單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級(jí),第三級(jí),第四級(jí),第五級(jí),*,*,單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級(jí),第三級(jí),第四級(jí),第五級(jí),*,*,1,本章主要內(nèi)容,第一節(jié) 衛(wèi)生微生物檢測(cè)的特點(diǎn)及基本原則,第二節(jié) 衛(wèi)生指示微生物,第三節(jié) 衛(wèi)生微生物研究和檢測(cè)的方法,第四節(jié) 衛(wèi)生微生物研究和檢測(cè)方法發(fā)展前景,2,第一節(jié),衛(wèi)生微生物學(xué)檢測(cè)的特點(diǎn)與基本原則,檢測(cè)特點(diǎn)：,檢測(cè)對(duì)象：致病、非致病、條件致病微生物,標(biāo)本來源：人體、環(huán)境,環(huán)境中致病微生物數(shù)量少，需要特異的檢測(cè)方法，并且多依靠衛(wèi)生指示微生物,檢測(cè)原則：,樣品的采集原則,樣品的運(yùn)送原則,實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)原則,3,一、樣品的采集原則,（一）樣品必須要有代表性,:,采樣量,：滿足檢測(cè)要求,采樣部位,：均勻采樣,采樣時(shí)間,：便于分析微生物的動(dòng)態(tài)變化,采樣批號(hào)：盡量檢測(cè)每個(gè)批號(hào),4,（二）避免對(duì)樣品的污染,器材滅菌、無菌操作,（三）避免對(duì)樣品中微生物的殺滅和抑制,避免有毒物質(zhì)的殘留和高溫影響,（四）對(duì)樣品進(jìn)行詳細(xì)的標(biāo)記,這是基本要求,（,1,）所有盛樣容器必須有和樣品一致的標(biāo)記。在標(biāo)記上應(yīng)記明產(chǎn)品標(biāo)志與號(hào)碼和樣品順序號(hào)以及其他需要說明的情況。標(biāo)記應(yīng)牢固，具防水性，字跡不會(huì)被擦掉或脫色。,（,2,）當(dāng)樣品需要托運(yùn)或由非專職抽樣人員運(yùn)送時(shí)，必須封識(shí)樣品容器。,5,二、樣品的運(yùn)送原則,盡快送檢,一般,3-4h,內(nèi)送檢，減少細(xì)菌死亡和進(jìn)一步繁殖帶來的影響。如不能及時(shí)運(yùn)送，應(yīng)根據(jù)樣品性質(zhì)采取常溫冷暗、,0-4,冰箱、,-15,以下冰箱或冷藏庫內(nèi)保存。,注意保護(hù)待檢的微生物,一定的溫度,加保護(hù)劑或去除不利因素,運(yùn)送培養(yǎng)基（,運(yùn)輸緩沖液）：,如病毒、厭氧菌等,6,根據(jù)生物安全規(guī)定，妥善包裝待運(yùn)輸?shù)臉?biāo)本,進(jìn)行完善的樣品交接,必須有樣品送檢單，與實(shí)驗(yàn)室人員逐項(xiàng)核對(duì)后交接,7,三、實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)原則,1.,具有相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)室硬件設(shè)施,WHO,對(duì)微生物危害性的,分級(jí),生物安全等級(jí)（,biosafety level,BSL,）,BSL-1,（,P1,實(shí)驗(yàn)室,）：檢驗(yàn)非致病微生物。,BSL-2,（,P2,實(shí)驗(yàn)室,）：檢驗(yàn)一般致病微生物。,BSL-3,（,P3,實(shí)驗(yàn)室,）：可檢驗(yàn)特殊危險(xiǎn)致病微生物。,BSL-4,（,P4,實(shí)驗(yàn)室,）：可檢驗(yàn)危害性最嚴(yán)重的病原體。,世衛(wèi)組織感染性微生物的危險(xiǎn)度等級(jí)分類,危險(xiǎn)度等級(jí)一級(jí),無或極低的個(gè)體和群體危險(xiǎn),不太可能引起人或動(dòng)物致病的微生物,危險(xiǎn)度等級(jí)二級(jí),個(gè)體危險(xiǎn)中等，群體危險(xiǎn)低,病原體能引起人或動(dòng)物的疾病，但不太可能對(duì)實(shí)驗(yàn)室工作人員、社區(qū)、牲畜或環(huán)境造成嚴(yán)重危害。,實(shí)驗(yàn)室暴露也許會(huì)引起嚴(yán)重感染，但是,對(duì)感染有有效的預(yù)防和治療措施,感染傳播的危險(xiǎn)有限,世衛(wèi)組織感染性微生物的危險(xiǎn)度等級(jí)分類,危險(xiǎn)度等級(jí)三級(jí),個(gè)體危險(xiǎn)高，群體危險(xiǎn)低,病原體通常能引起人或動(dòng)物的嚴(yán)重疾病，但一般不會(huì)發(fā)生感染個(gè)體向其他個(gè)體的傳播,對(duì)感染有有效的預(yù)防和治療措施,危險(xiǎn)度等級(jí)四級(jí),個(gè)體和群體的危險(xiǎn)均高,病原體通常能引起人或動(dòng)物的嚴(yán)重疾病，并且很容易發(fā)生個(gè)體之間的直接或間接傳播,一般沒有有效的預(yù)防和治療措施,BSL,-,1,不太可能引起人類疾病或獸醫(yī)學(xué)意義的無疾病,安全措施：參照標(biāo)準(zhǔn)微生物學(xué)安全操作（= 標(biāo)準(zhǔn)預(yù)防措施）。,預(yù)期的安全設(shè)備：不需要，所以也不需要生物安全柜,實(shí)驗(yàn)室設(shè)備要求：需要開放實(shí)驗(yàn)臺(tái)和水槽。,BSL,-,2,對(duì)群體中出現(xiàn)的中等危險(xiǎn)和人類疾病有關(guān)系的的微生物。,危險(xiǎn)性在于皮膚損傷、攝食、黏膜暴露。,這一防護(hù)級(jí)別代表的微生物為：金黃色葡萄球菌、沙門菌、輪狀病毒、甲型流感病毒、麻疹病毒等。,安全措施：參照一級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室操作，+,進(jìn)入受限,生物危害警告標(biāo)志,“銳器”防范措施,清除污染生物安全手冊(cè),預(yù)期的安全設(shè)備： 在操作產(chǎn)生噴濺或氣溶膠的感染微生物時(shí)，使用驗(yàn)收過的物理防護(hù)設(shè)備，如,I 級(jí)或II級(jí)生物安全柜,。,BSL,-,2,PPE （個(gè)體防護(hù)裝備） ：根據(jù)需要穿戴,實(shí)驗(yàn)室大褂、手套和面部保護(hù)用具。,實(shí)驗(yàn)室設(shè)備要求：需要開放實(shí)驗(yàn)臺(tái)、水槽和高壓滅菌器。,BSL,-,2,高壓滅菌器,洗眼器,BSL,-,2,對(duì)本地或外來的呼吸傳播微生物（氣溶膠）以及可能引起嚴(yán)重的或潛在致命感染的微生物。,這一防護(hù)級(jí)別代表的微生物為：結(jié)核,桿菌、炭疽桿菌、霍亂弧菌、高致病性禽流感病毒、黃熱病病毒、艾滋病病毒等。,重視環(huán)境和實(shí)驗(yàn)室人員的保護(hù)屏障。,BSL,-,3,安全措施：參照二級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室操作，+,進(jìn)入控制,全部廢棄物均清除污染,實(shí)驗(yàn)室服裝在洗熨前須清除污染,免疫血清基線,預(yù)期的安全設(shè)備： 對(duì)于所有開放性微生物操作使用I 級(jí)或II級(jí)生物安全柜。,BSL,-,3,PPE （個(gè)體防護(hù)裝備） ：根據(jù)需要穿戴,實(shí)驗(yàn)室大褂、手套和呼吸器。,實(shí)驗(yàn)室設(shè)備要求：二級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室要求,+,實(shí)驗(yàn)室與公共走廊通道在物理上分開,門自動(dòng)關(guān)閉，雙門入口,排出廢氣不可再循環(huán),實(shí)驗(yàn)室內(nèi)負(fù)壓,BSL,-,3,對(duì)于危險(xiǎn)的或外來的微生物，它們是危及生命的很高個(gè)體危險(xiǎn)，通過氣溶膠或未知傳播風(fēng)險(xiǎn)的微生物進(jìn)行傳播，而且目前尚無疫苗或治療。,這一防護(hù)級(jí)別代表的微生物為：,天花病毒、 埃博拉病毒。,危險(xiǎn)性在于呼吸暴露接觸到傳染性的氣溶膠、黏膜，或是暴露的損傷皮膚接觸到傳染唾沫。,BSL,-,4,安全措施：參照三級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室操作，,+,進(jìn)入前更換衣服,出口處淋浴,離開實(shí)驗(yàn)室時(shí)，全部物品都要清除污染,預(yù)期的安全設(shè)備： 全部操作程序均在,III級(jí)生物安全柜,內(nèi)進(jìn)行，,或者,穿正壓供氣的的連體防護(hù)服（,Hazmat 套服）并I級(jí)和II級(jí)生物安全柜。,BSL,-,4,實(shí)驗(yàn)室設(shè)備要求：三級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室要求,+,獨(dú)立的建筑或明確劃分出的隔離區(qū)域,專用進(jìn)排氣、真空和清除污染系統(tǒng),安全文件明確規(guī)定的其他附加要求,重點(diǎn)防止活性微生物污染環(huán)境,BSL,-,4,微生物危險(xiǎn)度等級(jí)與生物安全水平、操作和設(shè)備的關(guān)系,危險(xiǎn)度等級(jí),生物安全水平,實(shí)驗(yàn)室類型,實(shí)驗(yàn)室操作,安全設(shè)施,1,基礎(chǔ), 一級(jí)生物安全水平,基礎(chǔ)的教學(xué)、研究,GMT,不需要；開放實(shí)驗(yàn)臺(tái),2,基礎(chǔ), 二級(jí)生物安全水平,初級(jí)衛(wèi)生服務(wù)；診斷、研究,GMT +加防護(hù)服、生物危害標(biāo)志,開放實(shí)驗(yàn)臺(tái)，此外需,生物安全柜,用于防護(hù)可能生成的氣溶膠,GMT =,微生物學(xué)操作技術(shù)規(guī)范,微生物危險(xiǎn)度等級(jí)與生物安全水平、操作和設(shè)備的關(guān)系,危險(xiǎn)度等級(jí),生物安全水平,實(shí)驗(yàn)室類型,實(shí)驗(yàn)室操作,安全設(shè)施,3,防護(hù), 三級(jí)生物安全水平,特殊的診斷、研究,在二級(jí)生物安全防護(hù)水平上增加特殊防護(hù)服、進(jìn)入制度、定向氣流,生物安全柜和或其他所有實(shí)驗(yàn)室工作所需要的基本設(shè)備,4,最高防護(hù), 四級(jí)生物安全水平,危險(xiǎn)病原體,在三級(jí)生物安全防護(hù)水平上增加氣鎖入口、出口淋浴、污染物品的特殊處理,級(jí),生物安全柜,或級(jí),生物安全柜,并穿著正壓防護(hù)服、雙開高,壓滅菌器（穿過墻體）、經(jīng)過濾的空氣,23,2.,具有合格的人員和標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法,人員要有資質(zhì)，并經(jīng)常接受培訓(xùn),采用國家標(biāo)準(zhǔn)方法或公認(rèn)方法（,WHO,、,EPA,等）,3.,加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制,儀器、設(shè)備、試劑：定期檢定和校準(zhǔn),注意記錄和核查：如,GLP,實(shí)驗(yàn)室,報(bào)告規(guī)范：數(shù)據(jù)規(guī)范，完整簽名蓋章,三、實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)原則,4.,實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有應(yīng)急措施,應(yīng)對(duì)突發(fā)事件能力,需做多種檢驗(yàn)時(shí)，微生物優(yōu)先,恰當(dāng)?shù)臉悠诽幚砼c檢驗(yàn),24,三、實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)原則,25,第二節(jié)衛(wèi)生檢驗(yàn)中的指示微生物,指示微生物（,indicator microorganism,）,定義,：,在常規(guī)衛(wèi)生監(jiān)測(cè)中，用以指示檢品衛(wèi)生狀況及安全性的（非致病）微生物（或細(xì)菌）。,設(shè)定指示微生物的原因,微生物（包括致病和非致病的）種類繁多，不可能一一檢測(cè),環(huán)境中致病微生物往往數(shù)量少，檢測(cè)困難，需要用相對(duì)易于檢測(cè)的微生物來間接反映。,26,一、指示微生物的選擇,選擇原則,數(shù)量大、易于檢出，方法簡(jiǎn)單，有代表性。,指示微生物的種類：,反映微生物綜合污染,：細(xì)菌、霉菌和酵母菌落總數(shù),反映微生物污染來源,：糞便污染指示菌（大腸菌群、糞大腸菌群等）；空氣污染指示菌（溶血性鏈球菌等）,不得檢出的致病微生物,間接反映致病微生物,：如反映腸道病毒的噬菌體等,消毒效果指示菌：,嗜熱脂肪芽孢桿菌（壓力蒸汽滅菌）；短小芽孢桿菌（電離輻射滅菌）；枯草桿菌黑色變種芽孢（環(huán)氧乙烷滅菌）,27,二、,常用的指示微生物,（一）綜合污染指標(biāo),菌落總數(shù),定義：,單位量的被檢樣品,(g,、,ml,、,cm,2,、,m,3,),內(nèi)，所含有的能在某種培養(yǎng)基上經(jīng)一定條件、一定時(shí)間培養(yǎng)后生成的菌落數(shù)量。,表述：,細(xì)菌菌落總數(shù)、霉菌和酵母菌菌落總數(shù)。,cfu/g,、,cfu/ml,。,(cfu,，,colony forming unit),意義：,綜合判定檢樣被微生物污染程度。,方法：,標(biāo)準(zhǔn)平板計(jì)數(shù)法、表面涂布法,28,（二）來源污染指標(biāo),糞便、空氣污染指示菌,糞便污染指示菌的選擇標(biāo)準(zhǔn),是人及溫血?jiǎng)游锬c道正常菌群的組成部分，且數(shù)量大。,在糞便污染的樣品中易檢出，未被污染的樣品中無此菌存在。,排出體外后，在外環(huán)境存活時(shí)間與腸道致病菌大致相似或稍長。,在外環(huán)境中不繁殖。,如作為飲用水的指示菌，對(duì)氯、臭氧等抵抗力應(yīng)不低于腸道致病菌或略強(qiáng)。,檢驗(yàn)方法簡(jiǎn)便，易于檢出和計(jì)數(shù)。,29,常見糞便污染指示菌,1.,大腸菌群（,coliform group,）,概念：,指一群需氧的或兼性厭氧的，在,35-3724h,培養(yǎng)能分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的,G,-,無芽孢桿菌。,種類：,大腸埃希菌屬、枸櫞酸桿菌屬、腸桿菌屬、克雷伯菌屬、沙雷菌屬、變形桿菌屬某些種等。,衛(wèi)生學(xué)意義,評(píng)價(jià)檢樣衛(wèi)生質(zhì)量，推斷有無腸道致病菌污染。,總大腸菌群（,total coliform,）,37,培養(yǎng)生長的大腸菌群。,糞大腸菌群（,fecal coliform,）（耐熱大腸菌群）,44-45,能發(fā)酵乳糖的大腸菌群。,方法：,發(fā)酵法，濾膜法，紙片法,30,大腸菌群作為指示菌的一些新問題,大腸菌群,“,受損,”,對(duì)細(xì)菌計(jì)數(shù)的影響,大腸埃希菌的致病性,大腸菌群中某些細(xì)菌可以在外界繁殖,大腸菌群的檢測(cè)范圍有限,水中大腸菌群,> 200 cfu/100ml,小腸結(jié)腸炎耶爾森菌陽性率,6.4%,水中大腸菌群,< 200 cfu/100ml,小腸結(jié)腸炎耶爾森菌陽性率,8.9%,31,2,大腸埃希菌,(,Escherichae coli,),檢出意義最大,鑒定方法較復(fù)雜,藥品行業(yè)使用較多,近年應(yīng)用較多,作為糞便污染指示菌，大腸埃希菌檢出意義最大，其次是耐熱大腸菌群，總大腸菌群再次,32,3.,腸球菌,(,Enterococcus,),（糞鏈球菌,),人及動(dòng)物腸道正常菌群。在人糞數(shù)量僅次于大腸菌群細(xì)菌，動(dòng)物糞便中所占比例高。,對(duì)惡劣環(huán)境抵抗力較強(qiáng)，營養(yǎng)水體繁殖力低于大腸菌群。,單獨(dú)檢查不能作為糞便污染的決定性指標(biāo)，但可提供有價(jià)值的補(bǔ)充材料。,判斷污染來源。,方法：,耐熱大腸菌群與腸球菌之比,4.1,污染來源人,耐熱大腸菌群與腸球菌之比,0.7,污染來源動(dòng)物,耐熱大腸菌群與腸球菌之比,4.1,0.7,混合來源,33,4,產(chǎn)氣莢膜梭菌,(,Costirdia,),G,+,有芽孢，還原亞硫酸鹽的厭氧桿菌。,外界環(huán)境抵抗力較強(qiáng)。,不適合作為主要指標(biāo)，但可提供有價(jià)值的補(bǔ)充材料。,特別適合水樣不能及時(shí)送檢，或在含有有毒物質(zhì)（氯）的環(huán)境中檢測(cè)是否有過糞便污染。,產(chǎn)氣莢膜梭菌（） 大腸菌群（） 新近污染,產(chǎn)氣莢膜梭菌（） 大腸菌群（） 陳舊污染,34,常見空氣污染指示菌：,口腔和鼻腔的,鏈球菌,（無人居住的房屋空氣中沒,有鏈球菌，房屋內(nèi)住人越多，鏈球菌的含量亦越,高）。,一般用草綠色鏈球菌與溶血性鏈球菌合起,來計(jì)算。,35,（三）,不得檢出的致病菌,微生物,主要危害,主要指示作用,沙門菌,腸道致病菌,口服藥、食品不得檢出,志賀菌,菌痢,食品不得檢出,金葡菌,局部化膿、食物中毒,食品、化妝品、外用藥不得檢出；游泳池水指標(biāo)菌,銅綠假單胞菌,條件致病菌,外傷、眼科用藥、化妝品不得檢出，游泳池水指標(biāo)菌,破傷風(fēng)梭菌,外傷皮膚感染,外用藥不得檢出,36,（四）間接反映致病微生物存在的指示菌,腸道病毒指示微生物的條件：,檢驗(yàn)方法簡(jiǎn)單,操作安全,在被人腸道病毒污染的環(huán)境中一定存在，數(shù)量等于或大于腸道病毒的數(shù)目,對(duì)于消毒劑和外環(huán)境的抵抗力應(yīng)與腸道病毒一致或稍強(qiáng)。,37,腸道病毒的指示微生物,指示物,優(yōu)點(diǎn),缺點(diǎn),應(yīng)用,大腸桿菌噬菌體,f,2,與腸道病毒耐受性相似；存在于人糞中；檢測(cè)較簡(jiǎn)便,糞便中數(shù)量少；可能在環(huán)境中繁殖；檢測(cè)結(jié)果受大腸桿菌,DNA,噬菌體影響,水中病毒消毒效果評(píng)價(jià)指標(biāo),脊髓灰質(zhì)炎病毒減毒疫苗株,操作安全,非所有糞便有；檢測(cè)困難,應(yīng)用于消毒學(xué)和水中病毒研究,38,第三節(jié)衛(wèi)生微生物研究和檢測(cè)的方法,（一）樣品的處理,（二）損傷菌的復(fù)蘇,（三）選擇性增菌與分離,（四）定量計(jì)數(shù)方法,（五）分型鑒定的方法,（六）其他分子生物學(xué)方法,39,混勻樣品（非常重要）,液體：電動(dòng)混勻、手搖混勻、敲打混勻,固體：攪碎混勻、研磨混勻、勻漿混勻,樣品濃縮,沉淀法,過濾法,吸附沉淀法,一、樣品的處理,40,環(huán)境樣品微生物，在采樣送檢等過程中，受各種不利因素作用，可發(fā)生,亞致死性損傷,。用普通培養(yǎng)方法不容易培養(yǎng)。需預(yù)先進(jìn)行復(fù)蘇（,resuscitation,）或修復(fù)（,repair,）才能培養(yǎng)。,無選擇壓力的培養(yǎng)環(huán)境,較低的培養(yǎng)溫度,二、損傷菌的復(fù)蘇,41,檢測(cè)的困難：,微生物小、少、混合。,選擇方法：,抑制其它微生物生長、促進(jìn)目標(biāo)微生物生長,物理方法：,厭氧條件培養(yǎng)厭氧菌、光照條件培養(yǎng)藻類等,化學(xué)方法,：根據(jù)微生物的營養(yǎng)需求，加入特制的促進(jìn)或抑制生長的物質(zhì),三、,對(duì)目的菌的選擇性增菌與分離,42,四、微生物定量計(jì)數(shù)法,計(jì)數(shù),直接（顯微鏡直接計(jì)數(shù)、比濁法）,間接,（使菌繁殖）,傾注平板法,表面涂布法,MPN,法,“,單個(gè)菌,”,“,菌落,”,計(jì)數(shù),統(tǒng)計(jì)學(xué)方法,43,（一）,傾注平板法,10,倍梯度準(zhǔn)確稀釋待測(cè)樣品，準(zhǔn)確將稀釋物定量均勻地傾注到瓊脂培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后計(jì)數(shù)菌落。,（二）,表面涂布法,將樣品定量涂布在瓊脂培養(yǎng)基的表面，培養(yǎng)后，計(jì)數(shù)表面生長的菌落數(shù)。,44,（三）,最可能數(shù)法,MPN,法（最常用于大腸菌群計(jì)數(shù)）,MPN,（,most probable number,）計(jì)數(shù)是將待測(cè)樣品作一系列稀釋，一直稀釋到將少量（如,lm1,）的稀釋液接種到新鮮培養(yǎng)基中沒有或極少出現(xiàn)生長繁殖。根據(jù)沒有生長的最低稀釋度與出現(xiàn)生長的最高稀釋度，采用“最大或然數(shù)”理論，查表計(jì)算出樣品單位體積中細(xì)菌數(shù)的近似值。,