目 錄一、概 述 二、試驗準備三、試驗步驟 四、再驗證周期 n概 述 一、概述1、試驗目的：用微生物侵入試驗對凍干粉針劑車間軋蓋密封系統(tǒng)進行挑戰(zhàn)性試驗，以確認軋蓋后容器密封系統(tǒng)的完好性。2、試驗概述：取西林瓶灌裝入已滅菌培養(yǎng)基，在正常生產(chǎn)線上抽真空、壓塞、軋蓋。此后，將容器密封面浸入高濃度運動性菌液中，取出并檢查是否有微生物侵入，以確認容器密封系統(tǒng)的完好性。同時，須做陽性對照試驗，確認培養(yǎng)基的促菌生長能力。 試驗準備試驗準備洗 瓶膠塞處理培養(yǎng)基菌懸液 二、試驗準備 批量：1000瓶/批1、洗瓶: 清洗西林瓶1100只，經(jīng)305干熱滅菌12分鐘后送至灌裝間備用。2、膠塞處理: 清洗膠塞1100只，經(jīng)121 濕熱滅菌20分鐘后備用。 3.1 預先對配制、灌裝系統(tǒng)按照凍干粉針劑無菌操 作要求進行清潔、滅菌。3.2 按照培養(yǎng)基生產(chǎn)廠商要求，每批按 TSB（胰 酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基）32.3g，加1L注射用水 的比例進行配制，加熱溶解并標定至4.5L，置 于滅菌柜中用純蒸 汽121滅菌20min。二、試驗準備 3、配制培養(yǎng)基: 二、試驗準備 3.3將滅菌后的培養(yǎng)基（TSB配制液）通過 未裝濾膜及濾芯的過濾系統(tǒng)，在灌裝機 的數(shù)控器上調(diào)節(jié)好裝量（3.5ml）進行灌 裝半加塞。3.4將灌裝半加塞的培養(yǎng)基在百級層流保護下轉(zhuǎn)移至凍干機內(nèi)抽真空，結束后全壓塞、出箱、軋蓋。 4、制備微生物菌懸液：4.1從銅綠假單胞菌（ATCC 9027）的新鮮斜面上取一整環(huán)培養(yǎng)物，分別接入含6ml無菌培養(yǎng)基的試管中，在3035下培養(yǎng)1824h。4.2將每管的培養(yǎng)物分別轉(zhuǎn)入含600ml相同培養(yǎng)基的容器內(nèi)，于3035下培養(yǎng)1824h。在培養(yǎng)結束時，能明顯見容器內(nèi)培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁。4.3在微生物侵入試驗開始時，所用菌懸液濃度（活菌數(shù)）必須達到110 6CFU/ml。 二、試驗準備 試驗步驟n營養(yǎng)試驗n微生物侵入試驗n陽性對照實驗n微生物侵入試驗后 營養(yǎng)試驗 三、試驗步驟1.1從1000瓶培養(yǎng)基中取150瓶作為本次試驗的試樣品。1.2用剪刀輕輕從斜側面去除至少50瓶試樣品的整個鋁蓋（注意不要破壞其密封口，將去鋁蓋時不慎損壞容器密封性的所有試樣品剔除），另取80瓶帶蓋試樣品，將每一試樣品倒轉(zhuǎn)，使培養(yǎng)基與西林瓶內(nèi)表面及膠塞充分接觸，在3035豎立倒置培養(yǎng)14天。1、試驗樣品的制備: 三、試驗步驟1.3在培養(yǎng)期內(nèi)，當試驗中發(fā)現(xiàn)任何帶蓋試樣品長菌時，則試驗無效，須棄去全部試樣品，重新從頭開始試驗。 2.1所有試樣品培養(yǎng)14天均不長菌時，從上述1.2 試樣品中隨機取20個帶蓋試樣品，每個試樣 品內(nèi)接種100CFU銅綠假單胞菌。在3035 下培養(yǎng)7天，或培養(yǎng)至所有試樣品都呈陽性結 果。 三、試驗步驟2、確認培養(yǎng)基促菌生長能力營養(yǎng)試驗： 2.1.1若7天內(nèi)，所有接種銅綠假單胞菌的試樣品中，微生物生長良好，則容器內(nèi)培養(yǎng)基的促菌生長能力可判為合格。使用革蘭染色后，并置于紫外燈下，培養(yǎng)基呈藍綠色熒光，則確認試樣品容器內(nèi)生長的菌為接入的銅綠假單胞菌，即為陽性。 2.1.2若7天內(nèi)，所有接種銅綠假單胞菌的試樣品中，微生物生長條件不好或經(jīng)鑒別后受其它菌種污染，則試驗失敗，需重新作營養(yǎng)試驗。三、試驗步驟 3、微生物侵入試驗操作步驟: 微生物培養(yǎng)及侵入試驗應在不影響生產(chǎn)環(huán)境的地方（中心化驗室陽性室）進行。三、試驗步驟 3.1 將新鮮的銅綠假單胞菌（ATCC 9027）的 菌懸液倒入適當?shù)娜萜鲀?nèi)，用試管架固定 試樣品。三、試驗步驟3.2 從上述1.2試樣品中再取50只帶蓋試樣品為 A組，另取25個去蓋 試樣品為B組，均倒 置于菌懸液中,使試樣容器內(nèi)的培養(yǎng)基充 分接觸封口內(nèi)表面，試樣品的頸部及封口 的外表面應完全浸泡在菌懸液中（如下圖 1所示）。 圖1微生物挑戰(zhàn)試驗示意圖三、試驗步驟 3.3將A組和B組試樣品在菌懸液中持續(xù)浸泡約4h后，取出試樣品，擦干試樣品容器外殘余的菌懸液，其外表用含0.5%過乙酸的70%異丙醇消毒五分鐘（注意不要破壞其密封口）。三、試驗步驟3.4從1.2試樣品中另取有蓋和去蓋的培養(yǎng)基各兩 個，做陽性對照。陽性對照試樣品不經(jīng)菌懸 液浸泡，其外表用含0.5%過乙酸的70%異丙 醇消毒五分鐘后，接種10100CFU銅綠假單 胞菌，按營養(yǎng)試驗的步驟進行陽性對照試驗。 3.5將消毒后的試樣品放入塑料袋中，置3035下培養(yǎng)7天。檢查試樣品內(nèi)微生物生長情況，有生長記作“”，無生長記作“”。三、試驗步驟3.5.1如果試樣品長菌，則按照2.1所述方法確認生 長菌是挑戰(zhàn)微生物銅綠假單胞菌。 3.5.2 如果所有試樣品均不長菌，則從浸過菌懸液的A組試樣中取10甁，B組試樣中取5瓶，按2.所述方法對試樣品進行營養(yǎng)性試驗。 三、試驗步驟3.6微生物侵入試驗用菌懸液經(jīng)滅菌后丟棄。 4.1步驟2、3.4中進行的營養(yǎng)試驗和3.5.2中進行的陽性對照試驗都合格，微生物侵入試驗才有效。三、試驗步驟4、結果評價: 4.2挑戰(zhàn)試驗中A組和B組如有長菌，需記錄長菌的試樣數(shù)。在A組中如出現(xiàn)長菌，則須按下述要求作進一步調(diào)查。4.2.1仔細去除微生物生長的容器的蓋和塞，檢查容器封口是否有缺損，造成微生物侵入。 4.2.2將觀察到試樣品封口的缺陷，采用拍照或其他適當方式詳細記錄。三、試驗步驟 4.3如果任何挑戰(zhàn)試驗中長菌的試樣品不是由于容器封口明顯的物理性缺損所致，容器密封性挑戰(zhàn)試驗作失敗論。 三、試驗步驟 5、貯存穩(wěn)定性:5.1將剩余未經(jīng)挑戰(zhàn)試驗的容器放入箱中，保存在室溫黑暗處；5.2在適當?shù)臅r間間隔（如12個月、24個月）取出一些容器，重復挑戰(zhàn)性試驗（步驟同上）。 三、試驗步驟 再驗證周期 四、再驗證周期1、當軋蓋設備發(fā)生變化時應進行再驗證;2、改變膠塞、西林瓶及鋁蓋尺寸、材質(zhì) 時應進行再驗證。