1.2 基因工程的基本操作程序,探究1 目的基因的獲取 【研讀教材自主認知】 1.目的基因:主要是指_的基因,也可以是一些具有_ _的因子。 2.目的基因的來源:可以從自然界中已有的_中分離出來,也可以 用_合成。,編碼蛋白質(zhì),調(diào)控作,用,物種,人工的方法,3.獲取目的基因常用的方法: (1)從_中獲取。 (2)利用PCR技術(shù)擴增目的基因。 (3)人工合成法。,基因文庫,【小判斷】 (1)基因工程的核心步驟是目的基因的獲取。 ( ) 【分析】基因工程操作的核心是基因表達載體的構(gòu)建,目的基因的獲 取是基因工程操作的第一步。 (2)目的基因可以從自然界已有的物種中分離,也可以用化學(xué)方法人工 合成。 ( ) 【分析】如果目的基因的序列是已知的,可以采用化學(xué)方法合成,如合 成胰島素基因。,(3)人工合成目的基因不需要用限制性核酸內(nèi)切酶。 ( ) 【分析】人工合成目的基因有兩種方法,其一是化學(xué)合成法,即用游離的脫氧核苷酸合成,不需要限制性核酸內(nèi)切酶;其二是反轉(zhuǎn)錄法,即用已知的mRNA和反轉(zhuǎn)錄酶先合成DNA單鏈,再進一步得到DNA雙鏈,也不需要限制性核酸內(nèi)切酶。,【合作探究核心歸納】 1.從基因文庫中獲取目的基因: (1)cDNA文庫是從某種生物的某一細胞中提取出mRNA,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄過程獲得的基因文庫,為什么該基因文庫僅含有該生物的部分基因? 提示:由于基因的選擇性表達,某種生物的某一細胞中僅有部分基因轉(zhuǎn)錄出mRNA,所以由該細胞中的mRNA反轉(zhuǎn)錄得到的基因文庫僅含該生物的部分基因。,(2)結(jié)合基因文庫、基因組文庫、cDNA文庫的概念,嘗試從范圍上比較三者之間的大小關(guān)系,并闡明理由。 提示:基因文庫基因組文庫cDNA文庫?；蚪M文庫含有一種生物的全部基因,而cDNA文庫只含有一種生物的部分基因,二者都屬于基因文庫。,2.利用PCR技術(shù)擴增目的基因: PCR是體外擴增DNA的技術(shù),結(jié)合細胞內(nèi)DNA的復(fù)制過程討論下列問題。 (1)結(jié)合相關(guān)知識填充表格內(nèi)容:,DNA在高溫作用下變性解旋,細胞內(nèi),(主要在細胞核內(nèi)),(2)利用PCR技術(shù)擴增目的基因時,需要哪些物質(zhì)和條件。 提示:需要模板、脫氧核苷酸、引物、耐高溫的DNA聚合酶等。,3.人工合成法: 人工合成目的基因時,需要預(yù)先知道目的基因的核苷酸序列。請推測目的基因的核苷酸序列是如何得到的? 提示:測定目的基因產(chǎn)物的氨基酸序列,根據(jù)密碼子表推測mRNA的可能的核糖核苷酸序列,再根據(jù)堿基互補配對原則推測出目的基因的脫氧核苷酸序列。,【歸納總結(jié)】獲取目的基因的四種方法,【過關(guān)小練即時應(yīng)用】 1.(2015長沙高二檢測)有關(guān)PCR技術(shù)的說法,不正確的是 ( ) A.PCR是一項在生物體外復(fù)制特定的DNA片段的核酸合成技術(shù) B.PCR的原理是DNA雙鏈復(fù)制 C.利用PCR獲取目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序 列 D.PCR擴增中必須有解旋酶才能解開雙鏈DNA,【解題指南】解答本題注意以下關(guān)鍵點: (1)PCR技術(shù)擴增DNA的原理為DNA復(fù)制。 (2)PCR技術(shù)中突出的兩點是不需要解旋酶,但是需要耐高溫的DNA聚合酶。 【解析】選D。PCR技術(shù)是一種體外DNA分子復(fù)制技術(shù),A正確;其理論基礎(chǔ)是DNA分子的復(fù)制,B正確;該過程需要一段已有的DNA分子作為模板,C正確;需要四種游離的脫氧核苷酸作為原料,還需要耐熱的DNA聚合酶,但是不需要解旋酶,在復(fù)制過程中DNA的解旋是由加熱過程實現(xiàn)的,D錯誤。,2.(2015揭陽高二檢測)為從根本上解決水稻中的高植酸問題,可將植酸酶基因?qū)胨?培育低植酸轉(zhuǎn)基因水稻品種。下圖是獲取植酸酶基因的流程。,據(jù)圖回答: (1)B過程需要的酶是 。 (2)獲得植酸酶基因的方法除圖中所示外,還有 方法。 (3)目的基因和除可從構(gòu)建的文庫中分離外,還可以分別利用圖中 和 為模板直接進行PCR擴增,該過程中所用酶的顯著 特點是 。,【解題指南】解答本題的關(guān)鍵在于:,【解析】B過程是以RNA為模板合成DNA的反轉(zhuǎn)錄過程,需要的酶應(yīng)該是反轉(zhuǎn)錄酶;目的基因和除可從構(gòu)建的文庫中分離外,還可以分別利用圖中DNA和cDNA為模板直接進行PCR擴增,該過程中所用酶的顯著特點是耐高溫。 答案:(1)反轉(zhuǎn)錄酶 (2)人工合成 (3)DNA cDNA 耐高溫,【補償訓(xùn)練】獲取目的基因的方法有多種,下列不屬于目的基因獲取方法的是 ( ) A.從基因組文庫中獲取 B.從cDNA文庫中獲取 C.直接從細胞質(zhì)中獲取 D.利用PCR技術(shù)擴增 【解析】選C。獲取目的基因的方法常用的有以下幾種:從基因文庫中獲取,利用PCR技術(shù)擴增,用化學(xué)方法直接人工合成。細胞質(zhì)中不能獲取目的基因。,探究2 基因表達載體的構(gòu)建和將目的基因?qū)胧荏w細胞 【研讀教材自主認知】 1.基因表達載體的構(gòu)建: (1)構(gòu)建目的: 使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在,并且可以_給下一代。 使目的基因能夠_和發(fā)揮作用。,遺傳,表達,(2)基因表達載體的組成:,RNA聚合酶,mRNA,轉(zhuǎn)錄,受體細胞,目的基因,2.將目的基因?qū)胧荏w細胞: 將相應(yīng)的受體細胞和導(dǎo)入方法進行連線,【小判斷】 (1)基因表達載體中含啟動子和密碼子。 ( ) 【分析】密碼子由位于信使RNA上的三個相鄰的堿基構(gòu)成,基因表達載 體中無密碼子。 (2)基因工程中所用的受體細胞只有大腸桿菌一種。 ( ) 【分析】基因工程中常用的受體細胞有大腸桿菌、枯草桿菌、酵母菌、 植物細胞和動物細胞的受精卵等。,(3)重組DNA分子都能進入受體細胞。 ( ) 【分析】重組DNA分子導(dǎo)入受體細胞時,不是所有的重組DNA分子都能進入受體細胞,也不能保證所有的受體細胞都有重組DNA分子,因此在導(dǎo)入后需要篩選含有目的基因的受體細胞。 (4)動物的體細胞也能作為受體細胞。 ( ) 【分析】動物體細胞的全能性受到限制,只有細胞核具有全能性,所以不能作為受體細胞。,【合作探究核心歸納】 1.基因表達載體的構(gòu)建: (1)為什么切割目的基因和載體要選用同一種限制性核酸內(nèi)切酶? 提示:選用同一種限制性核酸內(nèi)切酶切割會產(chǎn)生相同的黏性末端,可以在DNA連接酶的作用下將切割的目的基因和載體連接起來。,(2)在實際的基因工程操作時往往用兩種限制性核酸內(nèi)切酶分別切割目的基因的兩端以及載體,這樣做有什么好處?試分析原因。 提示:可以有效避免載體與載體以及目的基因與目的基因的連接,提高連接的有效性。,如果用一種限制性核酸內(nèi)切酶切割,目的基因兩側(cè)的末端以及質(zhì)粒切口的兩個末端都是互補的,因此連接時可能會出現(xiàn)載體與載體、目的基因與目的基因、目的基因與載體三種連接情況,而符合要求的只有載體與目的基因的連接。 如果用兩種不同的限制性核酸內(nèi)切酶進行切割就可以有效避免載體與載體以及目的基因與目的基因的連接,提高連接的有效性。,(3)分析基因表達載體模式圖,回答下面問題。,在基因表達載體中,啟動子和終止子的位置是否可以互換?試分析原因。 提示:不可以。啟動子是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位,使轉(zhuǎn)錄開始;終止子位于基因的尾端,使轉(zhuǎn)錄終止;只有順序正確,目的基因才能正常轉(zhuǎn)錄。 能否將目的基因插入載體的標記基因中?為什么? 提示:不能。標記基因用于鑒定受體細胞是否成功導(dǎo)入目的基因,以便將含目的基因的細胞篩選出來,若有目的基因插入,則標記基因被破壞,無法進一步篩選。,2.將目的基因?qū)胧荏w細胞: 分析農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法示意圖,回答第(1)題。,(1)在用土壤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將目的基因?qū)胫参锛毎倪^程中,為什么一定要將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA上? 提示:Ti質(zhì)粒上的T-DNA也稱為可轉(zhuǎn)移DNA,可轉(zhuǎn)移至受體細胞,并且整合到受體細胞染色體的DNA上。,(2)植物基因工程常用的受體細胞為什么可以是體細胞,而動物基因工程一般只用受精卵? 提示:植物體細胞的全能性較高,可經(jīng)植物組織培養(yǎng)過程形成完整植物體,因此受體細胞可以是體細胞;動物體細胞的全能性受到嚴格限制,因此動物基因工程中的受體細胞一般只用受精卵。 (3)將目的基因?qū)胛⑸锛毎麜r,為什么受體細胞常選擇原核生物? 提示:原核生物具有繁殖快、多為單細胞、遺傳物質(zhì)相對較少等特點。,(4)導(dǎo)入微生物細胞時,常用Ca2+處理的機理是什么? 提示:Ca2+可以改變細胞膜的通透性,使細胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)。,【規(guī)律方法】選擇受體細胞的方法 (1)植物:可以是受精卵(花粉管通道法)或體細胞(可經(jīng)組織培養(yǎng)成為完整植株)。 (2)動物:受精卵(因為體細胞的全能性難以表達)。 (3)微生物:若要獲得基因產(chǎn)物,常把目的基因轉(zhuǎn)入細菌、酵母菌等微生物中。微生物的繁殖速度較快,短時間內(nèi)可獲得大量基因產(chǎn)物。,【歸納總結(jié)】基因表達載體的構(gòu)建過程 將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的切口處,再加入適量DNA連接酶,形成一個重組DNA分子(重組質(zhì)粒)。構(gòu)建過程如下圖所示:,【過關(guān)小練即時應(yīng)用】 1.(2015邢臺高二檢測)如圖是利用基因工程技術(shù)培育轉(zhuǎn)基因植物,生產(chǎn)可食用疫苗的部分過程示意圖,其中Pst、Sma、EcoR、Apa為四種限制酶。下列說法錯誤的是 ( ),A.圖示過程是基因工程的核心步驟 B.表達載體構(gòu)建時需要用到限制酶Sma C.抗卡那霉素基因的存在有利于將含有抗原基因的細胞篩選出來 D.除圖示組成外,表達載體中還應(yīng)該含有啟動子和終止子等結(jié)構(gòu),【解題指南】解答本題需要注意兩個關(guān)鍵點: (1)明確基因表達載體必需的構(gòu)成。 (2)在保證表達載體必備結(jié)構(gòu)完整的情況下選擇目的基因的插入位點,從而選擇相應(yīng)的限制酶。 【解析】選B。圖示過程為基因表達載體的構(gòu)建過程,是基因工程中的核心步驟,A正確。構(gòu)建過程中需要將目的基因完整切割下來,此時要用到限制酶Pst、EcoR,B錯誤?？箍敲顾鼗蚴菢擞浕?目的是便于鑒定和篩選含有目的基因的細胞,C正確?；虮磉_載體包括啟動子、目的基因、終止子和標記基因等,D正確。,2.農(nóng)桿菌是一種在土壤中生活的微生物,能在自然條件下感染植物,因而在植物基因工程中得到了廣泛的應(yīng)用。下圖為農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的示意圖,試回答下列問題:,(1)一般情況下農(nóng)桿菌不能感染的植物是 , 利用農(nóng)桿菌能在自然條件下感染植物的特點,能實現(xiàn)_ 。具體原理是在農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒上存在 T-DNA片段,它具有可轉(zhuǎn)移到受體細胞并整合到受體細胞的_ 上的特點,因此只要將攜帶外源基因的DNA片段插入_ (部位)即可。 (2)根據(jù)T-DNA這一轉(zhuǎn)移特點,猜測該DNA片段上可能含有控制_ (酶)合成的基因。,(3)圖中c過程中,能促進農(nóng)桿菌移向植物細胞的物質(zhì)是 類化合物。 (4)植物基因工程中將目的基因?qū)胧荏w細胞的方法除了農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法之外,還可采取 。(至少寫出兩種),【解題指南】解答本題的關(guān)鍵: (1)分析農(nóng)桿菌能感染雙子葉植物和裸子植物的本質(zhì)。 (2)分析農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒中的T-DNA特點及其整合到染色體DNA的實質(zhì)。,【解析】(1)一般農(nóng)桿菌不能感染單子葉植物,可感染雙子葉植物和裸 子植物,利用其感染性,可實現(xiàn)目的基因?qū)胫参锛毎?。這里應(yīng)特別明 確的是真正可轉(zhuǎn)移到受體細胞并整合到受體細胞的染色體DNA上的是 農(nóng)桿菌T-DNA片段,因此目的基因必須插入該部位才能成功。(2)由 T-DNA這一轉(zhuǎn)移特點,可以推測該DNA片段能控制合成DNA連接酶、限 制酶,才能實現(xiàn)與雙子葉植物細胞的染色體DNA整合。(3)植物細胞受 傷后可產(chǎn)生酚類物質(zhì),促進農(nóng)桿菌向植物細胞轉(zhuǎn)移。(4)植物基因工程 中除了農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法之外,還有基因槍法和花粉管通道法。,答案:(1)單子葉植物 目的基因?qū)胫参锛毎?染色體DNA T-DNA片段(內(nèi)部) (2)DNA連接酶、限制酶 (3)酚 (4)基因槍法、花粉管通道法,【補償訓(xùn)練】將目的基因?qū)胛⑸锛毎淖畛Ｓ梅椒ㄊ?( ) A.感受態(tài)細胞法 B.顯微注射法 C.基因槍法 D.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,【解析】選A。將目的基因?qū)胛⑸锛毎畛Ｓ玫姆椒ㄊ歉惺軕B(tài)細胞法,其主要步驟是:首先用Ca2+處理微生物細胞,使細胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài),稱為感受態(tài)細胞;第二步是將重組表達載體DNA分子溶于緩沖液中與感受態(tài)細胞混合,在一定的溫度下促進感受態(tài)細胞吸收DNA分子,完成轉(zhuǎn)化過程。,探究3 目的基因的檢測與鑒定 【研讀教材自主認知】 根據(jù)教材知識完成下表,DNA分子雜交技術(shù),mRNA,分子雜交技術(shù),抗原抗體雜交法,【合作探究核心歸納】 1.將目的基因成功導(dǎo)入受體細胞后是否意味著基因工程操作成功?為什么? 提示:不是。將目的基因?qū)胧荏w細胞后還要進一步鑒定目的基因是否成功表達。 2.DNA分子雜交的原理是什么?除了用于目的基因檢測與鑒定以外,試舉例說明還有哪些應(yīng)用。 提示:堿基互補配對原則。還可用于親子鑒定、刑事偵察、生物親緣關(guān)系確定等。,3.檢測棉花中導(dǎo)入的抗蟲基因是否表達的最簡便的方法是什么? 提示:用葉片飼養(yǎng)棉鈴蟲,觀察棉鈴蟲是否死亡。 4.基因工程操作的四個步驟中,有哪幾個步驟涉及堿基互補配對? 提示:目的基因的獲取、基因表達載體的構(gòu)建和目的基因的檢測與鑒定。,【歸納總結(jié)】目的基因的檢測與鑒定的方法匯總,【過關(guān)小練即時應(yīng)用】 1.要檢測目的基因是否成功地插入了受體DNA中,需要用基因探針檢測。基因探針是指 ( ) A.用于檢測疾病的醫(yī)療器械 B.用放射性同位素或熒光分子等標記的單鏈DNA分子 C.合成-球蛋白的DNA片段 D.合成苯丙羥化酶的DNA片段,【解題指南】解答本題的關(guān)鍵: (1)明確基因探針的本質(zhì)是單鏈DNA。 (2)明確基因探針的作用原理是堿基互補配對原則。 【解析】選B。基因探針是指一段已知的DNA片段(實際上是單鏈),為便于對雜交的結(jié)果進行檢測,需要對其進行放射性同位素或熒光分子標記。,2.檢測蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因?qū)朊藁毎欠褚驯磉_的方法是 ( ) A.是否有抗生素抗性 B.是否能檢測到標記基因 C.是否有相應(yīng)的性狀 D.是否能分離到目的基因 【解題指南】明確檢測目的基因是否成功表達的兩個方法,即在分子 水平和個體生物學(xué)水平進行檢測。 【解析】選C?；虮磉_指的是基因轉(zhuǎn)錄翻譯出相應(yīng)的蛋白質(zhì),檢測蘇 云金芽孢桿菌的抗蟲基因?qū)朊藁毎欠褚驯磉_,應(yīng)在個體生物學(xué) 水平上檢測是否有相應(yīng)的性狀出現(xiàn)。,【互動探究】檢測導(dǎo)入基因是否表達,除題目中的方法外,還可以檢測哪種物質(zhì)的存在?利用什么技術(shù)? 提示:可以檢測轉(zhuǎn)基因生物的相應(yīng)細胞中是否存在目的基因所表達的蛋白質(zhì);所用的方法是抗原抗體雜交技術(shù)。,【補償訓(xùn)練】用人的胰高血糖素基因制成的DNA探針檢測下列物質(zhì),不可能形成雜交分子的是 ( ) A.人胰島A細胞中的DNA B.人胰島A細胞中的mRNA C.人胰島B細胞中的DNA D.人胰島B細胞中的mRNA 【解析】選D。DNA分子探針檢測利用的原理是堿基互補配對,需要被測分子中含有相應(yīng)的堿基序列,胰島B細胞中不表達胰高血糖素,因此也不具有相應(yīng)的mRNA,因此不能形成雜交分子。,