CIL病毒分離技術(shù)_乙肝病毒,北京京科肝泰醫(yī)院,病毒性肝炎在我國(guó)各類傳染病中發(fā)病率最高 HBV攜帶者最終死于相關(guān)肝病的危險(xiǎn)性，男性為50%，女性為15%，與男性病人的病毒不易被清除及吸煙、飲酒等相關(guān) 中國(guó)的慢性乙肝病人中25%40%最終死于肝硬化或合并肝癌；,乙肝是一類大病，在我國(guó)感染人數(shù)有1到2億，目前國(guó)內(nèi)或者國(guó)外對(duì)于乙肝的治療主要方法還是抗病毒保肝護(hù)肝的治療。然而，患者的病情往往會(huì)反反復(fù)復(fù)，即使對(duì)于患者的病情控制的非常得當(dāng)，也只能在一段時(shí)間內(nèi)起到較好的效果。如何能夠徹底的治愈，現(xiàn)在還沒(méi)有很好的方案。,肝癌30-50萬(wàn) 肝硬化500萬(wàn) 慢性重型肝炎50-100萬(wàn) 慢性遷延性肝炎階段1000萬(wàn) HBV攜帶者一億九千萬(wàn),傳染源：主要為急、慢性乙肝患者或病毒攜帶者 傳播途徑：是通過(guò)血液傳播，大多數(shù)情況通過(guò)注射；二是通過(guò)母嬰傳播；其次性傳播。垂直傳播是我國(guó)HBV感染的主要模式.,流行病學(xué)特征,2003年的一項(xiàng)調(diào)查表明隨著社會(huì)發(fā)展、醫(yī)療技術(shù)條件的改進(jìn)、人民生活方式的變遷，通過(guò)生活密切接觸傳播已越來(lái)越成為乙肝的主要傳播方式 乙肝不會(huì)通過(guò)水和食物以及通常的接觸傳播的（不過(guò)不能合用剪刀，指甲鉗，牙刷等）,乙肝病毒的傳播,7,感染者年齡高峰：低發(fā)病區(qū)：2040歲 高發(fā)病區(qū)：48歲 男女感染率相近，但發(fā)病者男多于女 感染時(shí)年齡越小，越易形成慢性肝炎、肝硬化或慢性HBV攜帶狀態(tài)（免疫耐受） 感染后對(duì)相同HBsAg亞型的HBV再感染有持久免疫力，但對(duì)不同亞型的保護(hù)力不完全,易感人群,潛伏期：26個(gè)月 臨床類型：嬰幼兒期感染近90%轉(zhuǎn)為慢性，成年人感染85%以上可痊愈，10%左右轉(zhuǎn)為慢性 痊愈 痊愈 靜止性肝硬化,乙肝臨床特點(diǎn),急性感染,慢性乙型肝炎,肝硬化,肝癌,死亡,慢性攜帶者,肝硬化,死亡,三部曲：肝硬化、慢性乙肝、肝癌,乙肝預(yù)后,慢性乙肝,肝硬化,肝癌,10%,10%,乙肝五項(xiàng)：HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb HBV-DNA：血液中最先能被檢驗(yàn)出來(lái)（感染一周內(nèi)），但其檢測(cè)比較昂貴,乙肝檢測(cè),HBV-DNA（）是病毒感染的直接證據(jù) （）提示病毒復(fù)制水平低或已清除,接種疫苗是最好的方法,13,乙肝預(yù)防,安全注射（包括針具），對(duì)牙科器械、內(nèi)鏡等醫(yī)療器具應(yīng)嚴(yán)格消毒，嚴(yán)格防止醫(yī)源性傳播 服務(wù)行業(yè)中的理發(fā)、刮臉、修腳、穿刺和文身等用具也應(yīng)嚴(yán)格消毒 注意個(gè)人衛(wèi)生，不共用剃須刀和牙具等用品。進(jìn)行正確的性教育，若性伴侶HBsAg陽(yáng)性者應(yīng)接種乙型肝炎疫苗 對(duì)HBsAg陽(yáng)性的孕婦，應(yīng)避免羊膜腔穿刺，并縮短分娩時(shí)間，保證胎盤的完整性，盡量減少新生兒暴露于母血的機(jī)會(huì),傳播途徑預(yù)防,診斷急性或慢性乙型肝炎患者時(shí)，應(yīng)按照中華人民共和國(guó)傳染病防治法，及時(shí)向當(dāng)?shù)丶膊☆A(yù)防控制中心（CDC）報(bào)告，并應(yīng)注明是急性乙型肝炎或慢性乙型肝炎 建議對(duì)患者的家庭成員及其他密切接觸者進(jìn)行血清HBsAg、抗-HBc和抗-HBs檢測(cè)，并對(duì)其中的易感者（該3種標(biāo)志物均陰性者）接種乙型肝炎疫苗,對(duì)患者和攜帶者的管理,根據(jù)病情確定是否住院或在家治療 患者用過(guò)的醫(yī)療器械及用具（如采血針、針灸針、手術(shù)器械、劃痕針、探針、各種內(nèi)鏡及口腔科鉆頭等）應(yīng)嚴(yán)格消毒 尤其應(yīng)加強(qiáng)對(duì)帶血污染物的消毒處理,乙肝患者的處理,不能獻(xiàn)血及從事國(guó)家法律規(guī)定的特殊職業(yè)（如服兵役等） 可照常生活、學(xué)習(xí)和工作，要加強(qiáng)隨訪 傳染性高低，主要取決于血液中HBV-DNA水平，與血清ALT、AST或膽紅素水平無(wú)關(guān),慢性HBV攜帶者及HBsAg攜帶者的處理,乙型肝炎病毒簡(jiǎn)稱乙肝病毒，也稱丹氏顆粒，顆粒分為外殼和核心兩部分。它是一種DNA病毒，屬于嗜肝DNA病毒科，這是一種傳染性很強(qiáng)的病毒，它可以通過(guò)血液、精液和其他體液進(jìn)行傳播。乙型肝炎病毒治療主要以適當(dāng)休息和合理營(yíng)養(yǎng)為主，加上抗病毒藥物治療。,HBV病毒介紹,以肝臟為主要靶器官，對(duì)肝臟有親嗜性，引起肝臟炎癥的病毒。,感染乙肝病毒的病人血清中有三種不同形態(tài)的顆粒，分別為大球形顆粒(直徑42nm)、小球形顆粒(直徑22nm)和管形顆粒(直徑22nm)。,大球形顆粒又稱Dane顆粒，是1970年Dane首先用電鏡在乙肝病人血清中發(fā)現(xiàn)的。Dane顆粒是有感染性的完整HBV顆粒，呈球形，具有雙層衣殼。外衣殼由來(lái)自宿主的脂質(zhì)雙層和包膜蛋白組成，有大約400個(gè)HBV表面抗原（HBsAg）即蛋白鑲嵌于脂質(zhì)雙層中。用離子去垢劑處理病毒顆粒，去除病毒外衣殼后，暴露出內(nèi)層核心。核心的表面為病毒的內(nèi)衣殼，內(nèi)衣殼蛋白為HBV核心抗原（HBcAg）。HBcAg經(jīng)酶或去垢劑作用后可暴露出e抗原(HBeAg)。核心顆粒中間包裹著雙鏈DNA分子、DNA聚合酶（P蛋白）等。,而小球形顆粒和由小球形顆粒串聯(lián)而成的管形顆粒均由病毒的包膜蛋白構(gòu)成，不含病毒基因組，因而不具有感染性，被稱為亞病毒顆粒。,HBV 感染與復(fù)制過(guò)程 感染途徑 乙型肝炎病毒無(wú)論通過(guò)哪個(gè)途徑，乙肝病毒進(jìn)入血液循環(huán)在體內(nèi)流動(dòng)，會(huì)經(jīng)過(guò)人體的一個(gè)非特異性免疫清除，在血液循環(huán)里面要經(jīng)過(guò)吞噬細(xì)胞的吞噬。病毒在循環(huán)中突破了這些屏障，游離到它需要復(fù)制的靶位，即肝細(xì)胞。病毒進(jìn)入肝細(xì)胞復(fù)制，首先要使肝細(xì)胞接受它，也就是說(shuō)肝細(xì)胞上要有受體與病毒結(jié)合。病毒可以依靠肝細(xì)胞的細(xì)胞膜的某一部分，通過(guò)胞引作用進(jìn)到肝細(xì)胞內(nèi)。病毒可以在此釋放核酸，核酸在肝細(xì)胞內(nèi)依靠細(xì)胞內(nèi)的原料進(jìn)行復(fù)制和合成。,復(fù)制與免疫應(yīng)答 病毒一旦在肝細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，肝細(xì)胞就會(huì)有核酸出現(xiàn)，核酸產(chǎn)生后核心抗原就會(huì)相應(yīng)的出現(xiàn)。核心抗原會(huì)包裹核酸，但由于核酸分子較小，包裹以后會(huì)有多余的一部分結(jié)構(gòu)。多余的部分可以被核內(nèi)的一些酶切掉，這一部分就是 E 抗原。因此 E 抗原的存在就是乙肝病毒復(fù)制的一個(gè)標(biāo)志。 E 抗原從肝細(xì)胞釋放到細(xì)胞以外，血液循環(huán)里面就能夠檢測(cè)到 E 抗原的存在。人體的免疫細(xì)胞就會(huì)通過(guò)免疫的應(yīng)答產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，即 E 抗體。在病毒復(fù)制的初期， E 抗原產(chǎn)生的量要大于抗體，因此這時(shí)檢測(cè)到的是 E 抗原而 E 抗體檢測(cè)不到。,免疫損傷 人體除在血液循環(huán)內(nèi)對(duì)抗原進(jìn)行應(yīng)答之外，含有病毒復(fù)制的肝細(xì)胞還會(huì)有細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的一些變化。這些變化可以誘導(dǎo)人體的免疫細(xì)胞，對(duì)有病毒的肝細(xì)胞進(jìn)行免疫應(yīng)答，從而對(duì)該細(xì)胞進(jìn)行殺傷，使肝細(xì)胞發(fā)生免疫損傷，細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)氨酶就會(huì)釋放到血液循環(huán)內(nèi)，細(xì)胞核也會(huì)破碎從而把細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)釋放出來(lái)，這就是免疫應(yīng)答的過(guò)程，導(dǎo)致了免疫損傷。因此也導(dǎo)致了我們所說(shuō)的肝功能損害，通過(guò)一些生化指標(biāo)的監(jiān)測(cè)可以監(jiān)測(cè)到肝功的損害。,cccDNA 的形成 乙肝是慢性疾病，乙肝病毒在肝細(xì)胞內(nèi)是連續(xù)傳代。病毒一旦進(jìn)入肝細(xì)胞以后就會(huì)開(kāi)始復(fù)制，復(fù)制出的病毒就會(huì)從肝細(xì)胞里面釋放出來(lái)，而釋放出來(lái)的病毒除了被人體免疫系統(tǒng)進(jìn)行識(shí)別和殺傷之外，還有一部分會(huì)再侵犯其他的肝細(xì)胞，并在其他肝細(xì)胞里面再進(jìn)行這樣的復(fù)制，如此循環(huán)。能夠在肝細(xì)胞里復(fù)制的病毒是有活性的，這種乙肝病毒它的 DNA 是松散的雙鏈結(jié)構(gòu)。它是個(gè)這種雙鏈結(jié)構(gòu)是松散的而不是閉合的環(huán)結(jié)構(gòu)。但是，有些病毒的核酸在進(jìn)到肝細(xì)胞的細(xì)胞核以后，在 DNA 聚合酶的作用下，將環(huán)形松散的缺口補(bǔ)齊，變成一個(gè)超螺旋的共價(jià)、閉合、環(huán)狀 DNA ，即 cccDNA 。,HBV cccDNA：“睡眠”的病毒 DNA cccDNA 形成之后狀態(tài)比較穩(wěn)定，可以稱其為肝細(xì)胞核內(nèi)“睡眠”的病毒 DNA ，當(dāng)病毒活躍性復(fù)制時(shí)，它又可以作為一個(gè)模塊來(lái)復(fù)制病毒。一般在每個(gè)肝細(xì)胞核內(nèi)，可以有 550 拷貝的 cccDNA 。,cccDNA 的意義 cccDNA在肝細(xì)胞內(nèi)很穩(wěn)定，只要肝細(xì)胞不被破壞很少釋放到外周血液循環(huán)，因此很難從血液中檢測(cè)。但如有大片肝細(xì)胞壞死，大量的 cccDNA 就會(huì)從細(xì)胞核內(nèi)釋放到血液循環(huán)，此時(shí)人體的免疫系統(tǒng)除對(duì)釋放的 cccDNA 有應(yīng)答外，對(duì)于人的細(xì)胞核也會(huì)產(chǎn)生抗體，即抗核抗體?？购丝贵w的存在是細(xì)胞核暴露所引起的。,是乙肝病毒的核心物質(zhì)和病毒復(fù)制的基礎(chǔ)。在病毒DNA攜帶的遺傳基因發(fā)出的“指示”下，HBVDNA分別復(fù)制出新的病毒外殼和DNA核心，隨后重新組裝，形成大量的新病毒，釋放出來(lái)繼續(xù)感染其他肝細(xì)胞。 乙肝病毒DNA是HBV感染最直接、特異性強(qiáng)和靈敏性高的指標(biāo)，HBV-DNA陽(yáng)性，提示HBV復(fù)制和有傳染性。HBV-DNA越高表示病毒復(fù)制越厲害，傳染性強(qiáng)。中國(guó)以及亞太地區(qū)乙肝治療專家均指出：乙肝病毒的持續(xù)復(fù)制是乙肝致病的根本原因，乙肝治療的根本目的是抑制病毒復(fù)制。,乙肝病毒DNA(HBV-DNA）,病毒的繁殖被稱之為“復(fù)制”，在復(fù)制的過(guò)程中，有兩個(gè)很重要的因素：一個(gè)是催化劑，另一個(gè)是模板。沒(méi)有這兩個(gè)因素，乙肝病毒就不能復(fù)制。乙肝病毒復(fù)制的“催化劑”就是乙肝病毒DNA（即HBV-DNA）聚合酶。沒(méi)有這種聚合酶的作用，乙肝病毒的復(fù)制就會(huì)停止。,檢測(cè)乙肝病毒DNA是判斷乙肝病毒有無(wú)復(fù)制的“金指標(biāo)”，它主要是用來(lái)判斷人體內(nèi)存在乙肝病毒的多少和傳染程度的。如果檢測(cè)值大于1000或者5.0e+ 002拷貝/ML。說(shuō)明乙肝病毒DNA呈陽(yáng)性，提示HBV復(fù)制和有傳染性。HBV-DNA越高表示病毒復(fù)制越厲害，傳染性強(qiáng)。這對(duì)于乙肝治療過(guò)程中的監(jiān)測(cè)，治療效果的判斷，治療方案的制定都有著重要的意義。,乙肝病毒的基因組（HBV-DNA）是由兩條螺旋的DNA鏈圍成的一個(gè)環(huán)形結(jié)構(gòu)。其中一條較長(zhǎng)負(fù)鏈已經(jīng)形成完整的環(huán)狀；另一條長(zhǎng)度較短的正鏈，呈半環(huán)狀。在感染肝細(xì)胞之后，這條半環(huán)狀的DNA鏈就會(huì)以負(fù)鏈為模板，在催化劑HBV-DNA聚合酶的作用下延長(zhǎng)，最終形成完整的環(huán)狀。這時(shí)的乙肝病毒基因組就形成了一個(gè)完全環(huán)狀的雙股DNA。把這種DNA稱做共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（即cccDNA），可以把它看作是病毒復(fù)制的原始模板。模板形成后，病毒基因會(huì)以其中的一條cccDNA為模板，利用肝細(xì)胞基因中的酶和DNA聚合酶的“催化”，一段基因又一段基因地復(fù)制，形成負(fù)鏈和正鏈。最后再裝配到一起形成新的HBV-DNA顆粒。,復(fù)制的第一步：黏附 HBV人侵人體后，依靠其外膜(表面抗原，HBsAg)能粘附在肝細(xì)胞膜上，當(dāng)然，粘附的首要條件是HBsAg先要識(shí)別肝細(xì)胞膜。一旦粘附成功，HBv的外膜也就完成了它的使命，甩掉了外膜，HBV鉆進(jìn)肝細(xì)胞內(nèi)。,復(fù)制的第二步:脫殼 HBV核心部分來(lái)到肝細(xì)胞內(nèi)，在肝細(xì)胞漿中還要脫掉它的“核殼”(核心抗原即HBcAG及E抗原即HbEAG)，這樣，就暴露出了它最核心部分，即乙肝病毒核酸(HBvDNA)，HBV大有“赤膊上陣”之意。HBVDNA包涵著乙肝病毒的全部基因，是它主宰著HBv的復(fù)制的。,復(fù)制的第三步：入核 HBvDNA從肝細(xì)胞漿內(nèi)進(jìn)入肝細(xì)胞核，在這里它要進(jìn)一步發(fā)育完善，形成了HBv的“共價(jià)閉合環(huán)狀脫氧核塘核酸”(HBvcccDNA)。這個(gè)cccDNA十分了得，它深深藏匿在肝細(xì)胞核內(nèi)，而肝細(xì)胞核外面有一層堅(jiān)韌的核膜。目前藥物都難以通過(guò)這堅(jiān)韌的核膜，因而對(duì)cccDNA也無(wú)可奈何，但cccDNA卻掌控著HBv所有的遺傳信息，指令著HBv的復(fù)制。因此現(xiàn)有的藥物想徹底消滅人體內(nèi)的HBv真比登天還難，這些藥物只能抑制HBv的繁殖或復(fù)制，“全部轉(zhuǎn)陰”也只能是一種幻想。,復(fù)制的第四步：轉(zhuǎn)錄 HBV在這一階段會(huì)以cccDNA為“模子”，像錄音帶似的把HBvcccDNA上的所有信息全都轉(zhuǎn)錄到“信息核糖核酸”(mRNA)上。這個(gè)轉(zhuǎn)錄過(guò)程需要人體內(nèi)的酶類幫忙，因?yàn)樗械牟《径疾荒茏约邯?dú)立生活必須有生物的機(jī)體幫忙，才能完成這個(gè)轉(zhuǎn)錄過(guò)程。HBv也是這樣。在人體酶類的幫助下完成它的復(fù)制環(huán)節(jié)。,復(fù)制的第五步：翻譯 在mRNA上已錄取了HBv的所有信息，然后就是“翻譯”了，其實(shí)就是開(kāi)始制造病毒蛋白。MRNA通過(guò)“翻譯”過(guò)程，可將HBv的各種蛋白制造出來(lái)，如HBv的外膜蛋白(HBsAg)、核殼蛋白(HBeAg、HBcAg)、HBvDNA多聚酶等；至此，HBv的外膜有了，HBv的核殼也有了，這些東西只是零件，飄浮游離著的，還有重要的HBv最核心部分沒(méi)有“制造”山來(lái)。,復(fù)制的第六步：逆轉(zhuǎn)錄 “逆轉(zhuǎn)錄”:把HBv的遺傳信息從DNA轉(zhuǎn)錄到RNA上叫做“轉(zhuǎn)錄”，是正常的“順轉(zhuǎn)錄”；而將HBv的遺傳信息從RNA上再轉(zhuǎn)錄到DNA上，就叫做“逆轉(zhuǎn)錄”了。那么，HBv的mRNA上的遺傳信息最后就轉(zhuǎn)錄成了HBV的DNA，這時(shí)，HBv的最核心部分(即HBvDNA)也算制造完成。,復(fù)制的第七步：組裝 從第五步和第六步的復(fù)制看來(lái)，HBv的所有零件均已制作完畢，到了第七步也就簡(jiǎn)單了，把這些零件進(jìn)行組裝，裝配妥了，HBv的復(fù)制也算大功告成了。 HBv就是這樣繁殖或復(fù)制的。看起來(lái)好像挺復(fù)雜，其實(shí)HBv復(fù)制過(guò)程是很快的一個(gè)復(fù)制周期不到48小時(shí)。復(fù)制出的下一代HBv或侵入另外的健康的肝細(xì)胞，或被釋放到血液中去，在人們抽血化驗(yàn)時(shí)也就被檢測(cè)到了。,乙肝DNA檢測(cè)數(shù)量多一般代表病情發(fā)展迅速、傳染性強(qiáng)，此時(shí)需要積極的抗病毒治療。由于HBV-DNA是乙肝病毒數(shù)量最靈敏的指標(biāo)，是乙肝治療是判斷身體內(nèi)乙肝病毒數(shù)目的一個(gè)重要而且關(guān)注的指標(biāo)。所以當(dāng)出現(xiàn)乙肝DNA檢測(cè)數(shù)量多的情況，采用快速有效殺滅乙肝病毒的療法，可以最大化的實(shí)現(xiàn)病情發(fā)展減緩，最短時(shí)間內(nèi)改善患者癥狀，從而實(shí)現(xiàn)乙肝的快速治愈。,陰性 醫(yī)生在衡量患者病情時(shí)，需要檢測(cè)血液中是否含有乙肝病毒DNA，看乙肝病毒DNA陰性還是陽(yáng)性，確定是否有感染性;而且還要檢測(cè)一下乙肝病毒的數(shù)量，就是判定感染性的高低。 乙肝病毒DNA正常值是500cop/ml，如果乙肝病毒DNA檢查結(jié)果低于500cop/ml，就結(jié)論為乙肝病毒DNA陰性，化驗(yàn)單上寫陰性，或“500cop/ml”。,乙肝病毒DNA陰性，說(shuō)明血液里的乙肝病毒含量較低，體內(nèi)病毒不活躍，處于低復(fù)制或不復(fù)制的狀態(tài)。,陽(yáng)性 乙肝HBVDNA是乙肝病毒復(fù)制的指標(biāo)，乙肝病毒HBV-DNA陽(yáng)性提示有病毒復(fù)制。HBVDNA的含量高低，提示病毒復(fù)制是否活躍。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)下限是500/ml。此項(xiàng)指標(biāo)與乙肝五項(xiàng)，肝功能，肝膽脾B超，血常規(guī)等，作為乙肝患者和乙肝病毒攜帶者病情的主要參考指標(biāo)，對(duì)于確定治療計(jì)劃以及評(píng)價(jià)療效，尤其是抗病毒治療，有重要意義。,乙肝病毒是一種部分雙鏈DNA(核酸)病毒，也就是說(shuō)它的遺傳物質(zhì)是DNA，它載有病毒所有遺傳信息，研究證明，乙肝病毒的裸DNA(沒(méi)有蛋白質(zhì)包裹DNA)就有感染性，完成對(duì)宿主的侵襲，造成宿主體內(nèi)出現(xiàn)完整的乙肝病毒顆粒。也就是說(shuō)乙肝病毒DNA相當(dāng)于完整的乙肝病毒顆粒。,因此，如果體內(nèi)檢測(cè)到乙肝病毒DNA，不管別的乙肝標(biāo)志物如何(陽(yáng)性或陰性)，此人就可以確定為乙肝病毒感染者，其血液及體液具有較強(qiáng)的傳染性。若轉(zhuǎn)氨酶再升高就是乙肝患者，需要保肝、降酶、抗病毒治療。其親屬最好注射乙肝疫苗以產(chǎn)生保護(hù)性抗體以免被傳染。,46,發(fā)病機(jī)制,針對(duì) cccDNA 的治療現(xiàn)狀 目前臨床治療時(shí)雖然很多抗病毒藥物，但并沒(méi)有能夠進(jìn)到細(xì)胞核以內(nèi)的藥物，還不能夠達(dá)到清除細(xì)胞核內(nèi) cccDNA 的目的?，F(xiàn)有的抗病毒治療只是抑制病毒的復(fù)制，而不能把藏匿于核內(nèi)的，復(fù)制的最基本模板 cccDNA 去掉。因此肝病往往是慢性的，而且比較容易復(fù)發(fā),所謂復(fù)發(fā),就是在肝細(xì)胞核內(nèi)“睡眠”的病毒 DNA 按照病毒自身的復(fù)制周期進(jìn)行復(fù)制。 對(duì)于肝細(xì)胞以外的器官是否有 cccDNA 的存在，目前還在研究階段。另外，目前還沒(méi)有一個(gè)比較穩(wěn)定、可靠和敏感的 cccDNA 檢測(cè)的方法上市，因此 cccDNA 的檢測(cè)和治療都是相當(dāng)困難的。,cccDNA 和 rcDNA 的差異 （一）一級(jí)結(jié)構(gòu)差異 從核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)來(lái)看 cccDNA 是一條完整的雙鏈，是共價(jià)閉和環(huán)。松弛環(huán)狀 DNA（ rcDNA ），雖然也是環(huán)狀的，但是它是有缺口的，它不完整的。 （二）空間結(jié)構(gòu)差異 從核酸空間結(jié)構(gòu)來(lái)看cccDNA 是超螺旋結(jié)構(gòu)；rcDNA 是松弛環(huán)狀，不是超螺旋的結(jié)構(gòu)。,檢測(cè)血清或血漿 HBV DNA 陽(yáng)性有什么臨床意義？ 1. 判斷血清中是否有 HBV DNA 的存在 我們檢測(cè)到的 HBV DNA 包括 完整 HBV 病毒和 DNA 片段。 目前我們用的 HBV DNA 熒光 PCR 法，還不能區(qū)分是完整病毒還是片段。只要檢測(cè)到的病毒載量在檢測(cè)線以上就可以定為標(biāo)本含有 HBV DNA 。,2. 判斷抗病毒療效的評(píng)估指標(biāo) 細(xì)胞內(nèi) HBV DNA 和 HBV DNA 確認(rèn)方法。 病人采用各種抗病毒藥物，比如拉米夫定、阿德福韋、恩替卡韋或替米夫定等抗病毒藥物，因?yàn)檫@些藥可以有效的抑制病毒復(fù)制，用藥之前或用藥之后，病人的血清里或外周血白細(xì)胞里是不是還有病毒的存在？病毒下降了多少？是不是有病毒的反彈？,這是臨床醫(yī)生關(guān)心的問(wèn)題。隨著抗病毒藥物用藥時(shí)間的延長(zhǎng)，有些病人血清里面的 HBV DNA 一直處于檢測(cè)線以下。因此目前臨床醫(yī)生有一些新的需求，就是能不能確認(rèn)病人血清里究竟有沒(méi)有 HBV DNA 。不同的實(shí)驗(yàn)室報(bào)告檢測(cè)低限值不一樣，有的實(shí)驗(yàn)室報(bào) 1000 IU ，有的實(shí)驗(yàn)室報(bào) 100 IU ， COBAS TaqMan12 個(gè)， 12 個(gè)還是有病毒，血清里究竟有多少個(gè)？是臨床急需的一種 HBV DNA 確認(rèn)方法。即確認(rèn)血清里面究竟有沒(méi)有病毒。,3.HBV DNA 陽(yáng)性與傳染性 感染乙肝病毒 必須達(dá)到一定的量，突破各種屏障（ 血液里的補(bǔ)體、細(xì)胞因子、抗體等 ），進(jìn)入肝細(xì)胞復(fù)制， 才能達(dá)到傳染性的要求，因此并不是接觸到病毒都會(huì)被感染,4， HBV DNA 定量與乙肝血清學(xué)模式不同組合的意義。如：大三陽(yáng)（ 表面抗原、 E 抗原和核心抗體陽(yáng)性 ）并抗 HBs 陽(yáng)性： HBsAg/IgM 。 E 抗原陽(yáng)性說(shuō)明病人體內(nèi)的乙肝病毒處于一種活躍性的復(fù)制狀態(tài)。這時(shí)有的病人合并表面抗體的陽(yáng)性，是不是獲得一定的抵抗力？不是。表面抗體往往是病毒復(fù)制時(shí)誘發(fā)了機(jī)體免疫答應(yīng)而產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，這個(gè)抗體是針對(duì)表面抗原的 IgM 大蛋白抗體。因此它是機(jī)體對(duì)乙肝病毒復(fù)制免疫反抗的結(jié)果。這時(shí)要提高病人或保持病人的免疫功能 ；小三陽(yáng)并抗 HBs 陽(yáng)性：病毒復(fù)制、不同型病毒的感染等 ； 抗 HBs 或抗 HBc 與 HBV DNA 同時(shí)陽(yáng)性：細(xì)胞內(nèi) HBV 的釋放。,血清 cccDNA 與肝臟組織內(nèi) cccDNA 的不同意義 最早的觀點(diǎn)認(rèn)為 cccDNA 是雙價(jià)閉環(huán)環(huán)狀 DNA ，它只在肝細(xì)胞里存在。后來(lái)越來(lái)越多的研究者發(fā)現(xiàn)，血清里不但有 cccDNA ，而且也有肝組織內(nèi)的 cccDNA 。因?yàn)檠謇锏?cccDNA 是從壞死的肝細(xì)胞釋放出來(lái)的，并且它是環(huán)狀的，不易被蛋白結(jié)合，也不易被消化，因此與肝組織內(nèi)的 HBV DNA 有著不同的意義。,目前認(rèn)為血清里的 cccDNA 存在是病毒啟動(dòng)復(fù)制的標(biāo)志，即病毒正處在復(fù)制的上升期，而肝組織內(nèi)的 cccDNA 是病毒慢性化的標(biāo)志。如果判斷抗病毒藥物效果，檢測(cè)血清里的 cccDNA 沒(méi)有太多的意義，而肝組織內(nèi)的 cccDNA 反而有意義。即如果外周血 HBV DNA 已經(jīng)轉(zhuǎn)移到檢測(cè)線以下，判斷病毒是不是徹底清除？我們要檢測(cè)肝組織內(nèi)的 cccDNA 。,生物暴露與措施 1. 無(wú)損傷暴露 部位的清洗方法不同， 如果血清濺到衣服上，通過(guò)有效的消毒液進(jìn)行浸泡、清洗，一般浸泡的時(shí)間不能低于半個(gè)小時(shí)；如果濺到皮膚上，直接用洗滌液來(lái)洗，不要用力搓，要輕搓，然后用流水沖掉；如果濺到眼睛上，最忌諱的是用力來(lái)揉搓眼睛，用清水沖洗，一般病毒很難通過(guò)皮膚黏膜。也要對(duì)濺到你眼睛的血漿里做一個(gè)鑒定，看看它是不是含有病毒，病毒含量高低 。,2. 創(chuàng)傷暴露 確定污染源 HBV 含量狀態(tài)， 如果高于 104 以上，感染的可能性很大，如果低于 104 以下，感染的可能性非常小。要在最短時(shí)間內(nèi)要注射有效的高效價(jià)免疫球蛋白。,3. 特殊人群的討論 孕婦和兒童。 如果孕婦在懷孕以前是乙肝，盡可能建議孕婦通過(guò)干擾素或核苷類似物把體內(nèi)的病毒降到檢測(cè)線以下，停藥 3 個(gè)月再懷孕。有的孕婦懷孕 7 、 8 個(gè)月發(fā)現(xiàn)自己感染了乙肝，這時(shí)不主張終止妊娠，應(yīng)該保持自身良好的免疫狀態(tài)和良好的精神狀態(tài)，在孩子出生以后要第一時(shí)間使孩子和母親的血液脫離，同時(shí)對(duì)孩子注射高效價(jià)免疫球蛋白?？梢詫?duì)臍血進(jìn)行檢測(cè)，臍血里 HBV DNA 是陰性，孩子就沒(méi)被感染。,