2019-2020年高三生物總復(fù)習(xí) 第45講DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)教案【考綱要求】 生物技術(shù)在其它方面的應(yīng)用考綱要求具體內(nèi)容(3)PCR技術(shù)的基本操作和應(yīng)用(4)蛋白質(zhì)的提取和分離 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容(3)血紅蛋白的提取和分離操作實(shí)驗(yàn)與探究能力【考點(diǎn)分析】 考點(diǎn) 試卷類型 題型PCR技術(shù)的基本操作和應(yīng)用 xx江蘇生物非選擇題xx江蘇生物選擇題【考點(diǎn)預(yù)測(cè)】 從近幾年高考試題看，有關(guān)植物的組織培養(yǎng)內(nèi)容是命題的重點(diǎn)。預(yù)測(cè)今年高考命題可能會(huì)從下面兩個(gè)方面展開(kāi)：1植物組織培養(yǎng)和花藥離體培養(yǎng)的原理、方法、操作步驟、注意事項(xiàng)等2PCR技術(shù)的基本操作和應(yīng)用 3蛋白質(zhì)的提取和分離原理、過(guò)程及其注意事項(xiàng) 從近幾年新課標(biāo)改革地區(qū)生物試題看，主要考查植物組織堵喬的原埋、近程及影響因素，以非選擇題為主。由于近兩年考查面的增加，賦分也有所增加的趨勢(shì)。以07年到08年逐漸增多。命題角度的最大變化應(yīng)該是以過(guò)程圖和表格形式等多種表達(dá)形式考查學(xué)生對(duì)知識(shí)的掌握程度和識(shí)圖能力?？傮w上來(lái)說(shuō)本單元的考查難度較低，且作為選做題出現(xiàn)為主。在復(fù)習(xí)的過(guò)程中，要多加強(qiáng)識(shí)記，同時(shí)注意實(shí)驗(yàn)探究能力的培養(yǎng)?！局R(shí)梳理】一、 DNA的粗體取與鑒定1、 提取DNA的方法2、 DNA的鑒定3、 設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程二、DNA體外擴(kuò)增技術(shù)1、 PCR原理2、 PCR的反應(yīng)過(guò)程3、 DNA含量的鑒定三、血紅蛋白的提取和分離【重點(diǎn)解析】一、DNA的粗提取和鑒定1DNA的理化性質(zhì) (1)DNA的溶解性 DNA和蛋白質(zhì)等其他成分在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，利用這一特點(diǎn)，選擇適當(dāng)?shù)柠}濃度就能使DNA充分溶解，而使雜質(zhì)沉淀，或者相反，以達(dá)到分離目的。此外，DNA不溶于酒精溶液，但是細(xì)胞中的某些成分如蛋白質(zhì)等卻溶于酒精，利用這一原理，可將DNA與蛋白質(zhì)等進(jìn)一步地分離。 (2)DNA對(duì)酶、高溫和洗滌劑的耐受性 蛋白酶能水解蛋白質(zhì)，但是對(duì)DNA沒(méi)有影響。大多數(shù)蛋白質(zhì)不能忍受6080的高溫，而DNA在80以上時(shí)才會(huì)變性，洗滌劑能夠溶解細(xì)胞膜，但對(duì)DNA沒(méi)有影響。 (3)DNA的熱變性 DNA分子在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制或轉(zhuǎn)錄時(shí)，在解旋酶的作用下使氫鍵斷裂，而在體外，DNA在80l00的溫度范圍內(nèi)變性，即雙螺旋解開(kāi)，成為單鏈；當(dāng)溫度慢慢降低后，兩條彼此分離的單鏈又會(huì)重新結(jié)合形成雙鏈。但高溫能使DNA聚合酶變性失活，后來(lái)發(fā)現(xiàn)了耐高溫的TaqDNA聚合酶，解決了上述矛盾。 2基本原理 (1)DNA在不同濃度的NaCl溶液中的溶解度不同，在014 molL的NaCl溶液中的溶解度最低，如下表所示由上表可以看出，在NaCl溶液物質(zhì)的量濃度為2 mo1L時(shí)，DNA溶解，部分蛋白質(zhì)發(fā)生鹽析而生成沉淀，通過(guò)過(guò)濾可除去部分蛋白質(zhì)；在NaCl溶液物質(zhì)的量濃度為014 m01L時(shí)，DNA析出，過(guò)濾可除去溶解的部分蛋白質(zhì)。 (2)DNA不溶于酒精溶液加入體積分?jǐn)?shù)為95的冷卻酒精溶液可使DNA析出，除去溶于酒精的蛋白質(zhì)。 (3)DNA不被蛋白酶所水解嫩肉粉中含木瓜蛋白酶，加入嫩肉粉可使蛋白質(zhì)水解而DNA不被水解。 (4)DNA可被二苯胺染成藍(lán)色向含DNA的試管中加入二苯胺并沸水浴，溶液呈現(xiàn)藍(lán)色可確認(rèn)DNA。 3方法步驟 (1)實(shí)驗(yàn)材料的選擇 首先選擇含有DNA的生物材料。 選用DNA含量相對(duì)較高的生物組織，成功率較大。 (2)破碎細(xì)胞獲取含DNA的濾液 動(dòng)物細(xì)胞如雞血細(xì)胞在血細(xì)胞液中加入蒸餾水，用玻璃棒攪拌，過(guò)濾后收集濾液即可。 植物細(xì)胞用洗滌劑溶解細(xì)胞膜，進(jìn)行充分?jǐn)嚢韬脱心?，過(guò)濾后收集濾液。 (3)去除濾液中的雜質(zhì) 方案利用DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，通過(guò)控制NaCl溶液的濃度去除雜質(zhì)(用2 molI。NaCl溶液過(guò)濾除去不溶的雜質(zhì)，用014 molI。NaCl溶液析出DNA，過(guò)濾，除去溶液中的雜質(zhì)，再用2 molL NaCl溶液溶解DNA)。 方案在濾液中加入嫩肉粉，利用其蛋白酶水解蛋白質(zhì)。 方案將濾液放入6075恒溫水浴箱中保溫1015 rain，使蛋白質(zhì)變性。 (4)DNA的析出與鑒定 析出：將處理后的溶液過(guò)濾，加入與濾液等體積的冷卻酒精溶液(體積分?jǐn)?shù)為95)靜置，溶液中會(huì)出現(xiàn)白色絲狀物(此即粗提取的DNA)，用玻璃棒沿一個(gè)方向攪拌卷起絲狀物。 鑒定【例1】關(guān)于“DNA的粗提取與鑒定”的實(shí)驗(yàn)裝置如圖(1)實(shí)驗(yàn)材料選用雞血細(xì)胞液，而不用雞全血。主要原因是雞血細(xì)胞液中 含量較高。(2)在圖A所示的實(shí)驗(yàn)步驟中加蒸餾水20 mL的目的是 通過(guò)圖B所示的步驟取得濾液，再在濾液中加入2mol/l NaCl溶液的目的是 圖C所示實(shí)驗(yàn)中加蒸餾水的目的是 。(3)為鑒定實(shí)驗(yàn)所得絲狀物的主要成分是DNA，可滴加 溶液，結(jié)果絲狀物被染成綠色。解析：(1)雞血細(xì)胞中含較多的DNA，而血漿中不合DNA，因此，實(shí)驗(yàn)材料應(yīng)用雞血細(xì)胞液而不用雞全血。(2)要明確區(qū)別兩次加蒸餾水的目的，第一次目的是讓雞血細(xì)胞吸水漲破，放出DNA，第二次加蒸餾水是為了降低NaCl溶液的濃度，使溶解于2 molL_1 NaCl溶液中的DNA析出。(3)本題考查DNA的鑒定，可以加二苯胺沸水浴變藍(lán)色，也甲基綠使DNA變綠色，本題干無(wú)沸水浴這一條件，且結(jié)果是絲狀物變綠色，所以使用的試劑為甲基綠。答案：(1)DNA(2)使血細(xì)胞吸水漲破，放出DNA使濾液中的DNA溶于鹽溶液 使DNA析出(3)甲基綠二、PCR技術(shù)1生物體內(nèi)DNA復(fù)制與PCR反應(yīng)的區(qū)別 體內(nèi)DNA復(fù)制 PCR反應(yīng)，時(shí)期細(xì)胞有絲分裂間期或減數(shù)第一次分裂間期及無(wú)絲分裂、二分裂過(guò)程 體外隨時(shí)進(jìn)行 場(chǎng)所 細(xì)胞內(nèi) 微量離心管內(nèi)解旋在解旋酶作用下，細(xì)胞提供能量，部分解開(kāi)加熱至90，雙鏈全部解開(kāi)，不需解旋酶引物一小段RNA可以是RNA或單鏈DNA分子片段合成子鏈在引物基礎(chǔ)上，一條鏈連續(xù)合成，另一條鏈不連續(xù)合成分別從兩條鏈的引物端開(kāi)始，都是連續(xù)合成，控制溫度72特點(diǎn)邊解旋邊復(fù)制，半保留復(fù)制 體外迅速擴(kuò)增DNA聚合酶需DNA聚合酶需耐高溫的Taq DNA聚合酶循環(huán)次數(shù) 受生物體自身控制30多次 相同點(diǎn) 需提供DNA復(fù)制的模板 四種脫氧核苷酸作原料 子鏈延伸的方向都是從5端到3端2 PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA片段 (1)原理：DNA復(fù)制。 (2】需要條件：模板DNA、RNA引物、四種脫氧核苷酸、熱穩(wěn)定DNA聚合酶(Taq酶)、離子。 (3)方法：DNA受熱變性解旋為單鏈、冷卻后RNA引物與單鏈相應(yīng)互補(bǔ)序列結(jié)合、在DNA聚合酶作用下延伸合成互補(bǔ)鏈。 (4)特點(diǎn)：指數(shù)形式擴(kuò)增。 (5)過(guò)程：變性、復(fù)性、延伸、重復(fù)。步驟名稱 需要溫度 過(guò)程 第一步變性9095將反應(yīng)體系(包括雙鏈模板、引物、耐高溫的DNA聚合酶、四種脫氧核糖核苷酸以及酶促反應(yīng)所需的離子等)加熱至9095，使雙鏈DNA模板兩條鏈之間的氫鍵打開(kāi)，變成單鏈DNA，作為互補(bǔ)鏈聚合反應(yīng)的模板第二步復(fù)性5560將反應(yīng)體系降溫至5560，使兩種引物分別與模板DNA鏈3端的互補(bǔ)序列互補(bǔ)配對(duì)，這個(gè)過(guò)程稱為復(fù)性第三步延伸合成7075將反應(yīng)體系升溫至7075，在耐高溫的DNA聚合酶催化作用下，將與模板互補(bǔ)的單個(gè)核苷酸加到引物所提供的3 7一OH上，使DNA鏈延伸，產(chǎn)生一條與模板鏈互補(bǔ)的DNA鏈。 (6)結(jié)果：上述三步反應(yīng)完成后，一個(gè)DNA分子就變成了兩個(gè)DNA分子，隨著重復(fù)次數(shù)的增多，DNA分子就以2”的形式增加。PCR的反應(yīng)過(guò)程都是在PCR擴(kuò)增儀中完成的?！纠?】2008年5月20日，民政部制訂汶川大地震遇難人員遺體處理意見(jiàn)時(shí)指出，無(wú)法確認(rèn)遇難者身份的，由公安部門(mén)提取可供DNA檢驗(yàn)的檢材以便后身份辨認(rèn)。事后的遺體辨認(rèn)可借助于DNA雜交技術(shù)，即從遺體細(xì)胞與死者家屬提供的死者生前生活用品中分別提取DNA，然后借助DNA雜交技術(shù)對(duì)遺體進(jìn)行確認(rèn)。請(qǐng)回答下列問(wèn)題： (1)為了確保辨認(rèn)的準(zhǔn)確性，需要克隆出較多的DNA樣品，這需要借助PCR技術(shù)。使用PCR技術(shù)的具體實(shí)驗(yàn)操作順序是：按配方準(zhǔn)備好各組分 離心使反應(yīng)液集中在離心管底部一設(shè)計(jì)好PCR儀的循環(huán)程序一進(jìn)行PCR反應(yīng)。在該操作過(guò)程中應(yīng)特別注意的問(wèn)題是 (2)如表所示為分別從死者遺體和死者生前的生活用品中 提取的三條相同染色體上的同一區(qū)段DNA單鏈的堿基序列，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)情況進(jìn)行判斷，A、B、C三組DNA中不是同一人的是 A組 B組 C組遺體中的DNA堿基序列ACTGACGGTTGGCTTATCGAGCAATCGTGC家屬提供的DNA堿基序列TGACTGCCAACCGAATAGCACGGTAAGACG(3)為什么從死者體細(xì)胞與死者家屬提供的其生前生活用品中分別提取的DNA可以完全互補(bǔ)配對(duì)?解析：從遺體細(xì)胞和死者家屬提供的死者生前的生活用品中分別提取DNA，在一定溫度下，水浴共熱，使DNA氫鍵斷裂，雙鏈打開(kāi)。若兩份DNA樣本來(lái)自同一個(gè)體，在溫度降低時(shí)，兩份樣本中的DNA單鏈通過(guò)氫鍵連接在一起，若不是來(lái)自同一個(gè)體，則兩份樣本中的DNA單鏈在一定程度上不能互補(bǔ)，DNA雜交技術(shù)就是通過(guò)這一過(guò)程對(duì)面目全非的死者進(jìn)行辨認(rèn)的。答案：(1)用微量移液器在微量離心管中依次加入各組分PCR實(shí)驗(yàn)使用的微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌(2)B、C(3)人體所有體細(xì)胞均由一個(gè)受精卵經(jīng)有絲分裂產(chǎn)生，其細(xì)胞核中均含有相同的遺傳物質(zhì)三、血紅蛋白的提取和分離1實(shí)驗(yàn)原理 (1)蛋白質(zhì)各種特性(如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)和對(duì)其他分子的親和力等)的差異，可以用來(lái)分離不同種類的蛋白質(zhì)。 (2)有效方法凝膠色譜法：根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)。 凝膠是由多糖類化合物構(gòu)成的微小的多孔球體，內(nèi)部有許多貫穿的通道。 相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)通過(guò)凝膠時(shí)，相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較慢；而相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)，無(wú)法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動(dòng)，路程較短，移動(dòng)速度較快。相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子因此得以分離。 (3)電泳：蛋白質(zhì)等生物大分子都具有可解離的基團(tuán)，在一定的pH下會(huì)帶上正電或負(fù)電。在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng)。故電泳可利用待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身大小、形狀的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。 2實(shí)驗(yàn)操作程序(2)粗分離透析 將盛有1 mL血紅蛋白溶液的透析袋放入盛有300 mL的物質(zhì)的量濃度為20 mm01L的磷酸緩沖液中透析12 h，去除樣品中的小分子雜質(zhì)。(3)純化采用凝膠色譜法對(duì)血紅蛋白進(jìn)行分離和純化 (4)純度鑒定：一般用SDS一聚丙烯酰胺凝膠電泳方法，來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量，即對(duì)血紅蛋白進(jìn)行純度鑒定。【例3】紅細(xì)胞含有大量的血紅蛋白，紅細(xì)胞的機(jī)能主要是由血紅蛋白完成，血紅蛋白的主要功能是攜帶氧氣或二氧化碳，我們可以選用豬、牛、羊或其他脊椎動(dòng)物的血液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，來(lái)提取和分離血紅蛋白，請(qǐng)回答下列有關(guān)問(wèn)題： (1)以上所述的過(guò)程即是樣品處理，它包括 、 、分離血紅蛋白溶液。 (2)收集的血紅蛋白溶液在透析袋中可以經(jīng)過(guò)透析，這就是樣品的粗分離。 透析的目的是 。 透析的原理是 。 (3)然后通過(guò)凝膠色譜法將樣品進(jìn)一步純化，最后經(jīng)SDS一聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行純度鑒定。 樣品純化的目的是 。血紅蛋白有什么特點(diǎn)? 。這一特點(diǎn)對(duì)進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離有什么意義? 解析：蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。為防止血液凝固，在采血容器中要預(yù)先加入抗凝血?jiǎng)幟仕徕c。透析可以去除樣品中相對(duì)分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)，或用于更換樣品的緩沖液，透析袋一般是用硝酸纖維素(又稱玻璃紙)制成的，能使小分子自由進(jìn)出，而將大分子保留在袋內(nèi)。血紅蛋白因含血紅素而呈現(xiàn)紅色，在凝膠色譜分離時(shí)，可以通過(guò)觀察顏色來(lái)判斷什么時(shí)候應(yīng)該收集洗脫液，使血紅蛋白的分離過(guò)程非常直觀，大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作。答案：(1)紅細(xì)胞的洗滌血紅蛋白的釋放(2)去除樣品中相對(duì)分子質(zhì)量較小的雜質(zhì) 透析袋能使小分子自由進(jìn)出，而大分子則保留在袋內(nèi)(3)通過(guò)凝膠色譜法將相對(duì)分子質(zhì)量較大的雜蛋白除去血紅蛋白呈現(xiàn)紅色，在凝膠色譜分離時(shí)，可以通過(guò)觀察顏色來(lái)判斷什么時(shí)候應(yīng)該收集洗脫液 使血紅蛋白的分離過(guò)程非常直觀，大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作【實(shí)戰(zhàn)訓(xùn)練】（09江蘇卷）23下列關(guān)于DNA和蛋白質(zhì)提取與分離實(shí)驗(yàn)的敘述，正確的有 A提取細(xì)胞中的DNA和蛋白質(zhì)都需用蒸餾水漲破細(xì)胞 B用不同濃度NaCl溶液反復(fù)溶解與析出DNA可去除蛋白質(zhì)C蛋白質(zhì)提取和分離過(guò)程中進(jìn)行透析可去除溶液中的DNAD蛋白質(zhì)和DNA都可以用電泳的方法進(jìn)行分離純化 答案：BD解析：A選項(xiàng)，在提取DNA時(shí)，如果是用動(dòng)物的細(xì)胞需要用蒸餾水漲破，如果用植物細(xì)胞則不需要，而是用洗滌劑溶解細(xì)胞膜；用2 molL的NaCl溶液溶解DNA，然后過(guò)濾出蛋白質(zhì)，再降低NaCl溶液的濃度，析出DNA。DNA和蛋白質(zhì)樣品都是帶負(fù)電荷的，從負(fù)極向正極移動(dòng)，移動(dòng)的距離都和樣品的分子量有關(guān)。C中透析用以出去小分子物質(zhì)，DNA是大分子物質(zhì)，D是常規(guī)方法比如用十二烷基磺酸鈉，可以根據(jù)其分子大小及所帶電荷性質(zhì)進(jìn)行分離純化【名師點(diǎn)撥】關(guān)鍵解讀PCR技術(shù)中的變性、復(fù)性與延伸(1)變性：當(dāng)溫度上升到90以上時(shí)，雙鏈DNA解旋為單鏈，如圖： (2)復(fù)性：當(dāng)溫度下降至50左右時(shí)，兩種引物通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合，如圖：(3)延伸：當(dāng)溫度上升至72左右，溶液中的四種脫氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈，如圖：