2019-2020年高中生物 5.3血紅蛋白的提取和分離教學(xué)設(shè)計(jì) 新人教版選修1教材內(nèi)容解讀要點(diǎn)1如何分離不同種類的蛋白質(zhì) 根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異分離蛋白質(zhì)。如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)和對(duì)其他分子的親和力等等。要點(diǎn)2凝膠色譜柱（1）定義凝膠色譜法也稱作分配色譜法，是根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的有效方法。（2）凝膠所用的凝膠實(shí)際上是一些微小的多孔球體，這些小球體大多數(shù)是由多糖類化合物構(gòu)成的，如葡聚糖或瓊脂糖。（3）分離原理在小球體內(nèi)部有許多貫穿的通道，當(dāng)相對(duì)分于質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時(shí)，相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程較長，移動(dòng)速度較慢；而相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)無法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動(dòng)，路程較短，移動(dòng)速度較快。相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子因此得以分離。要點(diǎn)3 緩沖溶液（1）緩沖溶液的緩沖作用在一定范圍內(nèi)，緩沖溶液能夠抵制外界的酸和堿對(duì)溶液pH的影響，維持pH基本不變。調(diào)節(jié)緩沖劑的使用比例就可以制得在不同pH范圍內(nèi)使用的緩沖液。（2）緩沖溶液的意義生物體內(nèi)進(jìn)行的各種生物化學(xué)反應(yīng)都是在一定的pH下進(jìn)行的，為了能夠在實(shí)驗(yàn)室條件下準(zhǔn)確模擬生物體內(nèi)的過程，就必須保持體外的pH與體內(nèi)的基本一致。要點(diǎn)4電泳（1）定義 電泳是指帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程。（2）電泳原理許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解離的基團(tuán)，在一定的pH下，這些基團(tuán)會(huì)帶上正電或負(fù)電。在電場的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng)。電泳利用了待分離樣品中各種分于帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小、形狀的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。（3）電泳過程中影響粒子運(yùn)動(dòng)快慢的因素粒子帶電荷的多少。粒子帶電荷越多在電場中運(yùn)動(dòng)越快。粒子的質(zhì)量。粒子質(zhì)量越小在電場中運(yùn)動(dòng)越快。粒子的形狀。呈球形或近球形的粒子比鏈狀粒子運(yùn)動(dòng)快。（4）荷質(zhì)比粒子在電泳時(shí)運(yùn)動(dòng)的快慢主要取決于電荷與質(zhì)量比，簡稱荷質(zhì)比。荷質(zhì)比值越大的粒 子電泳時(shí)運(yùn)動(dòng)越快。要點(diǎn)5實(shí)驗(yàn)操作蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。血液由血漿和各種血細(xì)胞組成，其中紅細(xì)胞最多。在紅細(xì)胞的組成中，約90%是血紅蛋白。血紅蛋白由四個(gè)肽鏈組成，包括兩個(gè)-肽鏈和兩個(gè)-肽鏈（1）樣品處理紅細(xì)胞的洗滌洗滌紅細(xì)胞的目的：去除雜蛋白，以利于后續(xù)步驟的分離純化。采集的血樣要及時(shí)分離紅細(xì)胞，分離時(shí)采用低速短時(shí)間離心，如500rmin離心2min，然后用膠頭吸管吸出上層透明的黃色血漿，將下層暗紅色的紅細(xì)胞液體倒入燒杯，再加入五倍體積的生理鹽水，緩慢攪拌10min，低速短時(shí)間離心，如此重復(fù)洗滌三次，直至上清液中沒有黃色，表明紅細(xì)胞已洗滌干凈。洗滌次數(shù)、離心速度與離心時(shí)間十分重要。洗滌次數(shù)過少，無法除去血漿蛋白；離心速度過高和時(shí)間過長會(huì)使白細(xì)胞等一同沉淀，達(dá)不到分離的效果。血紅蛋白的釋放將洗滌好的紅細(xì)胞倒人燒杯中，加蒸餾水到原血液的體積，再加40%體積的甲苯，置于磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢?0min。蒸餾水和甲苯作用：使紅細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。分離血紅蛋白溶液將攪拌好的混合液轉(zhuǎn)移到離心管中，以xxrmin的速度離心10min后，可以明顯看到試管中的液體分為4層。第1層為無色透明的甲苯層，第2層為白色薄層固體，是脂溶性物質(zhì)的沉淀層，第3層是紅色透明液體，這是血紅蛋白的水溶液，第4層是其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀物。將試管中的液體用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。透析取lmL的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋故人盛有300mL的物質(zhì)的量濃度為20mmolL的磷酸緩沖液中(pH為7.0)，透析12h。(2)凝膠色譜操作凝膠色譜柱的制作凝膠色譜柱的裝填將色譜柱垂直固定在支架上。計(jì)算所用凝膠量，并稱量。凝膠用蒸餾水充分溶脹后，配成凝膠懸浮液，在與色譜柱下端連接的尼龍臂打開的情況下，一次性緩慢倒入色譜柱內(nèi)，裝填時(shí)可輕輕敲動(dòng)色譜柱，使凝膠裝填均勻。色譜柱內(nèi)不能有氣泡存在，一旦發(fā)現(xiàn)有氣泡，必須重裝。裝填完后，立即連接緩沖液洗脫瓶，在約50cm高的操作壓下，用300ml的物質(zhì)的量濃度為20mmolL的磷酸緩沖液充分洗滌平衡凝膠12h，使凝膠裝填緊密。樣品的加入和洗脫打開色譜柱下端的流出口。使柱內(nèi)凝膠面上的緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，關(guān)閉出口。用吸管小心地將lmL透析后的樣品加到色譜柱的頂端，加樣時(shí)使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng)，注意不要破壞凝膠面。加樣后，打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)。等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口。小心加入物質(zhì)的量濃度為20mmolL的磷酸緩沖液(pH為7.0)到適當(dāng)高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口，進(jìn)行洗脫。待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集流出液，每5mL收集一管，連續(xù)收集。注意事項(xiàng)在凝膠色譜操作過程中，不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。一旦發(fā)生這種情況，凝膠色譜柱需要重新裝填。如果紅色區(qū)帶均勻一致地移動(dòng)，說明色譜柱制作成功。要點(diǎn)6疑難解答從凝膠色譜的分離原理分析為什么凝膠的裝填要緊密、均勻?凝膠色譜的分離時(shí)，相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)分于只能從顆粒之間向下移動(dòng)，通過的路程較短，移動(dòng)速度較快，相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)分子比較容易進(jìn)入凝膠內(nèi)的通道，通過的路程較長，移動(dòng)速度較慢因此，樣品中相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)先流出，相對(duì)分子質(zhì)量中等的分子后流出，相對(duì)分子質(zhì)量最小的分子最后流出，從而使各種相對(duì)分子質(zhì)量不同的分子得以分離。如果凝膠裝填得不夠緊密、均勻，就會(huì)在色譜柱內(nèi)形成無效的空隙，使本該進(jìn)入凝膠內(nèi)部的樣品分子從這些空隙中通過，攪亂洗脫液的流動(dòng)次序，影響分離的效果。