,#,Hgskolan i Bors,Mohammad Taherzadeh,第九章,甾類激素的微生物轉(zhuǎn)化,第一節(jié) 概述,甾類激素,是指分子結(jié)構(gòu)中含有,環(huán)戊烷多氫菲核,的一類藥物。甾體化合物的基本結(jié)構(gòu)見圖,91,。,甾類激素根據(jù)其生理活性可分為,腎上腺皮質(zhì)激素,、,性激素,和,蛋白同化激素,三大類。,在醫(yī)學(xué)上應(yīng)用非常廣泛，用于,風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎,、控制炎癥、,哮喘病,、,皮膚病,、避孕、利尿等各方面的治療上，對(duì)機(jī)體起著非常重要的調(diào)節(jié)作用。,早期甾類激素藥物的生產(chǎn)主要靠化學(xué)合成。,脫氧膽酸-醋酸可的松,甾體激素類藥物生產(chǎn)新的途徑,微生物轉(zhuǎn)化,。,少根根霉,及,黑根霉,能使黃體酮轉(zhuǎn)化成11,-,羥基黃體酮,，,收率達(dá)85。,細(xì)菌,、,酵母,、,霉菌,和,放線菌,的某些種類都可能使甾類化合物的一定部位發(fā)生有價(jià)值的轉(zhuǎn)化反應(yīng)，微生物轉(zhuǎn)化已成為甾體工業(yè)中不可缺少的部分，在生產(chǎn)中常采用化學(xué)合成與微生物轉(zhuǎn)化相結(jié)合的辦法。,微生物轉(zhuǎn)化在生產(chǎn)工藝上有如下特點(diǎn),:,可減少化學(xué)合成步驟，簡(jiǎn)化生產(chǎn)流程，縮短生產(chǎn)路線。,能提高產(chǎn)物的收率和產(chǎn)品質(zhì)量，降低成本。,可進(jìn)行化學(xué)法難以實(shí)現(xiàn)的反應(yīng)。,微生物轉(zhuǎn)化避免和減少了強(qiáng)酸、強(qiáng)堿或化學(xué)有毒物質(zhì)，改善了生產(chǎn)環(huán)境。,第二節(jié) 微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)類型,對(duì)甾體激素藥物合成比較重要的主要有:,氧化反應(yīng):,其中氧化反應(yīng)又包括甾體骨架上的,羥基化,和,脫氫,(,生成雙鍵,)、,甾醇,氧化成,甾酮,、支鏈降解作用以及,D,環(huán)的切斷和,D,環(huán)開裂,形成內(nèi)酯環(huán),等。,還原反應(yīng),水解反應(yīng),一,、,羥化反應(yīng),通過(guò)微生物羥化酶能非常專一地選擇某個(gè)碳位置上將某空間位置上的,氫,取代氧化成原來(lái)空間構(gòu)型的,羥基,。,1,C,9,羥化,2,C,11,羥化,C,11,羥化是微生物轉(zhuǎn)化的,特有反應(yīng),，人體內(nèi)的,酶,也不能將甾體,C,11,羥化。,在,C,11,羥化菌株中，以,黑根霉,為最好,利用微生物轉(zhuǎn)化的方法實(shí)現(xiàn)、,C,11,、,C16,、,C,17,和,C,19,位的羥化反應(yīng)，這些也是制藥工業(yè)中很有價(jià)值的反應(yīng)。,二、環(huán)氧化反應(yīng),用微生物轉(zhuǎn)化法在甾體母核上引入環(huán)氧基團(tuán)的反應(yīng)。,三、脫氫反應(yīng),當(dāng)抗炎甾體激素等藥物的母核,C,1,、,C,2,位置導(dǎo)入,雙鍵,后，其抗炎作用會(huì),成倍,增加。,化學(xué)法,脫,C,1,、,C,2,氫是采用二氧化硒法，由于硒在生產(chǎn)中難以除盡會(huì)使產(chǎn)品中帶有少量對(duì)人體有害的物質(zhì)，所以采用,微生物轉(zhuǎn)化脫氫,是甾體抗炎激素藥物合成中不可缺少的一步。,微生物對(duì)甾體羥化與脫氫能力是相反的，,細(xì)菌,的脫氫能力比,真菌,大，特別以,棒狀桿菌,和,分枝桿菌,活力最大。球形芽孢桿菌、諾卡菌對(duì)可的松和皮質(zhì)醇也有較高的脫氫活力。,四、還原反應(yīng),微生物催化的還原反應(yīng)有各種,類型,：有的是甾類化合物上的醛或酮基被,還原,成伯醇或仲醇基；也有的是甾類核的,A,環(huán)或,B,環(huán)中的雙鍵被,加氫,還原成飽和鍵等。,五、水解反應(yīng),微生物進(jìn)行的水解反應(yīng)包括脫,酰化反應(yīng),、,環(huán)氧化,物的水解反應(yīng)等。,第三節(jié) 甾類激素的生產(chǎn)工藝過(guò)程,甾體的微生物轉(zhuǎn)化和一般的氨基酸、抗生素的生產(chǎn)不同，,發(fā)酵的產(chǎn)物,不是,目的產(chǎn)物,，而只是利用微生物的,酶,對(duì),甾體底物,的某一部位進(jìn)行特定的化學(xué)反應(yīng)來(lái)獲得一定的產(chǎn)物。,整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程，微生物的,生長(zhǎng),和甾體的,轉(zhuǎn)化,完全可以分開。,一般先進(jìn)行菌的培養(yǎng)，在菌生長(zhǎng)過(guò)程中累積甾體轉(zhuǎn)化所需要的酶，然后利用這些酶來(lái)改造分子的某一部位。,為了獲得較多的酶，首先需保證菌體的充分生長(zhǎng)，但,微生物的生長(zhǎng)與酶的生產(chǎn)條件不是完全一致的,。,一、甾類激素生產(chǎn)的原料,早期合成甾類激素的起始原料大多來(lái)自動(dòng)物的,膽甾醇,、,膽酸,等。因這些原料的來(lái)源少、含量低、成本高，不能滿足生產(chǎn)的需要。因而促使從植物中尋找起始原料并獲得成功。,已經(jīng),大量投產(chǎn)的甾類原料,：膽固醇、膽酸、薯蕷皂苷配基（穿龍薯蕷和盾葉薯蕷）、豆甾醇、澳洲茄堿等,。,二、甾類激素的微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)流程,甾體的微生物轉(zhuǎn)化通常分兩個(gè)階段：,第一階段是,生長(zhǎng)階段,；,第二階段是,轉(zhuǎn)化階段,大多數(shù),甾體化合物難溶于水,，通常是先把底物溶于,有機(jī)溶劑,，如丙酮、乙醇、甲醇，濃度在,2,時(shí)對(duì)微生物無(wú)毒性。或用表面活性劑,(,如吐溫,80),來(lái)提高基質(zhì)溶解度。,甾體氧化需要較大的,通氣量,，一般,1,：,0.8,(vvm),。,甾體加入的,速度,隨菌種轉(zhuǎn)化能力和基質(zhì)的性質(zhì)而定，一般濃度約,200,800mg,L,，采用,基質(zhì),的定期加入和連續(xù)加入的辦法來(lái)解決基質(zhì)或產(chǎn)物的,毒性,問(wèn)題。,轉(zhuǎn)化時(shí)間隨菌種而異，一般范圍在,12,72h,。,轉(zhuǎn)化后的產(chǎn)物大多不溶于水，所以采用,溶劑萃取法,進(jìn)行提取。,如果產(chǎn)物分泌在發(fā)酵液中，則發(fā)酵濾液采用離子交換樹脂吸附法吸附甾體化合物，洗脫后，減壓濃縮進(jìn)行結(jié)晶。,二、甾體微生物轉(zhuǎn)化方式,進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)可以利用不同形式的微生物細(xì)胞，如菌體培養(yǎng)物、靜止細(xì)胞懸液、孢子懸液、混合培養(yǎng)物、固定化細(xì)胞或固定化酶等。,靜態(tài)菌體懸液,優(yōu)點(diǎn)：,能自由地改變反應(yīng)液中的基質(zhì)和菌體量的比例，與生長(zhǎng)培養(yǎng)法相比一般能縮短反應(yīng)時(shí)間，在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)物中雜質(zhì)較少，分離提純比較容易等,。,混合培養(yǎng),混合培養(yǎng),進(jìn)行反應(yīng)是將具有,1,，,2,脫氫能力和,11,羥化能力的微生物并用進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)?？?省略抽提,操作。,第四節(jié) 氫化可的松的制備,氫化可的松又稱為皮質(zhì)醇。,化學(xué)名稱為,11,，,17a,，,21,一三羥基孕甾,-4,烯,-1,，,20-,二酮。其結(jié)構(gòu)式為：,氫化可的松為皮質(zhì)激素類藥物，具有,影響糖代謝,、,抗炎,、,抗毒,、,抗休克,及,抗過(guò)敏,等作用。主要用于腎上腺皮質(zhì)功能不足和自體免疫性疾?。粦?yīng)用于某些感染的綜合治療。,消化性潰瘍病,、,骨質(zhì)疏松癥,、,精神病,、,重癥高血壓,患者忌用，充血性心力衰竭、糖尿病、急性感染病慎用。由于氫化可的松療效確切，為重要的甾體激素類藥物之一，在國(guó)內(nèi)生產(chǎn)的激素類藥物中產(chǎn)量最大。,1,反應(yīng)原理,2,工藝過(guò)程,將犁頭霉菌接種到土豆斜面培養(yǎng)基，,28,培養(yǎng),7,9,天，成熟孢子用無(wú)菌生理鹽水制成孢子懸液后。種子培養(yǎng)基用,葡萄糖,、,玉米漿,、,硫酸銨,等配制，,pH,值為,5,8,6,3,，接入孢子懸液后，在通氣攪拌下,28,培養(yǎng),28,32h,。待培養(yǎng)液菌濃度達(dá)到,35,以上，無(wú)雜菌污染，即可轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐。,將玉米漿、酵母膏、硫酸銨、葡萄糖及水投入發(fā)酵罐中攪拌，用,NaOH,調(diào)整物料,pH,值到,5.7,6.3,，加入,O.03,豆油，滅菌溫度,120,，通入無(wú)菌空氣，降溫至,27,28,，接入犁頭霉孢子懸浮液，通氣攪拌發(fā)酵,28,32h,。,用,NaOH,調(diào),pH,值到,5.5,6.0,，投入發(fā)酵液體積,0.15,的,萊氏化合物,S,，氧化,48h,后，取樣做比色試驗(yàn)檢查反應(yīng)終點(diǎn)。,到達(dá)終點(diǎn)后濾除,菌絲,，濾液用,樹脂,吸附，然后用乙醇洗脫，洗脫液經(jīng)減壓濃縮至適量，冷卻到,0,10,，過(guò)濾、干燥得到粗品，收率,46,左右。,以上所得粗品中主要為,體，并混有部分,體，必須進(jìn)行分離精制。可以將粗品加入,16,18,倍含,8,甲醇,的二氯乙烷溶液中，,加熱回流,，趁熱過(guò)濾，濾液冷卻至,O,5,，,冷凍,、,結(jié)晶,、,過(guò)濾,、,干燥,得氫化可的松。,