Hedgehog信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游轉(zhuǎn)錄因子Gli1在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤中對(duì)水通道蛋白AQP1調(diào)控作用的研究第二軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文Hedgehog號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游轉(zhuǎn)錄因子Gli1在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤中對(duì)水通道蛋白AQP倜控作用的研究姓名楊朝旭申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別博士專業(yè)生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師王紅陽(yáng)20090501在人膠質(zhì)瘤中對(duì)水通道蛋白調(diào)控作用的研究第一部分摘要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游轉(zhuǎn)錄因子在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤中對(duì)水通道蛋白調(diào)控作用的研究研究背景和目的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是在脊椎動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中起至關(guān)重要作用的一條信號(hào)通路其在胚胎早期可以通過(guò)通路各組分不同時(shí)間空間特異性表達(dá)對(duì)多種細(xì)胞的命運(yùn)決定產(chǎn)生影響并且可以與等信號(hào)通路產(chǎn)生相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)不同細(xì)胞定向分化的精細(xì)調(diào)節(jié)信號(hào)的調(diào)節(jié)紊亂在胚胎期會(huì)造成神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育障礙和畸形在已經(jīng)成熟的個(gè)體則會(huì)導(dǎo)致月中瘤的發(fā)生最初是在研究神經(jīng)膠質(zhì)瘤時(shí)發(fā)現(xiàn)并命名的一個(gè)基因其編碼的蛋白是信號(hào)途徑最重要的下游轉(zhuǎn)錄因子之一也是信號(hào)最終的響應(yīng)者和功能的執(zhí)行者信號(hào)通路在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中處于一種調(diào)節(jié)紊亂的異常激活狀態(tài)在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用其上游配體信號(hào)的存在對(duì)于膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)及月中瘤干細(xì)胞的自我更新能力的維持有著重要作用其下游轉(zhuǎn)錄因子可以通過(guò)調(diào)節(jié)的表達(dá)水平參與膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和凋亡同時(shí)也與膠質(zhì)瘤的惡性程度和惡性生物學(xué)行為的維持密切相關(guān)水通道蛋白是類分布在細(xì)胞膜表面能夠特異的對(duì)水分子進(jìn)行快速高效跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的小分子通道蛋白家族在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要分布的水通道蛋白是近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)與神經(jīng)系統(tǒng)的一些疾病尤其是月中瘤性疾病的進(jìn)展有著密切的關(guān)系在膠質(zhì)瘤細(xì)胞向周圍組織的侵襲生長(zhǎng)及瘤周組織的腦水月中形成方面都發(fā)揮了重要的作用雖然已經(jīng)有大量的研究闡明了是如何通過(guò)自身的通道結(jié)構(gòu)對(duì)水分子進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的但是對(duì)其本身表達(dá)水平的高低受何種機(jī)制的調(diào)控尤其是它與主要信號(hào)通路之間的關(guān)系仍然知之甚少第二軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文本研究擬從一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見(jiàn)的月中瘤神經(jīng)膠質(zhì)瘤入手研究通路的異常激活與水通道蛋白之間的關(guān)系旨在證明通路下游轉(zhuǎn)錄因子對(duì)的表達(dá)具有調(diào)控作用闡明這種調(diào)控是在何種水平以何種方式進(jìn)行并對(duì)這種調(diào)控作用對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為產(chǎn)生的影響進(jìn)行了初步探討實(shí)驗(yàn)方法用免疫組織化學(xué)免疫熒光共定位實(shí)驗(yàn)和等方法研究神經(jīng)膠質(zhì)瘤標(biāo)本中通路的激活情況以及的表達(dá)情況并對(duì)兩者之間的相關(guān)程度進(jìn)行分析構(gòu)建包含啟動(dòng)子區(qū)全長(zhǎng)的報(bào)告基因質(zhì)粒一將與報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)細(xì)胞熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)對(duì)激活程度的影響將過(guò)表達(dá)質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)細(xì)胞收獲不同時(shí)間點(diǎn)及不同轉(zhuǎn)入劑量的樣品觀察轉(zhuǎn)錄水平觀察蛋白水平的表達(dá)變化設(shè)計(jì)合成基因特異的干擾片段構(gòu)建干擾載體體外驗(yàn)證有效后研究干擾掉后對(duì)報(bào)告基因活性及膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中表達(dá)的影響建立分別穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空載體過(guò)表達(dá)及穩(wěn)定干擾的三種神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系一方法檢測(cè)三種細(xì)胞系中表達(dá)水平的變化將報(bào)告質(zhì)粒轉(zhuǎn)入三種不同的穩(wěn)定細(xì)胞系中檢測(cè)轉(zhuǎn)錄活性的變化分析啟動(dòng)子區(qū)根據(jù)的核心結(jié)合序列設(shè)計(jì)引物運(yùn)用染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)研究與啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合情況根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果利用重疊延伸技術(shù)構(gòu)建啟動(dòng)子區(qū)突變報(bào)告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)入相應(yīng)的穩(wěn)定細(xì)胞系中利用報(bào)告基因檢測(cè)確定在對(duì)調(diào)控中起關(guān)鍵作用的啟動(dòng)子區(qū)段位置闡明調(diào)控作用的機(jī)帶在人膠質(zhì)瘤中對(duì)水通道蛋白調(diào)控作用的研究利用和實(shí)驗(yàn)比較不同細(xì)胞系侵襲能力的差異評(píng)價(jià)在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中調(diào)控表達(dá)所引起的生物學(xué)功能變化實(shí)驗(yàn)結(jié)果神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本中和的表達(dá)與對(duì)照正常組織相比都呈現(xiàn)出異常高表達(dá)的狀態(tài)并且兩者之間的高表達(dá)具有特異的相關(guān)性外源瞬時(shí)轉(zhuǎn)入及穩(wěn)定表達(dá)都可以在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上調(diào)的表達(dá)并能顯著增強(qiáng)含有啟動(dòng)子區(qū)全長(zhǎng)的報(bào)告基因的活性特異性干擾的表達(dá)則可以降低的表達(dá)并抑制的報(bào)告基因活性可以和啟動(dòng)子區(qū)中的保守調(diào)節(jié)序列相結(jié)合其中啟動(dòng)子區(qū)位的保守結(jié)合序列對(duì)維持的調(diào)節(jié)作用至關(guān)重要表達(dá)水平不同的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系表現(xiàn)出不同的侵襲轉(zhuǎn)移能力在侵襲能力較低的細(xì)胞系中外源性轉(zhuǎn)入可以使其侵襲能力得到恢復(fù)提高提示神經(jīng)膠質(zhì)瘤中可能通過(guò)上調(diào)的表達(dá)來(lái)增強(qiáng)月中瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)特性結(jié)論本研究首次發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)膠質(zhì)瘤中通路異?；罨c異常高表達(dá)兩種現(xiàn)象之間的關(guān)系并且證實(shí)通路下游轉(zhuǎn)錄因子可以通過(guò)與啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平對(duì)其表達(dá)進(jìn)行調(diào)控其中啟動(dòng)子區(qū)段的序列在這一調(diào)控作用中發(fā)揮重要作用在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中這一調(diào)控作用的生物學(xué)意義是可以通過(guò)上調(diào)來(lái)增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的惡性侵襲能力關(guān)鍵詞信號(hào)通路神經(jīng)膠質(zhì)瘤轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)在人膠質(zhì)瘤中對(duì)水通道蛋白調(diào)控作用的研究第二部分摘要基于結(jié)構(gòu)修飾的靶向通路小分子抑制劑的篩選研究研究背景和目的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路通路是一條高度保守的在生物的胚胎發(fā)育及多種疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用的信號(hào)通路近年來(lái)的研究表明在種人類惡性月中瘤性疾病中如腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤基底細(xì)胞癌胰腺癌非小細(xì)胞肺癌前列腺癌等該通路都呈現(xiàn)出異常的活化狀念并且對(duì)月中瘤的發(fā)生及發(fā)生后 月中瘤組織的生長(zhǎng)和惡性生物學(xué)特性的維持起著重要作用人們?cè)谘芯客放c 月中瘤之間關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)特異性抑制通路可以抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖以及向 其他器管侵襲轉(zhuǎn)移的能力因此信號(hào)通路被認(rèn)為是一條比較理想的可以作為月中瘤靶向治療的信號(hào)途徑針對(duì)通路的小分子抑制劑的開(kāi)發(fā)及研究 工作方興未艾逐漸成為國(guó)際研究的熱點(diǎn)介芬胺是從藜產(chǎn)屬植物中提取的一種小分子天然產(chǎn)物在化學(xué)結(jié)構(gòu)上屬于一種箔體類生物堿可以與通路上游激活因子特異性結(jié)合而抑制該通路信號(hào)的傳遞進(jìn)而發(fā)揮抑制月中瘤細(xì)胞的增殖的效應(yīng)是一種有潛在臨床應(yīng)用價(jià)值的小分子抑制劑但是作為一種天然產(chǎn)物其抑制通路活性的作用并不是很強(qiáng)且具有較大的化學(xué)毒性這一缺陷限制和延緩了 其作為一種新型抗腫瘤藥物的研發(fā)與應(yīng)用本研究擬以為先導(dǎo)化合物通過(guò)結(jié)構(gòu)修飾和改造的方法制備系列目標(biāo)衍生物然后對(duì)制備的衍生物進(jìn)行抑制通路的特異性篩選及抗月中瘤活性篩 選并與已有的通路抑制劑的活性進(jìn)行比較最終期望獲得兩個(gè)高效低毒高特異性的通路抑制劑并對(duì)結(jié)構(gòu)修飾規(guī)律作出總結(jié)為新型抗月中瘤藥物的研發(fā)提供基礎(chǔ)第二軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文實(shí)驗(yàn)方法結(jié)構(gòu)修飾衍生物的獲得以為底物分別經(jīng)醴化燒化酰化甲基化氯代等特異性化學(xué)修飾得到一系列衍生化合物衍生物高通量篩選平臺(tái)的構(gòu)建在通路組成性激活的細(xì)胞系中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染可以反應(yīng)通路激活程度的報(bào)告基因?qū)⒃摷?xì)胞系命名為并對(duì)該細(xì)胞系反映通路激活程度的敏感性進(jìn)行鑒定初次篩選以步驟中構(gòu)建的穩(wěn)定細(xì)胞系為篩選工具將步驟中得到的衍生物以濃度作用于體外培養(yǎng)的后測(cè)定報(bào)告基因數(shù)值觀察各化合物對(duì)通路的抑制效應(yīng)得到可以相對(duì)特異性抑制通路活性的化合物二次篩選細(xì)胞活性檢測(cè)再次篩選步驟中得到的化合物對(duì)體外培養(yǎng)的的細(xì)胞毒性排除初篩過(guò)程中報(bào)告基因數(shù)值的降低是由于化合物本身的毒性導(dǎo)致細(xì)胞死亡所致得到對(duì)細(xì)胞增殖抑制不明顯但可以顯著抑制報(bào)告基因活性的毒性低特異性好的衍生物及檢測(cè)步驟中得到的化合物對(duì)細(xì)胞中通路下游轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的抑制作用進(jìn)一步驗(yàn)證化合物的特異性法檢測(cè)經(jīng)二次篩選得到的衍生物在體外對(duì)月中瘤細(xì)胞的增殖抑制作用裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)將得到的化合物以不同劑量灌胃給藥觀察其對(duì)體內(nèi)月中瘤的生長(zhǎng)抑制作用最終得到具有較高的抗月中瘤活性低毒高效的通路抑制劑實(shí)驗(yàn)結(jié)果以為先導(dǎo)化合物進(jìn)行化學(xué)修飾和改造分離純化后共得到個(gè)衍生物報(bào)告基因法初篩檢測(cè)修飾后的化合物對(duì)通路的相對(duì)抑制作用與陽(yáng)性對(duì)照藥物環(huán)杷明相比較共有個(gè)化合物顯示出與其類似或更佳的抑制作用用法再次檢測(cè)初篩得到的化合物對(duì)體外培養(yǎng)細(xì)胞的增殖活性的影響剔除細(xì)胞毒性較大的衍生物再次篩選后得到個(gè)毒性較低特異性較好的化合物分別為號(hào)化合物號(hào)化合物在人膠質(zhì)瘤中對(duì)水通道蛋白調(diào)控作用的研究號(hào)化合物號(hào)化合物及結(jié)果顯示經(jīng)兩次篩選后得到的個(gè)化合物可以有效降低通路下游轉(zhuǎn)錄因子的及蛋白表達(dá)水平提示其具有良好的特異性抑制通路活性的作用在體外月中瘤細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)中篩選到的化合物顯示出選擇性抑制通路依賴的月中瘤細(xì)胞的特性裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)中四種化合物均表現(xiàn)出較好的抑制月中瘤生長(zhǎng)的作用其對(duì)體內(nèi)月中瘤生長(zhǎng)的抑制效率如下號(hào)化合物為號(hào)化合物為號(hào)化合物為號(hào)化合物為其中統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果表明號(hào)化合物對(duì)月中瘤生長(zhǎng)的抑制作用要優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照化合物環(huán)杷明結(jié)論本研究以為先導(dǎo)化合物首先經(jīng)特異性結(jié)構(gòu)修飾改造得到一系列衍生物然后對(duì)衍生物在抑制通路的特異性體內(nèi)外毒性抗腫瘤活性等方面的特性進(jìn)行連續(xù)篩選最終得到四個(gè)特異性較好毒性較低抗月中瘤活性較強(qiáng)的陽(yáng)性化合物其中有三個(gè)化合物在上述特性上與陽(yáng)性對(duì)環(huán)杷明類似一個(gè)化合物要優(yōu)于壞杷明對(duì)所得陽(yáng)性化合物的結(jié)構(gòu)改造位點(diǎn)與先導(dǎo)化合的結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較分析可以得出以下規(guī)律氧化能夠增強(qiáng)化合物的特異性及抗月中瘤活性但不明顯對(duì)化合物毒性影響亦不顯著化合物的毒性針對(duì)通路的特異性以及抗月中瘤活性主要與與結(jié)構(gòu)中哌噬環(huán)的密切相關(guān)對(duì)哌噬環(huán)的進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾是發(fā)現(xiàn)高效低毒衍生物的重要方向結(jié)構(gòu)修飾關(guān)鍵詞介芬胺通路小分子抑制劑第二軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文第二軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文一英文縮略詞表英文全稱中文全稱縮寫牛血清白蛋白染色質(zhì)免疫沉淀環(huán)杷明焦碳酸二乙酯改培養(yǎng)基二甲基亞碉 乙二胺四乙酸胎牛血清多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤綠色熒光蛋白免疫組化聚合酶鏈反應(yīng)干擾逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的學(xué)位論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過(guò)的研究成果與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說(shuō)明并表示謝意本人承擔(dān)本聲明的法律責(zé)任吼學(xué)位論文作者簽名才詢她鈣月白學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)聲明本人完全了解第二軍醫(yī)大學(xué)有關(guān)保留使用學(xué)位論文的規(guī)定第二軍醫(yī)大學(xué)有權(quán)保留并向國(guó)家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版允許論文被查閱和借閱本人授權(quán)第二軍醫(yī)大學(xué)可以將學(xué)位論文全文或部分內(nèi)容編入中國(guó)學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 中國(guó)優(yōu)秀博碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù)等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索可以采用影印縮印或掃描等復(fù)制手段保存匯編學(xué)位論文保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)書(shū)導(dǎo)師簽名學(xué)位論文作者虢鋤拙喀碧，日期年曩月 >> 日 魄叼年鄉(xiāng)月日 在人膠質(zhì)瘤中對(duì)水通道蛋白調(diào)控作用的研究 第一部分通路下游轉(zhuǎn)錄因子在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤中對(duì)水 通道蛋白調(diào)控作用的研究神經(jīng)系統(tǒng)是人體最精細(xì)結(jié)構(gòu)和功能最復(fù)雜的系統(tǒng)由數(shù)以億萬(wàn)計(jì)的高度相 互聯(lián)系的神經(jīng)細(xì)胞組成由于神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育不良及后天的病變導(dǎo)致的各種神經(jīng)性 疾病尤其是月中瘤性病變已經(jīng)成為危害人類的主要疾病之一膠質(zhì)細(xì)胞瘤 也稱神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤起源于神經(jīng)外胚葉組織是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最為常見(jiàn)的原性月中瘤在人類對(duì)抗和干預(yù)膠質(zhì)細(xì)胞瘤的歷史中雖然已形成了一整套以手術(shù)中心輔以放療和化療等多種措施的綜合治療方案但是由于膠質(zhì)細(xì)胞瘤生長(zhǎng) 迅速無(wú)邊界浸潤(rùn)易于復(fù)發(fā)等特性其治療預(yù)后仍不盡理想據(jù)統(tǒng)計(jì)膠質(zhì)細(xì) 胞瘤在神經(jīng)上皮組織月中瘤中約占約占顱內(nèi)月中瘤的而神經(jīng)膠質(zhì) 細(xì)胞瘤患者的平均生存期仍少于年因此加強(qiáng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤致病機(jī)理及發(fā)生 發(fā)展的基礎(chǔ)科學(xué)研究為臨床治療提供新的思路和治療途徑對(duì)于從根本上提本病的治療效果有著重要意義信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是在脊椎動(dòng)物胚胎期神 經(jīng)發(fā)育和分化中起著至關(guān)重要的作用的一條信號(hào)通路參與脊椎動(dòng)物神經(jīng)發(fā)中細(xì)胞命運(yùn)和胚胎范型的決定在早期途徑可以通過(guò)不同時(shí)空的特異表達(dá)決定神經(jīng)管中來(lái)自腹部區(qū)域的細(xì)胞發(fā)育為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元而來(lái)自背區(qū)的細(xì)胞 則發(fā)育為感覺(jué)神經(jīng)元在后期該通路可以通過(guò)與其他一些信號(hào)因子的協(xié)同作用如等對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞的精細(xì)分化進(jìn)行調(diào)節(jié)在與神經(jīng)系統(tǒng)的疾病聯(lián)系方面在未成熟的個(gè)體途徑配體的突變將會(huì)導(dǎo)致一種叫做前腦無(wú)裂畸形的發(fā)育缺陷性疾病對(duì)面部和神經(jīng)系統(tǒng)的中線產(chǎn)生影響在成熟的個(gè) 體途徑的過(guò)度激活是多種神經(jīng)系統(tǒng)月中瘤發(fā)生及惡性生物學(xué)行為維持的重要 原因其中包括神經(jīng)膠質(zhì)瘤蛋白家族是通路下游具有鋅指結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子也是途徑在受到外界信號(hào)刺激后做出對(duì)一系列靶基因進(jìn)行調(diào)節(jié)這一反應(yīng)功能的最終執(zhí)行者該蛋白家族中既有激活因子也包括抑制因子而是通路下游末端重要的轉(zhuǎn)錄激活因子其表達(dá)水平的高低是通路激活程度的標(biāo)志基因由在年發(fā)現(xiàn)由于其在腦膠第二軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué) 位論文質(zhì)瘤中較正常對(duì)照組織擴(kuò)增高出大約倍而得名通路在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用參與調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)膠質(zhì)瘤月中瘤干細(xì)胞的 自我更新的維持并與其成瘤能力關(guān)系密切水通道蛋白是分布在生物膜表面能夠?qū)λ肿舆M(jìn)行高效特異的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的一類通道蛋白家族最初在年由等人對(duì)紅細(xì)胞膜分離純化多肽時(shí)發(fā)現(xiàn)隨后的研究證明了其特異轉(zhuǎn)運(yùn)水分子的功能并將其命名為的發(fā)現(xiàn)更新了人們長(zhǎng)期以來(lái)的水跨生物膜的移動(dòng)儀靠單純擴(kuò)散的觀念使人們一些生理病理的過(guò)程及機(jī)制有了更加 合理和深刻的認(rèn)識(shí)迄今為止已經(jīng)在哺乳動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了種水通道蛋白在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要分布的是在下常生理?xiàng)l件下在人主要表達(dá)于腦脈絡(luò)膜上皮微絨毛的頂膜與酶共同定位于該組織在腦脊液產(chǎn)生過(guò)程中具有重要作用并參與調(diào)節(jié)水和離子平衡在發(fā)育過(guò)程 中從妊娠個(gè)月胎兒的腦組織中兀始檢測(cè)出隨后其表達(dá)部位和量隨月齡增大而相應(yīng)變化可能與胎兒腦內(nèi)水平衡的調(diào)節(jié)有關(guān)在腦的發(fā)育中起重要 作用在正常腦組織中的表達(dá)水平很低在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中主要表達(dá)于微血管內(nèi)皮細(xì)胞和瘤性星形細(xì)胞在轉(zhuǎn)移瘤的微血管內(nèi)皮細(xì)胞和反應(yīng)性 星形細(xì)胞中表達(dá)主要在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮作用由于膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)環(huán)境是在結(jié)構(gòu)致密空問(wèn)局限的中樞神經(jīng)系統(tǒng)所以其向周圍組織的 浸潤(rùn)性生長(zhǎng)主要依靠其通過(guò)變形運(yùn)動(dòng)插入到神經(jīng)元周圍的空隙中來(lái)實(shí)現(xiàn)引表達(dá) 水平高的膠質(zhì)瘤細(xì)胞在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出更強(qiáng)的侵襲轉(zhuǎn)移特性因?yàn)榇?類細(xì)胞具有更強(qiáng)的變形運(yùn)動(dòng)能力更有利于向周圍組織擴(kuò)散性增殖此外還與腦膠質(zhì)瘤旁的月中瘤周圍組織水月中的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系盡管 在腦脊液分泌大腦內(nèi)水平衡的調(diào)節(jié)以及膠質(zhì)瘤的發(fā)展中起著重要作用并且人們對(duì)于其自身的通道結(jié)構(gòu)已經(jīng)有了清楚的了解但是對(duì)于其表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī) 制仍不清楚尤其是其與主要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之間的關(guān)系目自訂仍然研究的很少在 人膠質(zhì)瘤中對(duì)水通道蛋白調(diào)控作用的研究信號(hào)通路與在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育及正常功能的維持中都起著重要的作用在中樞神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展中兩者也都各自體 現(xiàn)出重要的影響但是對(duì)兩者之間關(guān)系的研究目前尚未見(jiàn)報(bào)道本課題從神經(jīng)膠質(zhì) 瘤組織標(biāo)本入手首先分析了兩者之問(wèn)的表達(dá)的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)了與在膠質(zhì)細(xì)胞瘤中伴隨性高表達(dá)這一現(xiàn)象然后通過(guò)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)通路通過(guò)其下游轉(zhuǎn)錄因子對(duì)進(jìn)行調(diào)控的可能性及機(jī)制進(jìn)行研究最后對(duì)這種調(diào)控作用對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)功能的影響進(jìn)行了初步探討第二軍醫(yī)大學(xué)博 士學(xué)位論文材料和方法一材料主要化學(xué)和生物試劑普通試劑瓊脂糖瓊旨公司十二烷基肌酸鈉公司蛋白陳及酵母提取物公司冰乙酸上海試劑一廠甲醇上海試劑一廠無(wú)水乙醇上海試劑一廠堿公司各種限制性內(nèi)切酶酶連接酶公司公司濾紙公司公司硝酸纖維素膜膜公司等特殊試劑及試劑盒公司檢測(cè)系統(tǒng)公司產(chǎn)物純化試劑盒膠回收試劑盒為上海賽百盛基因技術(shù)有限公司產(chǎn)品各種寡核甘酸鏈引物使用相關(guān)軟件自行設(shè)計(jì)均由上海生工生物工程有限公司合成測(cè)序工作送交英駿生物技術(shù)有限公司完成熒光素酶定量檢測(cè)試劑盒為公司產(chǎn)品細(xì)胞核染色試劑購(gòu)自公司澳化乙錠為轉(zhuǎn)染公司產(chǎn)品質(zhì)粒純化試劑盒公司試劑公司蛋白定量試劑盒公司細(xì)胞活力分析試劑一購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)板購(gòu)自公司細(xì)胞外基質(zhì)試劑購(gòu)自公司載體菌株和抗體購(gòu)自載體真核表達(dá)載體質(zhì)粒為本為公司產(chǎn)品實(shí)驗(yàn)室所有宿主菌和均由合作單位德國(guó)馬普生化所提供公司單抗購(gòu)自抗體抗抗體抗抗體購(gòu)自康成生物有限公司羊抗兔及羊抗小鼠二抗購(gòu)自華舜公司熒光二抗購(gòu)自公司質(zhì)粒真核表達(dá)質(zhì)粒由謝經(jīng)武教授惠贈(zèng)在人膠質(zhì)瘤中對(duì)水通道蛋白調(diào)控作用的研究一表達(dá)質(zhì)粒干擾質(zhì)粒報(bào)告基因質(zhì)粒質(zhì)粒均由本室構(gòu)建細(xì)胞及培養(yǎng)用主要試劑及制備方法人胚腎上皮細(xì)胞人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞購(gòu)自中科院細(xì)胞庫(kù)液體培養(yǎng)基取培養(yǎng)基于粉公司包加入碳酸氫鈉完全培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基添加胎牛血清三抗三抗青霉素鏈霉素慶大霉素配成后的除菌濾膜過(guò)濾保存?zhèn)溆锰ヅＱ遒?gòu)自公司胰蛋白酶購(gòu)自公司細(xì)胞凍存液液體培養(yǎng)基二甲基亞碉主要緩沖液裂解液臨用前加入X凝膠加樣緩沖液澳酚藍(lán)甘油嘶在去離子水中溶解堿和甘氨酸然后加入的電泳級(jí)儲(chǔ)存液用離子水補(bǔ)至則成儲(chǔ)存液室溫密閉保存蛋白轉(zhuǎn)移緩沖液甘氨酸堿甲醇麗春紅三氯醋酸磺基水楊酸第二軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文封閉液脫脂奶粉溶解緩沖液的配制稱取堿加入去離子水磁力攪拌下完全溶解用約濃鹽酸調(diào)節(jié)值至去離子水定容至室溫保存?zhèn)溆脡A加入去離子水磁力攪拌下完全溶解稱取用約室濃鹽酸調(diào)節(jié)值至去離子水定容至溫保存?zhèn)溆梅Q取加入去離子水磁力攪拌下完全溶解用約濃鹽酸調(diào)節(jié)值至去離子水定容至室溫保存?zhèn)溆眉尤肴ルx子水磁力攪拌下完全溶稱取解用約濃鹽酸調(diào)節(jié)值至去離子水定容至室溫保存?zhèn)溆锰幱美淼娜ルx子水充分溶解加數(shù)滴濃調(diào)節(jié)值至并將體積調(diào)節(jié)至保存在的條件下溶解于去離了十二烷基磺酸鈉水中加數(shù)滴濃鹽酸調(diào)節(jié)值至冷卻后去離子水定容至室溫保存主要儀器和設(shè)備儀型紫外分光光度計(jì)型一超低溫冰箱型機(jī)型在人膠質(zhì)瘤中對(duì)水通道蛋白調(diào)控作用的研究各種離心機(jī)型型型轉(zhuǎn)膜儀恒溫水浴振蕩器型哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司恒溫水浴箱一型上海天平儀器廠超凈工作臺(tái)蘇州凈化設(shè)備公司凝膠成像系統(tǒng)上海四星生物技術(shù)公司免疫組化石蠟包埋機(jī)公司免疫組化制片儀公司免疫組化冰凍切片儀公司熒光實(shí)時(shí)定量?jī)x公司熒光素酶檢測(cè)儀器紫外透射反射分析儀型上海長(zhǎng)明光學(xué)電子儀器廠顯微鏡熒光顯微鏡電泳儀型型制冰機(jī)公司三二研究方法針咒萬(wàn)法標(biāo)本來(lái)源及處理人神經(jīng)膠質(zhì)瘤石蠟包埋組織標(biāo)本來(lái)例源于年月至年月在長(zhǎng)海醫(yī)院神經(jīng)外科手術(shù)切除的患者經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診其中分級(jí)IV級(jí)例其余均為IV級(jí)下常對(duì)照兩例于正常腦組織內(nèi)減壓術(shù)中獲得冰凍組織標(biāo)本例其中分級(jí)級(jí)例II級(jí)例IV級(jí)例IV級(jí)例正常對(duì)照組織例免疫組織化學(xué)石蠟切片烤箱過(guò)夜切片脫臘至水二甲苯一二甲苯一二甲苯一乙醇第二軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文乙醇一乙醇一乙醇一雙蒸水甲醇液室溫放置X雙蒸水洗抗原修復(fù)切片放入檸檬酸鹽緩沖液中煮沸停火再煮沸自然冷卻至室溫雙蒸水沈封閉c甩去封閉液不洗直接加一抗置入濕盒中然后冰箱過(guò)夜時(shí)C取出室溫復(fù)溫 x然后洗滴抗C沈x顯色鏡下觀察雙蒸水終止顯色蘇木素復(fù)染秒分化后自來(lái)水返藍(lán)蒸儲(chǔ)水浸泡脫水透明蓋玻片覆蓋顯微鏡下觀察陽(yáng)性染色在人膠質(zhì)瘤中對(duì)水通道蛋白調(diào)控作用的研究免疫印記取等量神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織液氮中磨碎加入裂解緩沖液冰浴超聲破碎細(xì)胞置恒溫離心機(jī)內(nèi)離取上清蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量取出所需量蛋白加入加樣緩沖液變性變性樣品進(jìn)行蛋白電泳通過(guò)電轉(zhuǎn)儀將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜公司脫脂奶粉封閉洗三次每次稀釋一抗孵育洗三次每次脫脂奶粉稀釋二抗孵育洗三次每次化學(xué)發(fā)光法顯影細(xì)胞培養(yǎng)胚腎上皮細(xì)胞入神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞細(xì)胞用培養(yǎng)置孵箱中培養(yǎng)保持飽和濕度消化取待傳代細(xì)胞培養(yǎng)瓶皿輕棄培養(yǎng)基預(yù)溫少許輕洗一遍棄去加少許胰酶室溫放置數(shù)分鐘至瓶壁出現(xiàn)針孔樣棄去胰酶加少量新鮮培養(yǎng)基終止消化輕輕吹打待成單個(gè)細(xì)胞后傳代凍存生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期細(xì)胞約X胰酶消化數(shù)分鐘用完全培養(yǎng)基中止吹打成單個(gè)細(xì)胞離心分鐘將細(xì)胞沉淀懸浮于凍存液胎牛血清中轉(zhuǎn)移到凍存管中小時(shí)一 C小時(shí)液氮管而后放進(jìn)液氮中復(fù)蘇準(zhǔn)備溫水視復(fù)蘇細(xì)胞管數(shù)多少將從液氮罐中取出的細(xì)胞迅速在水中融化不斷攪動(dòng)轉(zhuǎn)移細(xì)胞于加有新鮮完全培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)次日更換培養(yǎng)液質(zhì)粒的構(gòu)建啟動(dòng)子區(qū)報(bào)告基因質(zhì)粒及突變體質(zhì)粒的構(gòu)建方法啟動(dòng)子區(qū)全長(zhǎng)及各突變體質(zhì)粒物見(jiàn)下表其中各突變體質(zhì)粒采用第二軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文重疊延伸法進(jìn)行構(gòu)建條件如下變性退火C延伸C個(gè)循環(huán)電泳鑒定構(gòu)建方法上游引物均引入酶切位點(diǎn)下游引物均引入酶切位點(diǎn)得到的產(chǎn)物進(jìn)行膠回收再用酶切與用同樣雙酶切酶切回收后的質(zhì)粒進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌氨葦抗生素篩選陽(yáng)性克隆用酶切初步鑒定正確后再送測(cè)序鑒定確認(rèn)突變位點(diǎn)正確后再用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)質(zhì)粒名稱引物干擾質(zhì)粒質(zhì)粒的構(gòu)建人工合成針對(duì)人中部堿基處的反向互補(bǔ)序列端加端加入粘性木端序列如下合成后上下游寡入粘性術(shù)端核甘酸鏈在 溶液中于沸水浴中后自然冷卻即得到雙鏈的帶粘性末端的有矛片段質(zhì)粒用酶切回收然后進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌卡那抗生素篩選陽(yáng)性克隆片段是否接入用測(cè)序鑒定鑒定正確后在體外驗(yàn)證其干擾效果一表達(dá)載體的構(gòu)建在人膠質(zhì)瘤中對(duì)水通道蛋白調(diào)控作用的研究網(wǎng)站檢索得到序列根據(jù)JT放讀碼框設(shè)計(jì)引物序列如下上游引物引入 酶切位點(diǎn)下游引物引入酶切位點(diǎn)以抽提的大鼠腎臟組織為模板擴(kuò)增膠回收后用酶切質(zhì)粒同樣進(jìn)行雙酶切后回收片段載體進(jìn)行連接然后進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌氨葦抗生素篩選陽(yáng)性克隆酶切鑒定細(xì)胞轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體法公司在培養(yǎng)皿中接種適量細(xì)胞使之培養(yǎng)后匯合率達(dá)到在不同離心管中分別加入無(wú)血清分別加入肛質(zhì)粒和脂質(zhì)體分別混勻后室溫放置將溶液和脂質(zhì)體溶液混合輕柔混勻室溫放置轉(zhuǎn)染前細(xì)胞用預(yù)溫的無(wú)血清洗滌一遍加入無(wú)血清隨后將質(zhì)粒一脂質(zhì)體復(fù)合物滴加至細(xì)胞表面置孵箱內(nèi)培養(yǎng)后吸去一脂質(zhì)體復(fù)合物加入含的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)裂解細(xì)胞提取總蛋白法公司在孔培養(yǎng)皿中接種適量使之培養(yǎng)后匯合率達(dá)到在不同離心管中分別加入生理鹽水并混勻隨即將溶液加入溶液振分別加入質(zhì)粒和蕩混勻室溫放置將質(zhì)粒脂質(zhì)體復(fù)合物滴加至細(xì)胞表面置孵箱內(nèi)培養(yǎng)裂解穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞轉(zhuǎn)染后胰酶消化按傳代細(xì)胞貼壁后加入培養(yǎng)以維持其性狀兩周左右挑取單克隆細(xì)胞抽提待六孔板中細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合度室溫孵育加入加入氯仿劇烈振蕩室溫孵育C離心吸取上層含有的水相入新管加入異丙醇沉淀室溫孵育離心第二軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文棄上清加入的乙醇洗滌磯沉淀C離一水溶解干燥用用紫外分光光度計(jì)測(cè)定的含量保存準(zhǔn)備做操作步驟合成第一鏈總隨機(jī)引物立星丞魚(yú)叢C冰浴至少x肛CCC在人膠質(zhì)瘤中對(duì)水通道蛋白調(diào)控作用的研究反應(yīng)取上述合成的為模板按列反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增槿拯墜加水至總體積為輕輕混合預(yù)變性變性退火延伸至個(gè)循環(huán)C終木延伸產(chǎn)物用瓊脂糖膠電泳分析熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)在孔或孔板中接種細(xì)胞使小時(shí)后匯合率為瞬時(shí)轉(zhuǎn)染熒光素酶報(bào)告基因和的基因小時(shí)后裂解細(xì)胞采用公司雙熒光報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)細(xì)胞增殖速率比較取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞傳代消化以每孔個(gè)的密度接種入孔板并設(shè)個(gè)復(fù)孔在后加入十分之一體積的工作液孵育小時(shí)后放入酶標(biāo)儀以波長(zhǎng)檢測(cè)取平均值比較差異體外侵襲實(shí)驗(yàn)基質(zhì)膠準(zhǔn)備將凍存于度冰箱的度過(guò)夜變成液態(tài)取無(wú)血清培養(yǎng)基加入或每室混勻操作最好在冰浴上加入上室各個(gè)室放入培養(yǎng)箱中孵育此間經(jīng)常觀察當(dāng)出現(xiàn)白色層時(shí)說(shuō)明已經(jīng)變?yōu)楣虘B(tài)注釋無(wú)血清培養(yǎng)基和基質(zhì)膠按稀釋每孔加在c培養(yǎng)箱中消化細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基洗次計(jì)數(shù)配成細(xì)胞懸液用無(wú)血清培養(yǎng)基洗洗次每孔加入細(xì)胞懸液第二軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文下腔室中加入含有條件培養(yǎng)基C培養(yǎng)箱中孵育取出用洗遍戊二醛固定加入結(jié)晶紫染色或染色室溫洗遍用棉球擦去上表面細(xì)胞顯微鏡下觀察取隨機(jī)個(gè)視野細(xì)胞計(jì)數(shù)染色質(zhì)免疫共沉淀部分剪切X細(xì)胞于培養(yǎng)瓶中準(zhǔn)備x細(xì)胞培養(yǎng)基為甲醛C置直接加入于冰上終止反應(yīng)盡量吸盡培養(yǎng)基用含冰冷洗滌次管反復(fù)吹打細(xì)胞吸取懸液移入C離心融化裂解液并加入和裂解液再懸細(xì)胞冰上x(chóng)次間隔冰上超聲剪切至大小加入C以解除交聯(lián)苯氯仿法提取瓊脂糖凝膠電泳觀察剪切效果注卜注意冰上操作通過(guò)改變超聲功率間隔次數(shù)優(yōu)化條件通過(guò)電泳判斷片段大小經(jīng)驗(yàn)表明尖端最大功率間隔次可使之優(yōu)化一旦優(yōu)化則固定細(xì)胞數(shù)量部分免疫共沉淀接離心轉(zhuǎn)移上消至離心管稀釋緩沖液稀釋上消至體積并加入蛋白酶抑制劑從中取出進(jìn)入用于定量加入蛋白鞋精瓊脂于稀釋上清以純化搖動(dòng)選中速下同離心以沉淀瓊脂轉(zhuǎn)移上泊于新管乂加入抗體搖動(dòng)過(guò)夜背景對(duì)照則不加抗體直接使用蛋白鞋精瓊脂搖動(dòng)直接進(jìn)入加入蛋白鞋精瓊脂搖動(dòng)以收集抗體轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體在人膠質(zhì)瘤中對(duì)水通道蛋白調(diào)控作用的研究離心以沉淀瓊脂尤其小心移除上清內(nèi)含未結(jié)合及非特異可提取并按以下順序洗滌蛋白鞋精復(fù)合體每種緩沖液加室溫?fù)u動(dòng)離心低鹽免疫復(fù)合體洗液次高鹽免疫復(fù)合體洗液次免疫復(fù)合體洗液次緩沖液次注步取出上清用于不同樣本定量此作為C置以解除蛋白交聯(lián)見(jiàn)初始樣本而且需要通過(guò)加入經(jīng)過(guò)后樣本為蛋白抗體轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體部分沈脫結(jié)合于轉(zhuǎn)錄因子的按體積配制配制新鮮洗脫緩沖液和接加入沈脫液以使轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體與蛋白抗體解離簡(jiǎn)單振蕩混勻室溫?fù)u動(dòng)離心以沉淀瓊脂小心轉(zhuǎn)移上泊于新管并重復(fù)沈脫次混合次洗脫上清以解除轉(zhuǎn)錄因子交聯(lián)置加入此后樣本可放入一于明同進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)應(yīng)同時(shí)包括的初始樣本陰性對(duì)照和背景對(duì)照組樣本用于巢式若結(jié)果不理想可進(jìn)行下面步驟以純化注意小心操作某些可能在純化過(guò)程中丟失部分苯氯仿法提取依次加入蛋白酶C水浴對(duì)于優(yōu)化條件加入和振蕩混勻加入苯氯仿抽提液劇烈振蕩?kù)o止使分層室溫第二軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文離心小心吸取上清加入糖原醋酸鈉乙醇混勻放置一c c離心棄上清醇洗滌次離心棄去上清并倒扣揮發(fā)乙醇加入續(xù)則使用緩沖液沖洗吸附在管壁上的一冰箱保存部分?jǐn)U增反應(yīng)驗(yàn)證結(jié)合作用按體系依次加入上游引物下游引物滅菌水循環(huán)使用然后CCC共個(gè)循環(huán)瓊脂糖凝膠電泳上樣觀察結(jié)果染色細(xì)胞多聚甲醛固定洗處理洗三次每次在人胺貢瘤中對(duì)水通道蛋白調(diào)控作用的研究染色洗三次每次甘油覆蓋熒光顯微鏡下觀察主要引物列表醫(yī)太學(xué)博士學(xué)位論文實(shí)驗(yàn)結(jié)果一膠質(zhì)細(xì)胞瘤月中瘤組織標(biāo)本中及表達(dá)水平的檢測(cè)為了明確在膠質(zhì)瘤組織樣本中通路下游轉(zhuǎn)錄因子與的表達(dá)情況我們首先進(jìn)行了免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)免疫組化結(jié)果提示分級(jí)mIV級(jí)和IV級(jí)神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織與正常對(duì)照組織相比通路呈現(xiàn)出異?；罨癄顟B(tài)通路下游轉(zhuǎn)錄因子異常高表達(dá)陽(yáng)性著色主要分布于變異肥大的星形膠質(zhì)細(xì)胞的胞核與胞漿內(nèi)圖瀑眷>潦蕤在人膠質(zhì)瘤中對(duì)水通道蛋白調(diào)控作用的研先第二軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文七圖神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中免疫組織化學(xué)染色分級(jí)為IV級(jí)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤及中免疫組化染色結(jié)果正常對(duì)照組織腫病組織中呈現(xiàn)出異常的高表達(dá)陽(yáng)性染色主要分布于肥大變形的星形膠質(zhì)細(xì)胞的胞膜表面圖片放大倍數(shù)為中間插入的局部放大圖為在同一膠質(zhì)細(xì)胞瘤組織標(biāo)本中與的高表達(dá)的區(qū)域呈現(xiàn)出比較特異的相關(guān)性圖在人肢質(zhì)瘤中對(duì)水通道蛋白調(diào)控作用的研究一灌夥瓣繁蒸麓輔第二軍醫(yī)太擘博士學(xué)位論文糕麓一圖神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞及神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本中與的免疫熒光共定位表達(dá)情況使用一抗來(lái)源不同的與抗體抗二抗使用標(biāo)記早現(xiàn)紅色熒光抗二抗使用標(biāo)記呈現(xiàn)綠色熒光神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中與的特異性共定位情況神經(jīng)膠質(zhì)病組織中特異性共定位圖中可見(jiàn)主要分布在胞漿和胞膜表面作為轉(zhuǎn)錄因子主要定位于胞棱高表達(dá)的細(xì)胞或組織區(qū)域也呈現(xiàn)出特異性高表達(dá)在人膠質(zhì)瘤中對(duì)水通道蛋白調(diào)控作用的研究初步明確與在膠質(zhì)細(xì)胞瘤中的伴隨高表達(dá)現(xiàn)象之后為了進(jìn)一步驗(yàn)證免疫學(xué)結(jié)果選取例分級(jí)不同的膠質(zhì)瘤冰凍組織標(biāo)本使用液氮研磨裂解法提取總蛋白分別檢測(cè)月中瘤組織標(biāo)本巾與的表達(dá)水分析其相關(guān)性我們發(fā)現(xiàn)與免疫組化的結(jié)果一致與之間的伴隨表達(dá)現(xiàn)象在分級(jí)不同的標(biāo)本中更為明顯總的趨勢(shì)是與的表達(dá)水平都隨著膠質(zhì)瘤惡性程度的增加逐漸升高圖刮神經(jīng)歧廈籀組簪小車川收選水不同分級(jí)的膠質(zhì)瘤其中分級(jí)級(jí)例m級(jí)例m iv級(jí)例iv級(jí)例中與表達(dá)町見(jiàn)與的表逃在小同分級(jí)的月中瘤組織中表現(xiàn)出照好的一致性總的趨勢(shì)是兩者的表達(dá)部隨著膠質(zhì)瘤惡性程度的增加而增強(qiáng)為正常腦組盆二轉(zhuǎn)錄因子對(duì)的調(diào)控作用及其機(jī)制可咀顯著上調(diào)含有啟動(dòng)子區(qū)的報(bào)告基因活性神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本中與表達(dá)之間的伴隨關(guān)系提示下游轉(zhuǎn)錄因子可能對(duì)的表達(dá)具有調(diào)控作用為了驗(yàn)證這個(gè)初步的設(shè)想我們?cè)诤蜕窠?jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中分別共轉(zhuǎn)與含有啟動(dòng)子區(qū)的報(bào)告基因質(zhì)粒結(jié)果發(fā)現(xiàn)的表達(dá)可以在兩種細(xì)胞系中激活的報(bào)告基因活性并且隨著轉(zhuǎn)入量的增加的報(bào)告基因活性也逐漸升高表現(xiàn)出較好的劑量依賴性圖第二軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文怎墨叮價(jià)慧一 8一OO碰OOOO 陽(yáng) OOOOOO 的扣 OO一沁OO卯篁冒毋價(jià)母垃OOOO-8 圖對(duì)含有啟動(dòng)子區(qū)的報(bào)告基因激活作用在及中共轉(zhuǎn)與之后報(bào)告基岡的激活情況與對(duì)照組相比可以顯著增強(qiáng)報(bào)告基岡的活性并且這種激活作用隨著轉(zhuǎn)入量的增加而增強(qiáng)表現(xiàn)出劑量依賴的特點(diǎn)可以上調(diào)的和蛋白表達(dá)水平在膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本和報(bào)告基因的結(jié)果都提示通路下游轉(zhuǎn)錄激活因子很有可能對(duì)水通道蛋白的表達(dá)具用調(diào)控作用我們隨之在人胚腎上皮細(xì)胞中進(jìn)行了預(yù)實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證該假設(shè)外源性在中轉(zhuǎn)及蛋入收獲不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞及檢測(cè)在人膠質(zhì)瘤中對(duì)水通道蛋白調(diào)控作用的研究白表達(dá)水平結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)入的細(xì)胞與對(duì)照組相比的表達(dá)增強(qiáng)這種增強(qiáng)作用隨著時(shí)問(wèn)的延長(zhǎng)更加明顯與表達(dá)的增強(qiáng)情況相一致表現(xiàn)出較好的時(shí)間依賴性在中外轉(zhuǎn)劑量梯度增加的后檢測(cè)的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)的表達(dá)隨著轉(zhuǎn)入劑量的增加而升高表現(xiàn)出較好的劑量依賴性圖瓢月中硼匿三三三孫第二軍醫(yī)走學(xué)博士學(xué)位論文墨塑哆圖中外轉(zhuǎn)對(duì)在轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)作用在中與轉(zhuǎn)入的對(duì)照質(zhì)粒相比較的過(guò)表逃可以使的表逃隨著時(shí)問(wèn)的延躍行增加表現(xiàn)山時(shí)間依賴的特點(diǎn)在中以梯度劑量轉(zhuǎn)入?yún)柨梢允沟谋磉_(dá)水平梯度升高表現(xiàn)出劑量依賴的特點(diǎn)恤曲撲在人膠質(zhì)瘤中對(duì)水通道蛋白調(diào)控作用的研究 一妒口拿山H已洲 圖中外轉(zhuǎn)對(duì)在蛋白表達(dá)水平的上調(diào)作用在中與轉(zhuǎn)入的對(duì)照質(zhì)粒相比較的過(guò)表達(dá)可以使的蛋白表選隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加表現(xiàn)出時(shí)間依賴的特點(diǎn)在中以梯度劑量轉(zhuǎn)入斤町以使的蚩白表達(dá)水平梯度升高表現(xiàn)出劑量依賴的特點(diǎn)在細(xì)胞中驗(yàn)證了對(duì)的上調(diào)作用之后為了了解這種可能的調(diào)控機(jī)制是否具有普遍性我們又在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中重復(fù)了上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在中轉(zhuǎn)入過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后與對(duì)照組相比較的及蛋白表達(dá)水平都有了顯著升高并且這種升高也表現(xiàn)出時(shí)間和劑量依賴性第二軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)住論文引墨五三亙蔓亟亙圄廄皿盂磴出器地埔瞄顯懂蟆8出 業(yè)口瑚VI皿山8刈鞠OO一觸