi)切酶或者機械的方法，將某種生物細胞中的DNA切成不同片段，并把所有片段隨機地分別連接到用同種限制酶切過的基因運載體上，然后分別轉(zhuǎn)移到適當受體細胞，如細菌中。通過細胞增殖而構(gòu)成各個片段的無性繁殖系。,二、提取目的基因方法的比較,水稻種子中70%的磷以植酸形式存在。植酸易同鐵、鈣等金屬離子或蛋白質(zhì)結(jié)合排出體外，是多種動物的抗營養(yǎng)因子；同時，排出的大量磷進入水體易引起水華。 為從根本上解決水稻中的高植酸問題，可將植酸酶基因?qū)胨?，培育低植酸轉(zhuǎn)基因水稻品種。下圖是獲取植酸酶基因的流程。,據(jù)圖回答： (1)圖中基因組文庫________(小于/等于/大于)cDNA文庫。 (2)B過程需要的酶是________；A、C過程中________(可以/不可以)使用同一種探針篩選含目的基因的菌株。 (3)目的基因Ⅰ和Ⅱ除從構(gòu)建的文庫中分離外，還可以分別利用圖中________和________為模板直接進行PCR擴增，該過程中所用酶的顯著特點是________。,[解析] 由于mRNA是以DNA一條鏈為模板轉(zhuǎn)錄出來的，所以A、C可以使用同一種探針篩選含目的基因的菌株。 [答案] (1)大于 (2)逆轉(zhuǎn)錄酶 可以 (3)DNA cDNA 耐高溫,