單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級(jí),第三級(jí),第四級(jí),第五級(jí),*,1,谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶的制備及動(dòng)力學(xué)研究,實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：,（一）,親和層析法制備谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶,（二）測(cè)定酶活力、米氏常數(shù)和最大反應(yīng)速度,（三）,Folin-,酚法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，計(jì)算比活力,倔椿堪殃政挪櫻歪浸謾底粥絳擊劈瘋擎伏膀楷摳錐鋒唇邀謝逝與允求喻裹谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶的制備谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶的制備,2,課前思考題,1.,關(guān)于谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶。,2.,生物大分子的制備前期實(shí)驗(yàn)材料的預(yù)處理和蛋白質(zhì)的提取方法。,3.,親和層析的原理，影響親和層析的因素。,4.,關(guān)于配基、載體及配基的偶聯(lián)。,5.,本實(shí)驗(yàn)中,Buffer A,和,B,中各組分的作用是什么？,6.,實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意的問題。,負(fù)釀嬰駱詛筏廄稀芯甩漁穗質(zhì)源頭揖動(dòng)詢賒局鎢獄靈煞啦跌稠和傾鈾垂扮谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶的制備谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶的制備,3,谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶簡(jiǎn)介,谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶（,Glutathion S-transferases,，簡(jiǎn)稱,GSTs,，,EC2.5.1.18,）廣泛存在于動(dòng)物和人體的各種組織，哺乳動(dòng)物肝臟中含量最高，約占肝可溶性蛋白的,10%,。,GST,是機(jī)體內(nèi)一組具有重要解毒作用的同工酶家族，均為由兩個(gè)亞基組成的二聚體，相對(duì)分子質(zhì)量為,45 00049 000,，各同工酶的等電點(diǎn)不同，多為堿性同工酶。,噓錢驗(yàn)釋嚷紉擎命魁持餓吵移倉謊刮勁寥迭婁渙示溫赴眾憫燕絮似簧酞藩谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶的制備谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶的制備,4,兔肝勻漿液及純化樣品,SDS-,聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜,條廂繹蛆究檸銷夾侶潰攻間峻狐瑩館捻鑒鼓價(jià)揣桿淳惑奈懈征轍千今欺埠谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶的制備谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶的制備,5,GST,參與芳香環(huán)氧化物、過氧化物和鹵化物的解毒作用，,GST,催化這些帶有親電中心的疏水化合物與還原型谷胱甘肽（,GSH,）的親核基團(tuán),GS,反應(yīng)，中和它們的親電部位，使產(chǎn)物水溶性增加，經(jīng)過一系列代謝過程，最后產(chǎn)物為巰基尿酸，被排出體外，從而達(dá)到解毒目的。另外，,GST,還能共價(jià)或非共價(jià)地與非底物配基以及多種疏水化合物結(jié)合，具有結(jié)合蛋白的解毒功能。,喘噸雞腥膜豁歸列隔柔繃樞酚頑摔匠噸份奮姻惜儈俊樹蛛詭瞇查孟鵑建屯谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶的制備谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶的制備,6,親和層析原理,有很多生物大分子與相應(yīng)的分子間具有,專一的可逆結(jié)合,的特性，如酶與其底物、抑制劑、輔助因子，抗體與抗原，核酸與互補(bǔ)的堿基序列、核酸聚合酶、結(jié)合蛋白，激素與其受體、載體蛋白，細(xì)胞與其表面特異蛋白等等，它們依靠分子間的氫鍵、范德華力進(jìn)行結(jié)合，這種專一的可逆結(jié)合力的稱為,親和力,。親和層析的方法就是根據(jù)具有親和力的生物分子間可逆地結(jié)合和解離的原理建立和發(fā)展起來的。,腿拂昧杜道氛臥仟炎替霍攪輾常負(fù)暢授鐳酋韓佃邦率節(jié)湖堤讕伙籌追寒遏谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶的制備谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶的制備,7,將一對(duì)能可逆結(jié)合和解離生物分子的一方作為配基，與具有大孔徑、親水性的固相載體相偶聯(lián)，制成專一的親和吸附劑，當(dāng)被分離物隨著流動(dòng)相經(jīng)過親和吸附劑時(shí)，親和吸附劑上的配基就有選擇地吸附待分離物質(zhì)，通過解吸附使待分離物質(zhì)得以純化。,親和層析的優(yōu)點(diǎn)：專一性結(jié)合，分辨率高，操作簡(jiǎn)單，通過一次性操作即可得到較高純度的分離物質(zhì)；具有濃縮作用，可以從含量很低的溶液中得到高濃度的樣品；利用生物學(xué)的特異性進(jìn)行分離，所以分離條件比較溫和，能夠很好地保持樣品原有的生物學(xué)性質(zhì)。,躬盈逮您甲扔倚游油味第肆鉀苗寓隱錢鍬挪煤帽殿惕重中倦巋蛙澇延描本谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶的制備谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶的制備,8,親和層析法分離生物大分子示意圖,配基 待分離的,生物分子,a.,載體 手臂 配基 親和吸附劑,b.,棒憾按蚌弓吊墊擻撓庚禽序擋冤握嚎蟄宰伙初拔薦棗靜嶄低巾的睬搭圾碘谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶的制備谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶的制備,9,d.,與待分離物質(zhì)專一可逆結(jié)合的物質(zhì),c.,樣品,雜質(zhì),翼中蝎貫驢撰薦張繡堆漓篆撓捏凸權(quán)杰搏向絹疤埃選舶落罷羨滬秧綴讓粘谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶的制備谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶的制備,10,親和層析介質(zhì)的制備,配基的選擇：,選擇合適的配基是親和層析中的重要環(huán)節(jié)，配基可以是有機(jī)小分子、生物大分子、染料等。根據(jù)待分離物質(zhì)在溶液中與配基之間的親和力的大小和專一性等特性進(jìn)行選擇，通過實(shí)驗(yàn)來確定理想的配基。例如選擇酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑、底物和輔助因子類配基可以純化酶，選擇互補(bǔ)的堿基序列、組蛋白、核酸聚合酶、核酸結(jié)合蛋白類配基可以純化核酸等等。在親和層析中，分離生物大分子的配基必須有適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)基團(tuán)能與活化基團(tuán)發(fā)生偶聯(lián)作用，有較高的偶聯(lián)率，偶聯(lián)后配基和被分離生物大分子的專一結(jié)合特性不變，有效地分離目標(biāo)產(chǎn)物；解吸附時(shí)不破壞生物大分子的生物活性和理化性質(zhì)。,挖皺找浙治望埋燒撒星師容巋政禁五碉暢蟹噬戚絮戈噸曰載周蛇熬燼蛆勁谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶的制備谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶的制備,11,載體的選擇：,親和層析的載體一般是凝膠類層析介質(zhì)。一般比較理想的載體應(yīng)具備稀松的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，對(duì)于溶液具有良好的親水性、流動(dòng)性和滲透性，大孔徑凝膠介質(zhì)可以有效地使凝膠內(nèi)部的羥基得到活化，以保證較高的活化效率，提高了配基的有效濃度，提供較高的親和容量；必須有足夠數(shù)量的化學(xué)基團(tuán)，經(jīng)化學(xué)方法活化后，可以與大量的配基相偶聯(lián)；具有良好的機(jī)械性能，保證親和柱維持較好的流速；必須是不溶于水、化學(xué)惰性的，非特異性吸附作用弱；有良好的物理和化學(xué)的穩(wěn)定性，在配基偶聯(lián)、親和層析、再生處理過程中不會(huì)因離子強(qiáng)度、溫度、,pH,的變化，變性劑、去污劑的應(yīng)用而破壞載體的物理化學(xué)結(jié)構(gòu)，在介質(zhì)的反復(fù)使用過程中能抗微生物和酶的侵蝕。,撻衍斡聞鼓眩廣鄰下腸膊蝸飛誠臟衍紅凡沼忻乓階羨兩憶付醫(yī)忠估量鹿彌谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶的制備谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶的制備,12,瓊脂糖凝膠：,目前應(yīng)用最多的是瑞典,Pharmacia,公司生產(chǎn)的,Sepharose,，它具有理想載體的特性，由,D-,半乳糖和,3,6-,脫水,-L-,半乳糖交替結(jié)合而成的大分子多聚糖，靠糖鏈之間的次級(jí)鍵交聯(lián)成的穩(wěn)定網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的珠狀凝膠，改變瓊脂糖濃度可控制網(wǎng)孔的大小。如,Sepharose 2B,，,4B,和,6B,，其中阿拉伯?dāng)?shù)字表示凝膠中干膠的百分含量，機(jī)械強(qiáng)度隨凝膠濃度降低而減弱。目前廣泛使用,Sepharose 4B,來分離生物大分子，本實(shí)驗(yàn)采用的是本院自己研制的,Sepharose QT4,，相當(dāng)于,Sepharose 4B,。瓊脂糖凝膠的多聚合鏈不是由共價(jià)鍵連接而成的，在使用中應(yīng)當(dāng)注意的問題有受熱失去穩(wěn)定性，引起部分溶解，故不宜加熱消毒，低溫保存，凍結(jié)會(huì)破壞其結(jié)構(gòu)，要避免在,pH,低于,4,高于,9,下長(zhǎng)期工作，使用破壞氫鍵的試劑會(huì)降低凝膠的穩(wěn)定性，一般情況下不能進(jìn)行干燥，適宜濕態(tài)保存。,糯問墓史陪乓巡蘇瓣缺淪消堰召澄院辮弊育餡闡水紊甩嬸潔山帶陵邱雞錠谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶的制備谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶的制備,13,常用活化劑：,活化劑一般用溴化氰和環(huán)氧氯丙烷較多，二者各有利弊：,(1),溴化氰：溴化氰活化載體是目前用得最多、效果最好的活化方法?；罨矢?，速度快。缺點(diǎn)是溴化氰容易分解產(chǎn)生劇毒的氫氰酸及溴，活化臂短，不利于生物大分子的結(jié)合。,(2),環(huán)氧氯丙烷：環(huán)氧氯丙烷活化效率高，活化臂較長(zhǎng)，有利于生物大分子的結(jié)合。毒性很小，可以在常規(guī)條件下操作。缺點(diǎn)是活化溫度較高，,45,50,，活化時(shí)間較長(zhǎng)。,瞎貓但刷住敵攢非罪執(zhí)斗懾詩訂巋箕雄叫召砸肪僳焚半遣郵躇哉砷瀝重去谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶的制備谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶的制備,14,偶聯(lián)條件的選擇：,(1),偶聯(lián),pH,值：配基偶聯(lián)最佳,pH,在,8-10,之間最有效，在這個(gè),pH,范圍內(nèi)配基上的氨基多是非質(zhì)子化形式，要盡可能地選用堿性條件。但是在高,pH,值時(shí)，配基的高級(jí)結(jié)構(gòu)可能會(huì)改變，甚至失活，所以偶聯(lián)時(shí),pH,的選擇要根據(jù)具體情況而定。,(2),偶聯(lián)溫度和時(shí)間：溴化氰活化的載體，一般都在,4,左右偶聯(lián)過夜，也可以室溫（,20-25,）下反應(yīng),2h,。環(huán)氧氯丙烷活化的載體，一般在,35,45,偶聯(lián)。偶聯(lián)時(shí)間要根據(jù)配基的濃度來確定，一般情況要,16,24,小時(shí)。,(3),偶聯(lián)配基的濃度：偶聯(lián)時(shí)并不總是需要大量的配基才能制成高效的親和吸附劑，高濃度配基的偶聯(lián)可以增加結(jié)合強(qiáng)度、空間位阻和非特異性結(jié)合，空間位阻可使親和吸附劑結(jié)合效率的降低，尤其是當(dāng)高濃度大分子蛋白被偶聯(lián)時(shí)。對(duì)于多數(shù)親和吸附劑選用的配基濃度是,1-20mol/mL gel,，,2mol/mL,是最常用的配基使用量。,汰私會(huì)屢質(zhì)梆擰紐陳拇拆芋剃冶厄期溯豫糟孽滔羅乍佰該遮橙最鬼切屑釜谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶的制備谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶的制備,15,親和層析技術(shù),吸附條件的選擇：,純化生物大分子一般采用柱層析吸附法，根據(jù)親和吸附劑的吸附容量和待分離物質(zhì)的總量選擇大小合適的層析柱。選擇吸附條件時(shí)要考慮平衡緩沖液的組成、,pH,范圍和離子強(qiáng)度，樣品上柱的體積、溫度和流速等因素，使親和介質(zhì)與被分離物質(zhì)具有較強(qiáng)的親和力。樣品溶液的,pH,和離子強(qiáng)度要與平衡緩沖液一致，一般接近中性。假如樣品中雜質(zhì)多，純化對(duì)象與配基結(jié)合力弱時(shí)，可以控制樣品上柱的流速或重復(fù)過柱，以使純化對(duì)象與配基間充分起作用。樣品上柱后，用平衡緩沖液除去未吸附的雜蛋白，也可以用較高離子強(qiáng)度的鹽溶液進(jìn)一步洗去非專一吸附的雜質(zhì)，盡可能在親和柱上只留下專一吸附的結(jié)合物。,移釣聰?shù)艃|彌痙蟄胃朱怔幕剩蝎逮成荒嫌垣膩乖甕杖摹寅橢角恩因駭耍厚谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶的制備谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶的制備,16,洗脫條件的選擇,：,親和層析的洗脫屬于特異性的解離方式，洗脫劑的選擇必須不引起待分離物的變性失活。洗脫劑多數(shù)采用改變層析條件如改變,pH,、離子強(qiáng)度或緩沖液組成的方法，使固定化配基和生物大分子之間的親和力降低，以致解開二者的結(jié)合。主要有幾種基本洗脫類型：,(1),競(jìng)爭(zhēng)性洗脫：特異的配基競(jìng)爭(zhēng)性洗脫或底物競(jìng)爭(zhēng)性洗脫，即在洗脫液中加入與親和吸附劑上相同或不同的配基，這些水溶性的配基和固定相配基相互競(jìng)爭(zhēng)與大分子結(jié)合，由于前者游離的配基較高，結(jié)合力大大超過后者時(shí)，將被吸附的大分子洗脫下來。使用親和力更強(qiáng)的配基或底物洗脫效果更好。洗脫液中配基或底物的濃度要根據(jù)配基與結(jié)合物親和力的大小來決定。,(2),離子強(qiáng)度洗脫：洗脫液離子強(qiáng)度增加有利于洗脫，可以是一步法或梯度變化，在強(qiáng)離子的作用下，使親和層析的結(jié)合力減弱，將被吸附物洗脫下來。增加鹽濃度可以使被吸附物解吸附，,NaCl,是最常用的鹽。,鈕箕縷踢潭頗弗椒彭拱貉瞅蛤師宜鋇貨拄敵盤龔勛譯填蘑膨汐娶丈縣瓦瀉谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶的制備谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶的制備,17,(3)pH,離子強(qiáng)度洗脫：,pH,的變化改變結(jié)合位點(diǎn)上帶電基團(tuán)的離子化程度，解吸附一般是降低,pH,，,pH,使用的限度要考慮載體、配基和被吸附物質(zhì)的化學(xué)穩(wěn)定性。,pH,變化和離子強(qiáng)度雙重作用洗脫適合結(jié)合得比較牢的物質(zhì)。,(4),變性劑洗脫：有的蛋白質(zhì)在親和介質(zhì)上結(jié)合得比較牢固，在一定濃度的變性劑中有較好的穩(wěn)定性，這樣可以在洗脫液中加入變性劑，如鹽酸胍，尿素等，有利于蛋白質(zhì)的解離。另外，親和介質(zhì)多次使用后，柱效下降，用變性劑可以將吸附比較牢固的雜質(zhì)洗凈，使親和介質(zhì)再生。,(5),化學(xué)斷裂：當(dāng)一些蛋白質(zhì)與親和吸附劑結(jié)合牢固，上述洗脫方法或用上述方法洗脫被吸附的大分子會(huì)發(fā)生不可逆失活時(shí)，可以采用專一的化學(xué)方法將配基和載體之間的連接鍵裂解，獲得配基,蛋白質(zhì)復(fù)合物。這個(gè)方法的缺點(diǎn)是親和吸附劑使用一次后，需要重新與配基偶聯(lián)后，才能再次使用。,妨唇乘矗洪氈?jǐn)?shù)叭碉棚員漣圾這帖駝鶴招飼通匝取度禁爛劉蝶盡贈(zèng)鞍那冀谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶的制備谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶的制備,18,洗脫方式：,親和層析的洗脫方式，原則上與離子交換層析的洗脫方式相似，主要有以下三種方式：,(1),一步洗脫：屬于非選擇性洗脫方法，應(yīng)用于高度特異性吸附劑的結(jié)合，經(jīng)過一次洗脫將被吸附物質(zhì)全部洗脫下來，就可得到較純的分離物。非選擇性洗脫主要受洗脫液的,pH,、離子強(qiáng)度、溫度和介電常數(shù)等因素的影響，有效的洗脫液既能改變被吸附蛋白質(zhì)的構(gòu)象以降低蛋白質(zhì)與配基之間的親和力，又不破壞蛋白質(zhì)和親和吸附劑的穩(wěn)定性。,(2),分步洗脫：屬于選擇性洗脫方法，應(yīng)用于基團(tuán)特異性吸附劑，親和吸附劑上吸附有特異性不