成才之路 生物路漫漫其修遠(yuǎn)兮 吾將上下而求索人教版 選修1 DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)專題五 課題3血紅蛋白的提取與分離專題五 課 堂 合 作 探 究2思 維 創(chuàng) 新 升 華3知 識(shí) 體 系 構(gòu) 建4課 時(shí) 作 業(yè)5課 前 預(yù) 習(xí) 導(dǎo) 學(xué)1 課 前 預(yù) 習(xí) 導(dǎo) 學(xué) 1.掌握提取生物大分子的基本過程和方法。(重點(diǎn))2理解凝膠色譜法、電泳法等分離生物大分子的基本原理。(重、難點(diǎn))3嘗試對(duì)血液中的血紅蛋白進(jìn)行提取和分離。 一、凝膠色譜法1概念：也稱做_，是根據(jù)_分離蛋白質(zhì)的有效方法。2原理當(dāng)_不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時(shí)，相對(duì)分子質(zhì)量_的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程_，移動(dòng)速度_，而相對(duì)分子質(zhì)量_的蛋白質(zhì)無法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在_移動(dòng)，路程_，移動(dòng)速度_，從而使_不同的蛋白質(zhì)分子得以分離。分配色譜法 相對(duì)分子質(zhì)量大小 相對(duì)分子質(zhì)量 較小 較大 較慢 較大 凝膠外部 短 快 相對(duì)分子質(zhì)量 二、緩沖溶液1作用：在一定范圍內(nèi)，抵制_的_對(duì)溶液pH的影響，維持pH _。2配制：由_種緩沖劑溶解于_中配制而成，通過調(diào)節(jié)緩沖劑的_就可以得到不同pH范圍內(nèi)使用的緩沖液。外界酸和堿相對(duì)穩(wěn)定12水使用比例 三、電泳1概念：指_在電場的作用下發(fā)生的_的過程。2原理：在一定的_下，_、_等生物大分子的可解離基團(tuán)會(huì)帶上_或_，在_的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷_的電極移動(dòng)。帶電粒子遷移pH多肽核酸正電負(fù)電電場相反 3作用：電泳利用了待分離樣品中各種分子_的差異及分子本身的_、_的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的_，從而實(shí)現(xiàn)樣品中_的分離。4方法：常用的電泳方法有_和_。測定蛋白質(zhì)分子量時(shí)通常使用_。帶電性質(zhì)大小形狀遷移速度各種分子瓊脂糖凝膠電泳 聚丙烯酰胺凝胺電泳 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 四、實(shí)驗(yàn)操作蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：_、_、_和_。1樣品處理(1)紅細(xì)胞的洗滌：目的是_。采用_離心，吸取血漿后加_洗滌，直至上清液中沒有_，表明紅細(xì)胞已洗滌干凈。(2)血紅蛋白的釋放：在_和_的作用下，紅細(xì)胞破裂，釋放出血紅蛋白。樣品處理 粗分離 純化純度鑒定去除雜蛋白低速短時(shí)間生理鹽水黃色蒸餾水甲苯 (3)分離血紅蛋白溶液：把混合液離心后，將試管中的液體用濾紙過濾，除去_，于分液漏斗中靜置片刻后，分離出下層的_。(4)透析：透析袋能使小分子自由進(jìn)出，而將大分子物質(zhì)保留在袋內(nèi)。脂溶性沉淀層紅色透明液體 2凝膠色譜操作(1)凝膠色譜柱的制作：準(zhǔn)備材料加工橡皮塞安裝色譜柱。(2)凝膠色譜柱的裝填。(3)樣品的加入和洗脫。其基本過程是調(diào)節(jié)緩沖液面加入蛋白質(zhì)樣品調(diào)節(jié)緩沖液面洗脫收集分裝蛋白質(zhì)。至此，血紅蛋白即可得到粗分離。3純度鑒定：在鑒定的方法中，使用最多的是_。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 五、操作提示1紅細(xì)胞的洗滌：_、_與_十分重要。洗滌次數(shù)過少，無法除去_；離心速度_和時(shí)間_會(huì)使_等一同沉淀，達(dá)不到分離效果。2色譜柱填料的處理：商品凝膠使用前需直接放在_中膨脹，可以將加入其中的濕凝膠用_，加速膨脹。3凝膠色譜柱的裝填：在裝填凝膠柱時(shí)，不能有_存在。因其能攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的_，降低分離效果。4蛋白質(zhì)的分離：如果_，說明色譜柱制作成功。洗滌次數(shù)離心速度離心時(shí)間血漿蛋白過高過長白細(xì)胞洗脫液沸水浴加熱氣泡洗脫次序紅色區(qū)帶均勻一致地移動(dòng) 紅細(xì)胞破碎后混合液中含有什么成分？紅細(xì)胞破碎混合液中不僅含有血紅蛋白，而且還含有細(xì)胞破碎物、脂質(zhì)、甲苯等。 教材P70“旁欄思考題”凝膠實(shí)際上是一些微小的多孔球體，小球體內(nèi)部有許多貫穿的通道。相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)分子不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，只能分布在顆粒之間，通過的路程較短，移動(dòng)速度較快；相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)分子比較容易進(jìn)入凝膠內(nèi)的通道，通過的路程較長，移動(dòng)速度較慢。因此，樣品中相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)先流出，相對(duì)分子質(zhì)量中等的分子后流出，相對(duì)分子質(zhì)量最小的分子最后流出，從而使各種相對(duì)分子質(zhì)量不同的分子得以分離。 如果凝膠裝填得不夠緊密、均勻，就會(huì)在色譜柱內(nèi)形成無效的空隙，使本該進(jìn)入凝膠內(nèi)部的樣品分子從這些空隙中通過，攪亂洗脫液的流動(dòng)次序，從而影響分離的效果。 課 堂 合 作 探 究 (一)依據(jù)蛋白質(zhì)的特性的差異蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)(如形狀、大小、電荷性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)、親和力等)千差萬別，由此可提取和分離各種蛋白質(zhì)。血紅蛋白提取和分離的方法 (二)蛋白質(zhì)的分離方法：凝膠色譜法1概念：凝膠色譜法也稱做分配色譜法，是根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量大小分離蛋白質(zhì)的有效方法。2原理：大多數(shù)凝膠由糖類化合物構(gòu)成的小球體，內(nèi)部有許多貫穿的通道，當(dāng)不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時(shí)，相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程較長移動(dòng)速度較慢；而相對(duì)分子量較大的蛋白質(zhì)無法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動(dòng)，路程較短，移動(dòng)速度較快。 (三)緩沖溶液1作用：在一定范圍內(nèi)，緩沖溶液能夠抵制外界的酸和堿對(duì)溶液pH的影響，維持pH基本不變。2配制：通常由12種緩沖劑溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的使用比例就可以制得在不同pH范圍內(nèi)使用的緩沖液。 (四)電泳1概念：帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程。2原理：許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解離的基團(tuán)，在一定pH下，這些基團(tuán)會(huì)帶上正電或負(fù)電。在電場的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng)。電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小、形狀的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。 電泳利用了除哪些性質(zhì)外使樣品中各種分子分離()A帶電性質(zhì)差異B分子的大小C分子的形狀 D分子的變性溫度解析電泳是指帶電粒子在電場作用下發(fā)生遷移的過程，帶電性質(zhì)不同、分子的大小和形狀不同都會(huì)影響帶電粒子在電場中的遷移速度。答案D導(dǎo)學(xué)號(hào) 06350412 利用凝膠色譜法，什么樣的蛋白質(zhì)先洗脫出來()A相對(duì)分子質(zhì)量大的 B溶解度高的C相對(duì)分子質(zhì)量小的 D所帶電荷多的答案A解析凝膠色譜法是根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的有效方法。相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)能進(jìn)入凝膠內(nèi)部通道，路程較長，移動(dòng)速度較慢；相對(duì)分子質(zhì)量大的蛋白質(zhì)，路程較短，移動(dòng)速度較快，首先洗脫出來。導(dǎo)學(xué)號(hào) 06350413 蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。提取和分離血紅蛋白的實(shí)驗(yàn)操作 (二)凝膠色譜操作的主要步驟 3純度鑒定SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳判斷純化的蛋白質(zhì)是否達(dá)到要求，需要進(jìn)行蛋白質(zhì)純度的鑒定。鑒定的方法中，使用最多的是SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。 4結(jié)果分析與評(píng)價(jià) 蛋白質(zhì)提取和分離分為哪幾步()A樣品處理、凝膠色譜操作、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳B樣品處理、凝膠色譜操作、純化C樣品處理、粗分離、純化、純度鑒定D樣品處理、純化、粗分離、純度鑒定解析蛋白質(zhì)的提取和分離分為樣品處理、粗分離、純化、純度鑒定四步。A中凝膠色譜操作及SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳為實(shí)驗(yàn)操作過程中的技術(shù)。答案C導(dǎo)學(xué)號(hào) 06350414 相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)在凝膠中的行進(jìn)過程，可表示為下圖中哪一個(gè)()答案B導(dǎo)學(xué)號(hào) 06350415 解析本題考查對(duì)凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)原理的理解，蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量越大，越容易通過凝膠間隙而先被洗脫，蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量越小則易進(jìn)入凝膠內(nèi)部而后被洗脫。 思 維 創(chuàng) 新 升 華 一、蛋白質(zhì)分子在凝膠中的運(yùn)動(dòng)情況分析特別提示：凝膠色譜的原理是相對(duì)分子質(zhì)量小的蛋白質(zhì)進(jìn)入凝膠孔道，路程長，移動(dòng)速度慢；而相對(duì)分子質(zhì)量大的蛋白質(zhì)在凝膠外部移動(dòng)，路程短，移動(dòng)快，這種現(xiàn)象又稱分子篩效應(yīng)。相對(duì)分子質(zhì)量大相對(duì)分子質(zhì)量小直徑大小大于凝膠顆?？障吨睆叫∮谀z顆?？障吨睆竭\(yùn)動(dòng)方式垂直向下運(yùn)動(dòng)無規(guī)則的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)運(yùn)動(dòng)速度較快較慢運(yùn)動(dòng)路程較短較長洗脫次序先從凝膠柱中洗脫出來后從凝膠柱中洗脫出來 二、樣品處理、分離與純化的目的不同目的紅細(xì)胞洗滌去除雜質(zhì)，如血漿蛋白血紅蛋白釋放使紅細(xì)胞破裂，釋放血紅蛋白分離血紅蛋白溶液經(jīng)過離心使血紅蛋白與其他雜質(zhì)分離開透析除去樣品中相對(duì)分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)純化除去相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì) 知 識(shí) 體 系 構(gòu) 建 答案較慢較快pH帶電性質(zhì)凝膠色譜法