血漿、血清、體液蛋白質組學血漿、血清、體液蛋白質組學研究及其應用研究及其應用1柳滿然 Ph.DE-mail: mliu-Tel: 6848-5184蛋白組學基本知識蛋白組學基本知識2血漿、血清蛋白組學血漿、血清蛋白組學唾液蛋白組學唾液蛋白組學尿液蛋白組學尿液蛋白組學腦、脊液蛋白組學腦、脊液蛋白組學一、蛋白組學基本知識一、蛋白組學基本知識34蛋白質組蛋白質組(proteome = protein + genome):一種細胞、組織或生物體完整基因組所對應的一種細胞、組織或生物體完整基因組所對應的全套蛋白質全套蛋白質蛋白質組學（蛋白質組學（proteomics)研究細胞、組織或生物體蛋白質組成及其變化研究細胞、組織或生物體蛋白質組成及其變化規(guī)律的科學規(guī)律的科學5Post-translational modificationProtein-protein interactionGenome-Transcriptome-ProteomeDisease marker-diagnosisDrug target-therapy Proteomics6蛋白質組研究的基本技術蛋白質組研究的基本技術分離分離Gel-basedLiquid-basedHPLCFFESCX, RP, SECSDS-PAGE, IEF2DE鑒定鑒定MSMALDI-TOF-MSESI-MSMS-MS2D-HPLCMALDI-TOF-TOFMALDI-Q-TOFESI-MS-MSLC-ESI-MS-MS計算機計算機技術技術7IEF: isoelectric focusing (等電聚焦)2-DE：Two-dimensional gel electrophoresis第一向基于蛋白質的等電點不同用等電聚焦分離；第二向則按分子量的不同用SDS-PAGE分離， 把復雜蛋白混合物中的蛋白質在二維平面上分開HPLC：High-performance liquid chromatography or high-pressure liquid chromatography (高壓液相色譜法)DIGE：2-D difference Gel Electrophoresis基本縮略詞基本縮略詞iTRAQ: Isobaric tag for relative and absolute quantitation 同位素標記相對和絕對定量同位素標記相對和絕對定量8質譜儀分為進樣系統(tǒng)、離子源、質量分析器和檢測器四部分。離子源又分為：電子轟擊源 (Electron Ionization，EI)化學電離源 (Chemical Ionization，CI)場致電離源 (FI)電噴霧電離源 (Electro Spray Ionization，ESI) 等MS是單級質譜，適用于樣品不是特別復雜的樣品分析。 對于復雜樣品，單級質譜會出現(xiàn)很多干擾峰，影響測定。MS：Mass Spectroscopy (質譜)MS/MS是串聯(lián)四級桿質譜，通過兩個質量分析器間的碰撞室進行 一定能量的碰撞，選擇性的掃描碰撞后得到的子離子碎片，不符合 一定質量數(shù)的離子被拋棄，這就降低了背景噪音、大大提高了檢測的 靈敏度和準確度?；究s略詞基本縮略詞9ESI-MS：Electro Spray Ionization-Mass Spectroscopy， 電噴霧質譜MALDI-TOF-MS：Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization/ Time of Flight Mass Spectrometry 基質輔助激光解吸離子化-飛行時間質譜， 是一種新型的軟電離生物質譜LC-ESI-MS/MS: 高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質譜MALDI-TOF-TOF：基質輔助激光解吸離子化-串聯(lián)飛行時間質譜MALDI-Q-TOF：基質輔助激光解吸離子化-三級四級桿-飛行時間質譜基本縮略詞基本縮略詞10PMF： Peptide Mass Fingerprinting (肽質量指紋譜)， 是蛋白質被識別特異酶切位點的蛋白酶水解后得到的 肽片段的質量圖譜蛋白質組學研究中，質譜測序一般采用兩種方式： 一種是利用串聯(lián)質譜 (MS/MS) 測序； 另一種是利用源后衰變 (PSD：post-source decay) 技術測序基本縮略詞基本縮略詞IPG(EF)：Immoblized pH gradients isoelectric focusing (固相固相pH梯度等電聚焦梯度等電聚焦)11PMF常用軟件常用軟件Mascot: Profound: Prowl.rockefeller.eduPepIdent: www.expasy.ch/toolsProteinProspector: Prospector.ucsf.eduPepSea: 195.41.108.3812常用串聯(lián)質譜檢索工具常用串聯(lián)質譜檢索工具SEQUEST: Field.scripps.edu/sequestPepFrag: Prowl.rockefeller.eduProteinProspector: Prospector.ucsf.eduMascot: 13ESI-MS/MSMAIDI-TOF圖像分析確定差異點差異蛋白質質譜分析數(shù)據(jù)處理與生物信息學分析數(shù)據(jù)搜尋蛋白質鑒定條件A:樣品條件B:樣品基于基于2DE的差異蛋白質組分析技術流程的差異蛋白質組分析技術流程14 Provides a hard-copy record of separation Allows facile quantitation Separation of up to 3000 different proteins Highly reproducible Gives info on Mw, pI and post-trans modifications Inexpensive Limited pI range (4-8) Proteins 150 kD not seen in 2D gels Difficult to see membrane proteins (30% of all proteins) Only detects high abundance proteins (top 30% typically) Time consuming 30% of spots with multiple proteins from pI 4-7 2DE:Advantages & Disadvantages15傳統(tǒng)的基于傳統(tǒng)的基于2DE的的差異蛋白質組學分析技術差異蛋白質組學分析技術優(yōu)點：優(yōu)點：技術路線成熟技術路線成熟重現(xiàn)性和直觀性好重現(xiàn)性和直觀性好費用較低費用較低展示差異蛋白質的展示差異蛋白質的PI和和Mw缺點：缺點：蛋白質共遷移蛋白質共遷移(comigration)問題，不適合于很復雜的樣品問題，不適合于很復雜的樣品線性動態(tài)范圍較窄線性動態(tài)范圍較窄強疏水性，強鹼性，分子量過大強疏水性，強鹼性，分子量過大( 150kD）的）的 蛋白質受到限制蛋白質受到限制16Proteins quantificationQuantitative analysisSCX RP2D chromatographicseparation of peptides數(shù)據(jù)處理與數(shù)據(jù)處理與生物信息學分析生物信息學分析ICAT label cysteines heavy light Combine trypsinizeheavy light 基于基于Shotgun差異蛋白質組分析技術流程差異蛋白質組分析技術流程iTRAQ-LC-MS/MS17Protein mixtureProtein digestsSCX column fractionationReverse column separationAuto MS/MS detectionTandem MS spectraBioWorks data base searchResults18 Alleviate some limitations of the 2-DE/MS method Generally high throughput Protein identification and quantification is straightforward process is simple Can be used to ID post-trans. modifications Requires more handling for sample isotopic labeling Low reproducibility Requires high level expertise Showed biases for high Mr proteins and against certain types and classes of proteinsAdvantages DisadvantagesShotgun:Advantages & Disadvantages19Sensitivity and dynamic range of protein analysis methodsSensitivity Dynamic Range (Orders of Magnitude)Bio-Safe coomassieG-250 stain5-10ng2-3Coomassie BlueR-250 stain10-25ng 2-3Silver stain kit 0.5-1ng1-2SYPRO Ruby protein gel stain0.5-1ng3-4MALDI-TOF/TOF-MS 0.5-1pg3-4ESI-MS/MS (ion trap)0.5pg3-4 (0.05fmole-1pmole)20IPG(EF):Immoblized pH gradients isoelectric focusing(固相固相pH梯度等電聚焦梯度等電聚焦)21n使用寬pH范圍的膠條（pH 3-10）可以在同一塊凝膠上看到樣品中絕大多數(shù)的蛋白質。n將有重疊區(qū)域的窄pH梯度的膠條聯(lián)合使用，也同樣可以得到整個pH 3-10范圍的結果。n因為絕大多數(shù)蛋白聚焦在pH 3-10的中間區(qū)域，所以研究人員有時選用非線性梯度的膠條，這種膠條將兩端的pH梯度壓得很窄，卻可以使中間區(qū)域的蛋白質得到較好的分離。n將窄pH梯度的線性IPG膠條重疊使用，效果要比用非線性膠條好得多，它可以檢測出樣品中更多的蛋白質斑點。pH 梯度范圍的選擇梯度范圍的選擇22常用蛋白酶抑制劑常用蛋白酶抑制劑23優(yōu)點優(yōu)點: 樣品和對照之間的差異蛋白質展現(xiàn)在同一膠上樣品和對照之間的差異蛋白質展現(xiàn)在同一膠上,能直觀可靠確定能直觀可靠確定; 對對isoform 的定量較準確的定量較準確; 比傳統(tǒng)比傳統(tǒng)2DE動態(tài)范圍有所增加動態(tài)范圍有所增加.缺點缺點: 標記效率低只標記效率低只Lys的氨基的的氨基的1%左右左右; 受限于受限于2DE的分離能力的分離能力; 受蛋白質在受蛋白質在2DE上共遷移現(xiàn)象的影響上共遷移現(xiàn)象的影響,可能對復雜樣品的可能對復雜樣品的isoform定量產(chǎn)生影響定量產(chǎn)生影響.Image analysis:differential quantitation Protein extract 1Label with fluor 1Protein extract 2Label with fluor 2Co-separate by 2D PAGEMix labeled extractsImage gelExcitation wavelength 1Excitation wavelength 2Differential analysisImage analysis: Overlay images 24缺點缺點: 只標記只標記Cys，沒有，沒有Cys的蛋白質得不到鑒定。純化含的蛋白質得不到鑒定。純化含Cys肽段時，肽段時，有效肽段損有效肽段損 失巨大失巨大(達達90%)。ICAT 分子量大，對于較小肽段影響數(shù)據(jù)庫的搜索。分子量大，對于較小肽段影響數(shù)據(jù)庫的搜索。2H, 1H 標記的肽段在反相分離時表現(xiàn)出輕微的洗脫時間不標記的肽段在反相分離時表現(xiàn)出輕微的洗脫時間不 一致現(xiàn)象，使得定量困難一致現(xiàn)象，使得定量困難.ICAT Workflow (技術流程技術流程) 補充補充優(yōu)點優(yōu)點: 克服了克服了2DE方法相應的缺點。方法相應的缺點。 只鑒定含只鑒定含cys的肽段的肽段,減少了質譜分析的復雜程度。減少了質譜分析的復雜程度。25優(yōu)點優(yōu)點: 全標記，范圍廣，靈敏度高于全標記，范圍廣，靈敏度高于ICAT。 可以做絕對定量?？梢宰鼋^對定量。缺點缺點: 需要需要MS/MS分折后才能定量分折后才能定量; 酶解后標記樣品復雜程酶解后標記樣品復雜程 度高度高; 只適合只適合LC-MALDI-TOF/TOF或或LC-MS/MS。iTRAQ Workflow (技術流程技術流程) 補充補充26The mass difference between labelled (12C/13C) and unlabelled peptides are 105.0215Da/111.0419 Da for each m o d i f i e d a m i n o g r o u p : Lys + Protein N-term.D Dm = 6.0204 Da/mod Lys residue優(yōu)點：優(yōu)點： 蛋白水平標記，全標記蛋白水平標記，全標記NH2，范圍廣，靈敏度高，有利于兼容其它蛋白范圍廣，靈敏度高，有利于兼容其它蛋白 質的分離分法如質的分離分法如2DE，SDS-PAGE等。所有的質譜都可以分析，包括離子阱。等。所有的質譜都可以分析，包括離子阱。缺點：需要用除缺點：需要用除Trypsin 以外的酶切，以提高蛋白質的鑒定率和定量率。以外的酶切，以提高蛋白質的鑒定率和定量率。ICPL Workflow (技術流程技術流程) 補充補充ICPL Reagent Structure27Acid Cleavable ICAT Reagents (ABI) 補充補充優(yōu)點：移去了親和基因使標記的肽段分子量整體減小，提高了質譜分析中的效率和優(yōu)點：移去了親和基因使標記的肽段分子量整體減小，提高了質譜分析中的效率和 降低了數(shù)據(jù)庫搜索的復雜性。標記在降低了數(shù)據(jù)庫搜索的復雜性。標記在C上使得共流出時間一致。上使得共流出時間一致。缺點：同缺點：同ICAT試劑差不多。試劑差不多。28SILAC Workflow (技術流程技術流程) 補充補充(Stable isotope labeling with amino acids in cell culture)優(yōu)點：優(yōu)點： 省去了體外標記化學反應和分離純化步驟，省去了體外標記化學反應和分離純化步驟， 有利于低豐度蛋白質的檢測定量。有利于低豐度蛋白質的檢測定量。 完全兼容任何傳統(tǒng)的蛋白分離手段。完全兼容任何傳統(tǒng)的蛋白分離手段。缺點：缺點： 不能對組織樣品進行分析定量。不能對組織樣品進行分析定量。 培養(yǎng)細胞在富含穩(wěn)定同位素介質中生長，培養(yǎng)細胞在富含穩(wěn)定同位素介質中生長， 可能會影響細胞的繁殖，由此改變蛋白質的可能會影響細胞的繁殖，由此改變蛋白質的 表達水平。表達水平。 昂貴。不適用于人體樣品。昂貴。不適用于人體樣品。29補充補充優(yōu)點：優(yōu)點： 方便對方便對MS/MS掃描時掃描時Y系列離子的識別。系列離子的識別。 簡單，快速。簡單，快速。 完全標記，不帶傾向性。完全標記，不帶傾向性。 不會丟失翻譯后修飾信息。不會丟失翻譯后修飾信息。缺點：缺點： 不穩(wěn)定。不穩(wěn)定。 完全標記后肽段只相差完全標記后肽段只相差4Da。30Label-free strategies:Extracted ion current (XIC)-based quantification 補充補充優(yōu)點：優(yōu)點： 可準確定量?？蓽蚀_定量。 不需標記，可對任何樣品進行定量。不需標記，可對任何樣品進行定量。 不丟失任何修飾信息。不丟失任何修飾信息。缺點：缺點： 在樣品定量分析時，容易出錯。在樣品定量分析時，容易出錯。 需做平行的兩次實驗，對儀器，環(huán)境等要求高。需做平行的兩次實驗，對儀器，環(huán)境等要求高。 不適合時，兩個獨立的樣品進行多次純化。不適合時，兩個獨立的樣品進行多次純化。31Peptide ions from more abundant proteins would be selected more frequently in MS spectrum.LC-MS/MS Spectral counts OR number of peptides identified for each protein根據(jù)根據(jù)spectral counts 的數(shù)目直接估計豐的數(shù)目直接估計豐度或根據(jù)公式計算出一個豐度值度或根據(jù)公式計算出一個豐度值例子: emPAI =10PAI-1 where PAI is the number of observed peptides divided by the number of theoretically observable peptides. M.Mann et al MCP 4.9 1265-1272Semiquantification: Spectral counts 補充補充優(yōu)點優(yōu)點: 簡單，直接，多用于單個復雜樣本內蛋白質之間的相對定量簡單，直接，多用于單個復雜樣本內蛋白質之間的相對定量.缺點缺點: 尚無報道用于兩個樣本之間蛋白質的定量；不同樣本、不同尚無報道用于兩個樣本之間蛋白質的定量；不同樣本、不同LC-MS/MS之間的比較不太準確之間的比較不太準確.二、血漿二、血漿/血清蛋白組學血清蛋白組學32(Human Plasma Proteome Project，HUPO PPP)33HUPO PPP2001.10. 國際人類蛋白質組組織(Human Proteome Organization, HUPO)，在美國成立。啟動人類蛋白質組計劃(HumanProteome Project, HPP). HPP的主要研究目的：鑒定人類基因組編碼的全部蛋白質及其功能；揭示：u 構成各種人類組織不同細胞類型的蛋白質表達譜；u 蛋白質組翻譯后修飾譜；u 蛋白質組亞細胞定位圖；u 蛋白質-蛋白質相互作用關系圖；u 蛋白質結構與功能聯(lián)系圖34HPP首批執(zhí)行計劃：人血漿蛋白質組計劃 (Human Plasma Proteome Project，HUPO PPP)人肝臟蛋白質組計劃 (Human Liver Proteome Project，HLPP )HUPO PPP由美國科學家Gilbert Omenn牽頭十多個國家/地區(qū)、57個實驗室參與HUPO PPP35HUPOPPP的先期(pilot phase)目標：l 比較不同樣本收集、處理和儲存過程對蛋白質分析的影響；l 通過分析血漿蛋白質組，比較不同蛋白質組分析技術平臺的 敏感性和局限性；l 比較不同高豐度蛋白去除(depletion)方法，以及去除與否 對蛋白鑒定的影響；l 數(shù)據(jù)提取、整理和儲存的標準化目的：l 全面認識人類正常血漿/血清中的全部表達蛋白l 全部表達蛋白在不同生理條件下的變異度 HUPO PPP36人血漿人血漿/血清蛋白質組學研究的特別意義血清蛋白質組學研究的特別意義Gilbert Omenn，2006.12人血漿蛋白質學的專著人血漿蛋白質學的專著37人血漿人血漿/血清蛋白質組學研究的獨特地位血清蛋白質組學研究的獨特地位機體中的機體中的 每一個細胞都可能將反映其生理狀態(tài)的記錄，以排泄物或信號分子的每一個細胞都可能將反映其生理狀態(tài)的記錄，以排泄物或信號分子的 形式釋放到血液中形式釋放到血液中常規(guī)的血液檢查僅僅能反映血液所攜帶信息中的很少的部分；常規(guī)的血液檢查僅僅能反映血液所攜帶信息中的很少的部分；在疾病的早期診斷方面，迫切需要發(fā)現(xiàn)更有效的疾病標志物，在疾病的早期診斷方面，迫切需要發(fā)現(xiàn)更有效的疾病標志物， 但迄今為止，公認的新的疾病標志物的數(shù)量極少。但迄今為止，公認的新的疾病標志物的數(shù)量極少。38人血漿蛋白質總況人血漿蛋白質總況血漿中總蛋白量的血漿中總蛋白量的99% 由為數(shù)不多的由為數(shù)不多的22種高豐度蛋白所占有種高豐度蛋白所占有39人血漿蛋白質組的組成人血漿蛋白質組的組成a. 組成性蛋白 主要指肝臟和小腸的分泌蛋白，它們在血漿中發(fā)揮作用， 如白蛋白，纖維蛋白原等b. 免疫球蛋白 血漿中大約含有數(shù)百萬種抗體血漿蛋白根據(jù)其來源和功能可分為：高豐度蛋白和低豐度蛋白高豐度蛋白：高豐度蛋白：40低高豐度蛋白低高豐度蛋白c. 組織滲漏蛋白組織滲漏蛋白：組織新陳代謝或發(fā)生病理改變導致細胞損傷、 死亡而進入血液的蛋白質，可用于疾病的診斷及愈后評價 如心肌鈣蛋白(cardiac troponins)，或心肌球蛋白(myoglobin) 用于診斷心肌梗塞d. “遠距離遠距離”受體和配體：受體和配體：肽類及蛋白質類激素，如胰島素等 生長因子；臨時信使，如非激素類的蛋白e. “局部局部”作用的受體和配體：作用的受體和配體：細胞因子及細胞反應調節(jié)因子， 如IL-8f. 一過性通過蛋白：一過性通過蛋白：如脂蛋白、溶酶體蛋白酶g. 異常分泌蛋白：異常分泌蛋白：如前列腺特異性抗原（PSA）等腫瘤 相關蛋白41意義：認識疾病演變過程，分離疾病特征標志和藥物靶標如：細胞死亡或損傷后被釋放到血漿中的組織滲漏蛋白， 腫瘤或其他病變器官釋放到血漿中的異常分泌蛋白等特點：種類繁多，性質各異，作用重要，分離和鑒定相當困難h. 外來蛋白：外來蛋白：如異常微生物、寄生蟲、病毒的病原蛋白 及其釋放的蛋白i. 小分子量的蛋白及多肽組份：小分子量的蛋白及多肽組份：主要是細胞因子、 多肽類激素及較大蛋白的酶解片斷42A. 人血漿中十種豐度最高的蛋白質，人血漿中十種豐度最高的蛋白質，它們占有總蛋白質量的大約它們占有總蛋白質量的大約90%。B. 人血漿中十二種豐度較高的蛋白質，人血漿中十二種豐度較高的蛋白質，它們占有總蛋白質量的大約它們占有總蛋白質量的大約9%。 占總量的占總量的1%，其數(shù)量多、其數(shù)量多、含量低，但含量低，但最受最受關注。關注。54.31%16.61%3.32%3.64%3.83%1.98%3.45%2.94%1.12%43血漿蛋白組成復雜，蛋白豐度水平差異巨大血漿蛋白組成復雜，蛋白豐度水平差異巨大4445從相對分子質量的分布看，從相對分子質量的分布看，10100 kDa的蛋白質占的蛋白質占有相當大的比例，其中：有相當大的比例，其中： 18% 20 k Da 69% 60 k Da 289種血漿蛋白的分子量大小分布46l 人血漿蛋白是血漿中的所有蛋白質統(tǒng)稱，來源廣、 組成復雜、種類與數(shù)量多人血漿人血漿/血清蛋白質組學研究的特殊性血清蛋白質組學研究的特殊性l 人血漿蛋白質性質的動態(tài)范圍廣，對定量檢測要求高l 人血漿蛋白中的高豐度蛋白對與疾病關系更密切的 低豐度蛋白研究的干擾大l 人血漿蛋白質受取材方式的影響較大l 血漿蛋白的不穩(wěn)定性l 數(shù)據(jù)間的可比性差471、樣品的選擇、樣品的選擇2、樣品的收集與貯存、樣品的收集與貯存3、去除高豐度蛋白和分級技術、去除高豐度蛋白和分級技術4、多維策略的運用、多維策略的運用48蛋白質組學研究中，選用血清或血漿的結果差異很大蛋白質組學研究中，選用血清或血漿的結果差異很大樣品的選擇樣品的選擇血漿和血清的形成方式不同，所含蛋白的種類與數(shù)量不同血清：纖維蛋白被凝結去除，與纖維蛋白結合的蛋白被損失； 凝結過程中血細胞元素釋放大量肽段血漿：抗凝劑 (EDTA、枸櫞酸、肝素) 的選擇影響研究結果， 尤其是對細胞因子的影響大分析低分子量的蛋白質時：分析低分子量的蛋白質時： 適于選用去除血小板的EDTA血漿或枸櫞酸血漿樣品肽組學研究時：肽組學研究時： 最好選用去除血小板的血漿49樣品的收集與樣品的收集與存存收集管：收集管：抗凝劑種類，血清凝集時間，血漿孵育時間和溫度抗凝劑種類，血清凝集時間，血漿孵育時間和溫度貯存：貯存： 室溫室溫4小時或小時或6小時，血樣品變化很小小時，血樣品變化很小 8小時后、特別是小時后、特別是24小時后小時后質譜分析結果有明顯變化質譜分析結果有明顯變化 4下下的結果與室溫下結果差不多，時間推移到的結果與室溫下結果差不多，時間推移到48小時或小時或96小時，小時， 變化非常顯著；變化非常顯著；長期存放在長期存放在-20，-80，或液氮中，或液氮中沒有太大的變化沒有太大的變化反復凍融反復凍融次數(shù)增加卻有很大影響次數(shù)增加卻有很大影響50樣品的樣品的存與結果存與結果Marshall et al., 2006 3 0 0 04 0 0 05 0 0 06 0 0 07 0 0 03 0 0 04 0 0 05 0 0 06 0 0 07 0 0 0025507530004000500060007000025507530004000500060007000025507530004000500060007000FreshPlasma4 hours8 HoursQualitative and quantitative changes to protein profile51n1)血漿或血清參考樣本收集處理血漿或血清參考樣本收集處理必必須在須在2h小時內完成小時內完成；n2)血漿采用用加入血漿采用用加入1.0ml枸櫞酸鈉枸櫞酸鈉(0.105mol/L)抗凝劑抗凝劑(與血的比例為與血的比例為1:9)或者采用噴霧干燥的或者采用噴霧干燥的EDTA為為抗凝劑抗凝劑；血清在室溫下；血清在室溫下30min內用內用微粉硅膠促凝微粉硅膠促凝后分離。分別收集后分離。分別收集10ml。n3) 分離在分離在2-6下操作下操作(枸櫞酸血漿，枸櫞酸血漿，血小板計數(shù)要小于血小板計數(shù)要小于130/ul) 。離心離心后混合即分裝到后混合即分裝到250ul硅烷化硅烷化EP管管中，中，-70保存。保存。n4) 無無HIV、HBV、HCV、HTLV-1 (人類人類T細胞親淋巴病毒細胞親淋巴病毒1型型)、 梅毒，無任何肝損傷。梅毒，無任何肝損傷。n5)整個過程整個過程不加不加cocktail等蛋白酶等蛋白酶抑制劑。抑制劑。n6)所有所有供血者應清晨空腹取血；供血者應清晨空腹取血；24h內無服藥和酒。內無服藥和酒。n此后的血漿蛋白質組學研究大多此后的血漿蛋白質組學研究大多 采用了這一套程序。采用了這一套程序。Tirumalai R.S., Chan K.C., Prieto D.A.,et al. Mol Cell Proteomics.2003,2: 1096-110352n4下處理血液標本，下處理血液標本，2h內盡快分離血清及細胞；內盡快分離血清及細胞；n用用U9緩沖液緩沖液 (9mol Urea, 2%CHAPS, 1%DTT) 稀釋血清稀釋血清后，可以后，可以24h內在室溫下運送或對血清及內在室溫下運送或對血清及WCX（弱陽離（弱陽離子交換）磁珠結合過程進行操作；子交換）磁珠結合過程進行操作；n血清應分裝并長期儲存在血清應分裝并長期儲存在-80或液氮，但限凍融或液氮，但限凍融1次；次；n溶血標本應棄用，建議重新取血。溶血標本應棄用，建議重新取血。劉建棟 等?；A醫(yī)學與臨床, 2007, 27(2)193-197CHAPS: 3-(3-膽酰胺丙基)-二乙胺-丙磺酸, 兩性離子表面活性劑DTT: 二硫蘇糖醇(dithiothreitol), 還原劑用于蛋白質質譜分析的血液標本的處理、用于蛋白質質譜分析的血液標本的處理、運送、操作及儲存的標準建議條件運送、操作及儲存的標準建議條件53高豐度蛋白的去除和分級技術高豐度蛋白的去除和分級技術54高豐度蛋白嚴重干擾了低豐度蛋白的檢測高豐度蛋白嚴重干擾了低豐度蛋白的檢測A: AlbuminB: TransferrinC: Apo A-I lipoproteinD: Haptoglobin b-chainE: a1-AntitrypsinPPI Website Oct 2002，Plasma Proteome Institute55IPG4-7A:原血B:低豐度蛋白IPG4-7未去除高豐度蛋白的肝癌患者血漿的2-DE分離結果去除高豐度蛋白的肝癌患者血漿的2-DE分離結果高豐度蛋白嚴重干擾了低豐度蛋白的檢測高豐度蛋白嚴重干擾了低豐度蛋白的檢測-肝癌患者血漿去除高豐度蛋白前后肝癌患者血漿去除高豐度蛋白前后2-D分離結果分離結果56高豐度蛋白的去除策略高豐度蛋白的去除策略57正常人血漿正常人血漿MARSMARS親合柱親合柱（結合組分（結合組分-BF-BF、流出組分流出組分-FF-FF）結合組分、流出組分蛋白結合組分、流出組分蛋白的胰蛋白酶切的胰蛋白酶切肽段的陽離子交換色譜分離肽段的陽離子交換色譜分離反相色譜分離離子阱質譜鑒定反相色譜分離離子阱質譜鑒定SequestSequest軟件數(shù)據(jù)檢索軟件數(shù)據(jù)檢索SepproTM MIXED12SepproTM MIXED12親合柱親合柱（結合組分（結合組分-BF-BF、流出組分流出組分-FF-FF ）數(shù)據(jù)整合與分析數(shù)據(jù)整合與分析去除血漿高豐度蛋白的技術路線去除血漿高豐度蛋白的技術路線58MechanismMethodsShortcomingMeritbiochemical biophysicalmolecular weight, density, hydrophobicity, surface charge and isoelectric point. not protein-specific, variable capacities, limited reproducibility simple, convenientaffinity capturedye affinityonly deplete albumin, nonspecificcheapImmuno-affinity capture antibody-based systemexpensivedeplete multi-high abundant proteinsHPPPAttempts for the depletion of high abundant proteins59多重親和去除系統(tǒng)進行免疫去除前后的猴血漿多重親和去除系統(tǒng)進行免疫去除前后的猴血漿2DGE圖譜圖譜安捷倫高豐度蛋白去除柱安捷倫高豐度蛋白去除柱 (MARC)60商業(yè)化的多重親和去除血漿高豐度蛋白的分離系統(tǒng)商業(yè)化的多重親和去除血漿高豐度蛋白的分離系統(tǒng)ProteomeLab IgY蛋白質組分組分離系統(tǒng)蛋白質組分組分離系統(tǒng)(Beckman Coulter 公司公司)ProteoExtract Albumin/IgG高豐度蛋白去除試劑盒高豐度蛋白去除試劑盒 (MERCK公司公司)AurumSerum高豐度蛋白去除試劑盒高豐度蛋白去除試劑盒(Bio-Rad公司公司) Agilent Multiple Affinity Removal Column (MARC)安捷倫高豐度蛋白去除柱安捷倫高豐度蛋白去除柱 (安捷倫公司安捷倫公司)ProteoPrep 20 Plasma Immunodepletion Kit (PROT-20)去除血漿中去除血漿中20種高豐度蛋白種高豐度蛋白 (Sigma-Aldrich公司公司)61LH6 6種高豐度蛋白種高豐度蛋白同時清除同時清除HHLLLLLLLLLLHHHHHHHLLLL人體血清人體血清 樣本樣本低豐度蛋白低豐度蛋白低豐度蛋白低豐度蛋白高豐度蛋白高豐度蛋白血清血清/血漿高豐度蛋白清除柱血漿高豐度蛋白清除柱抗抗-白蛋白白蛋白-樹脂樹脂抗抗-轉鐵蛋白轉鐵蛋白-樹脂樹脂抗抗-結合珠蛋白結合珠蛋白-樹脂樹脂抗抗-a a1-抗胰蛋白酶抗胰蛋白酶-樹脂樹脂抗抗-免疫球蛋白免疫球蛋白A-樹脂樹脂抗抗-免疫球蛋白免疫球蛋白G-樹脂樹脂AB問題：清除柱是否僅去除特異的高豐度血漿蛋白？問題：清除柱是否僅去除特異的高豐度血漿蛋白？各抗體以特定比率混合裝填成色譜柱各抗體以特定比率混合裝填成色譜柱62血漿蛋白組成復雜，蛋白質組學研究技術各有利弊，單一技術平臺不能達到最佳分離效果。血清血清/血漿蛋白組學研究的多維策略血漿蛋白組學研究的多維策略聯(lián)合使用不同技術平臺并加以適當改進是目前最通用的手段主要包括：去除高豐度蛋白樣本預分離系統(tǒng)分離系統(tǒng)質譜鑒定系統(tǒng)63血清血清/血漿蛋白組學研究的多維策略血漿蛋白組學研究的多維策略獲得了325個完整的蛋白質 u 高豐度蛋白去除高豐度蛋白去除+色譜分離色譜分離+2-DE+聯(lián)合質譜鑒定聯(lián)合質譜鑒定兩名健康男性血清免疫親和吸附法去除血清8種主要的高豐度蛋白色譜預分離(pre-fractionation)， 離子交換色譜(anion-exchange chromatography，AEC) 分子篩色譜(size-exclusion chromatography，SEC)2-DE分離富集的低豐度蛋白組分(fractions)近3700個蛋白質點MALDI-TOF質譜鑒定LC-MS/MS串聯(lián)質譜進一步分析未能鑒定的蛋白質點Pieper R. et al. 2003, Proteomics, 3(4):422-43264血清血清/血漿蛋白組學研究的多維策略血漿蛋白組學研究的多維策略u 鳥槍測序法(Shotgun sequencing)，即高豐度蛋白去除 + 全蛋白酶解 + 二維液相色譜(陽離子/陰離子交換色譜 + 反相色譜)分離 + 質譜鑒定(離子阱或Q-TOF串聯(lián)質譜)Adkins JN. et al. 2002, Mol Cell Proteomics, 1(12):947-955女性志愿者血清protein A/G吸附去除免疫球蛋白胰蛋白酶對血漿全蛋白酶解強陽離子交換(strong cation exchange, SCX)反相(reversed phase)色譜分離電噴霧液相離子阱質譜(LCQ Ion Trap)鑒定490種不同血漿蛋白 蛋白質鑒定效率提高了3-5倍操作繁雜，自動化程度比較低影響因素較多穩(wěn)定性有待提高65血清血清/血漿蛋白組學研究的多維策略血漿蛋白組學研究的多維策略u 血漿全蛋白預分離(色譜聚集+反相高壓液相色譜) + 組分胰蛋白酶酶解 + 串聯(lián)質譜鑒定 (LC-ESI-MS-MS或2D-micro-LC+MALDI-TOF-TOF-MS )Beckman Coulter公司于2003年下旬推出ProteomeLab PF 2D system完整血漿蛋白預分離系統(tǒng)血漿蛋白先經(jīng)多維色譜分離分離組分經(jīng)胰蛋白酶酶解質譜鑒定克服了2-DE的缺點，操作簡單，自動化程度高，簡化了信息處理提高了低豐度蛋白質、膜蛋白、分子量特別大和特別小的蛋白質的分離檢測能力回收率高，能保持蛋白質的完整性和活力。66血清血清/血漿蛋白組學研究的多維策略血漿蛋白組學研究的多維策略u 多重窄pH范圍2-DE+聯(lián)合質譜鑒定(MALDI-TOF+LC-MS/MS)Starita Geribaldi M et al. 2003, Proteomics, 3(8):1611-19使用相差1個pH范圍的多重固相pH梯度干膠條，大大提高了傳統(tǒng)2-DE的分離效率MALDI-TOF + LC-MS/MS聯(lián)合質譜分析蛋白質鑒定的效率增長兩倍，極酸和極堿性蛋白質的分離和鑒定效果67血清血清/血漿蛋白組學研究的多維策略血漿蛋白組學研究的多維策略u 非變性等電聚焦預分離 + 變性等電聚焦預分離 + 1D分離 + 質譜鑒定(LC/MS/MS )Giometti在非變性條件下(不破壞蛋白質的三級結構)進行二維電泳分離分離到的蛋白質仍然保持原始狀態(tài)使蛋白質生物功能和蛋白質之間相互作用的檢測成為可能克服了傳統(tǒng)2-DE (采用變性條件)的缺陷Manabe等通過采用非變性二維電泳與變性二維電泳相結合的方法血漿中分離，鑒定出多個IgG結合蛋白68血清血清/血漿蛋白組學研究的多維策略血漿蛋白組學研究的多維策略u SELDI-TOF分離 + Q-TOF質譜鑒定表面增強激光解吸/離子化 -飛行時間質譜(surfaceenhanced laser desorption/ionization-time of flight,SELDI-TOF)是一種以固相表面親和為基礎的質譜分離技術完整血漿蛋白先經(jīng)過與不同親和表面(化學表面芯片和生物表面芯片)結合純化SELDI質譜分離Q-TOF質譜鑒定差異蛋白質，尤其是小分子蛋白血漿蛋白的分離和鑒定中與上述其他技術具有很大的互補性用于疾病相關的血漿蛋白質組研究69血清血清/血漿蛋白組學研究的多維策略血漿蛋白組學研究的多維策略進行OGE之前用免疫方法去除6個血漿中的主要蛋白質，用1.5 mg分離組分，順利獲得81種蛋白質，其中仍有1個免疫球蛋白u 脫離凝膠電泳(Off-gel electrophoresis，OGE)技術Heller M. et al, 2005, Electrophoresis, 26(6):1174-88應用OGE技術經(jīng)2個步驟將完整的蛋白質和肽段分解成散在的液態(tài)片段LC-MS/MS分析肽片段用1.5 mg人血漿蛋白獲得了53個蛋白質，其中10個為不同的免疫球蛋白12 mg人血漿蛋白，獲得73個蛋白，其中15個與免疫球蛋白相關處于試驗階段處于試驗階段70血清血清/血漿蛋白組學研究中多維策略的優(yōu)勢血漿蛋白組學研究中多維策略的優(yōu)勢2D1D3D4DPlasm/SerumPlasm/SerumPlasm/SerumPlasm/Serum1 LC-MS/MSrun20-40 LC-MS/MS runs100-150 LC-MS/MS runs100-150 LC-MS/MS runs1D SDSPAGEMicroSol-IEF1D SDSPAGE1D SDSPAGEMicroSol-IEFMajor ProteinDepletion100 800-10002000+2800+UniqueProteinsMicroSol-IEF：microscale solution IEF 微量等電聚焦電泳71血清血清/血漿蛋白組學研究的臨床應用血漿蛋白組學研究的臨床應用生物標志物的識別淀粉樣變和沉積疾病遺傳性疾病免疫蛋白質組學脂質組學降解組學和多肽組學72血清血清/血漿蛋白組學研究的臨床應用血漿蛋白組學研究的臨床應用淀粉樣變和沉積疾病淀粉樣變和沉積疾病遺傳性疾病遺傳性疾病免疫蛋白質組學免疫蛋白質組學脂質組學脂質組學淀粉樣變病(amyloidosis)是指一些以折疊結構的纖維蛋白(鑒定成分)為主的淀粉樣物質在器官組織細胞外沉積所引起的疾病如先天性糖代謝缺乏綜合征識別組織相容復合物(MHC)、特異抗體的抗原、外源病毒或疾病產(chǎn)生的蛋白識別脂蛋白及結合蛋白73血清血清/血漿蛋白組學研究的臨床應用血漿蛋白組學研究的臨床應用降解組學和多肽組學降解組學和多肽組學識別與鑒定與疾病、生物過程中蛋白代謝特異相關的多肽生物標志物生物標志物 (Biomarkers)生物標志物現(xiàn)特指疾病或機體狀態(tài)的信息指標，如基因序列或突變、mRNA 表達譜或組織蛋白等。主要指正常生物學過程、致病過程或正常生物學過程、致病過程或干預療法的藥理反應等過程的一種生物指標干預療法的藥理反應等過程的一種生物指標FDA在“藥物基因組學“提出”有效生物標志物“有效生物標志物有效生物標志物”是一種得到廣泛認可的，具有生理學、毒理學、是一種得到廣泛認可的，具有生理學、毒理學、藥理學或者臨床意義的指標藥理學或者臨床意義的指標”74血清血清/血漿蛋白組學研究的臨床應用血漿蛋白組學研究的臨床應用理想的生物標志物具有的特點與疾病發(fā)生、發(fā)展機制緊密相關：與疾病發(fā)生、發(fā)展機制緊密相關：具有較好的診斷、危險性分類具有較好的診斷、危險性分類 和預后評估的價值和預后評估的價值真實性真實性 具有良好的靈敏度和特異性具有良好的靈敏度和特異性具有可預測性具有可預測性 常用預測值常用預測值 (predictive value，PV) 表示，包括陽性預測值表示，包括陽性預測值(PPV) 和陰性預測值和陰性預測值 (NPV)能有效地用于臨床疾病的分型能有效地用于臨床疾病的分型檢測方法可實現(xiàn)標準化檢測方法可實現(xiàn)標準化 易于掌握和推廣應用，具有非創(chuàng)傷性，適合于高通量分析，費用適當易于掌握和推廣應用，具有非創(chuàng)傷性，適合于高通量分析，費用適當75Petricoin等用疏水型芯片結合并分離了卵巢癌患者血漿相關蛋白，在腫瘤和健康血清之間發(fā)現(xiàn)了5個差異明顯的蛋白質峰，它們共同構成卵巢癌診斷模型用該模型對腫瘤和健康人血漿進行盲篩，該模型診斷腫瘤的敏感性為100%，特異性為95%血清血清/血漿蛋白組學研究的實例血漿蛋白組學研究的實例76Li等選用金屬離子鰲合芯片結合并分離乳腺癌血漿蛋白，發(fā)現(xiàn)3個乳腺癌特異的差異蛋白峰。用這3個特異蛋白標志盲篩一組乳腺癌和健康人血漿蛋白，乳腺癌檢出的敏感性為93%，特異性為91%血清血清/血漿蛋白組學研究的實例血漿蛋白組學研究的實例77三、尿蛋白質組學三、尿蛋白質組學Urinary Proteomics78尿蛋白質組學研究的獨特地位標本獲得上：方便、無害、量大保存上：相對穩(wěn)定可溶性蛋白固相成分正常人的尿液中存在1500種以上的蛋白質來源于大蛋白質分子裂解的大量多肽片段79尿蛋白質的來源：可溶性蛋白尿蛋白質的來源：可溶性蛋白近端腎小管近端腎小管80尿蛋白質的來源：固相成分尿蛋白質的來源：固相成分急性腎小管壞死時的急性腎小管壞死時的腎小球疾病時的足突狀細胞脫落腎小球疾病時的足突狀細胞脫落Exosomes又稱外泌體又稱外泌體注注1：上皮細胞包括尿足細胞（：上皮細胞包括尿足細胞（urinary podocytes）、尿道上皮細胞在內的各種泌尿器管道的）、尿道上皮細胞在內的各種泌尿器管道的 上皮細胞上皮細胞81尿蛋白質組學的研究意義尿蛋白質組學的研究意義nin the early diagnosis of disease nin classification of disease with regard to likely therapeutic responses nin assessment of prognosis nin monitoring response to therapy nThese approaches have potential value, not only in diseases of the kidney and urinary tract, but also in systemic diseases that are associated with circulating small-protein and peptide markers that can pass the glomerular (血管小球的) filter.82一個經(jīng)典流程一個經(jīng)典流程尿蛋白質組學的研究范例尿蛋白質組學的研究范例1D：one-dimensional; HPLC：high-performance liquid chromatography HAS： human serum albumin MW：molecular weight LC：liquid chromatography MS：mass spectrometry SDS：sodium dodecyl sulfate83以1D SDS 和 RP HPLC對尿蛋白質組進行分離和分級對分離和分級后的蛋白質組成份進行膠上或溶液內酶解，以LTQ-FT 和 LTQ-Orbitrap兩種質譜儀進行MS、MS-MS分析從十名健康受試者的尿中鑒定出了1543種蛋白尿蛋白質組學的研究范例尿蛋白質組學的研究范例Gene Ontology (GO)分析表明, 幾乎有一半是膜蛋白幾乎有一半是膜蛋白細胞外蛋白、溶酶體和細胞質膜蛋白均在尿中得到富集細胞外蛋白、溶酶體和細胞質膜蛋白均在尿中得到富集尿中的細胞質膜蛋白可能來自尿中的細胞質膜蛋白可能來自exosomes的分泌的分泌Gene Ontology（GO）包含了基因參與的生物過程，所處的細胞位置，發(fā)揮的分子功能三方面功能信息，并將概念粗細不同的功能概念組織成DAG（有向無環(huán)圖）的結構。GO表示各物種的基因功能分類體系，較全面地概括了基因的功能信息。在基因表達譜分析中，GO常用于提供基因功能分類標簽和基因功能研究的背景知識。利用GO的知識體系和結構特點，可發(fā)掘與基因差異表達現(xiàn)象關聯(lián)的單個特征基因功能類或多個特征功能類的組合。84acetone precipitation（丙酮沉淀）（丙酮沉淀）Ultracentrifugation（超速離心）（超速離心）The urine samples were fractionated by two different methods. The proteins were separated by 2D-PAGE. 尿蛋白的分離852-DE comparing the urine of septic（敗血癥） rats without ARF to septic rats with ARF86激素敏感型與激素耐藥型先天性腎病綜合征的SELDI-TOF-MS研究尿蛋白組學研究舉例分別以CM10， IMAC 30，H50和Q10蛋白質芯片對8788四、唾液蛋白質組學四、唾液蛋白質組學Salivary Proteomics89概念90n唾液（Saliva）主要是腮腺、舌下腺、下頜下腺的分泌產(chǎn)物 n唾液與血液、尿液一樣，在疾病的臨床篩查、診斷中具有重要意義的診斷樣品。n人體的多種疾病、影響唾液成份，唾液蛋白成分可提供局部或全身性病癥的線索和狀況。 唾液(Saliva)及對疾病的診斷意義 下頜下腺下頜下腺(submandibular, SM) 舌下腺舌下腺 (sublingual, SL)腮腺腮腺( (parotid) )三叉神經(jīng)三叉神經(jīng)面神經(jīng)面神經(jīng)91水分水分(99%)酶酶酶阻滯物酶阻滯物生長因子生長因子細胞因子細胞因子免疫球蛋白免疫球蛋白粘液素粘液素糖蛋白糖蛋白少量無機鹽等少量無機鹽等唾液的成分唾液的成分92na：血清成分的選擇性主動轉運nb：脂溶性成分的被動擴散nc：選擇性成分的簡單過濾nd：腺泡細胞活化泵將水合Na+轉運至 唾液腺導管ne：唾液腺導管細胞將低滲唾液中的 Na+泵回血液。n圖中，f為細胞膜，g為細胞膜孔，h為細胞間隙，i為腺泡細胞。唾液成分與血清成分是有密切的關系 93唾液中的主要功能蛋白質SalivaryFamiliesAnti-BacterialBufferingDigestionMineral-izationLubrication & ViscoelasticityTissueCoatingAnti-FungalAnti-ViralCarbonic anhydrases(脫水酶),Histatins(富組蛋白)Amylases(淀粉酶),Mucins(粘蛋白), Lipase(脂酶)Cystatins(胱蛋白),Histatins,Proline-rich proteins,StatherinsMucins, StatherinsAmylases,Cystatins, Mucins, Proline-rich proteins, StatherinsHistatinsCystatins,MucinsAmylases, Cystatins,Histatins, Mucins,Peroxidases蛋白類94唾液蛋白質組學的主要研究內容唾液蛋白質組學的主要研究內容95國外研究進展國外研究進展96全唾液蛋白質譜研究全唾液蛋白質譜研究嗜中性白細胞分離純化出的3種陽離子小肽（HNP-1、HNP-2與 HNP-3）中的一種，具有抑制艾滋病病毒復制的功能n相對分子質量最大的蛋白質是粘蛋白97五、腦脊液蛋白質組學五、腦脊液蛋白質組學Cerebrospinal fluid Proteomics98n 腦脊液中的蛋白質組的變化被認為是與許多中樞神經(jīng) 系統(tǒng)疾病有關n 腦脊液：無色透明，充滿在