2019-2020年高考生物二輪復(fù)習(xí)植物的組織培養(yǎng)教案 中圖版選修1在生物技術(shù)實(shí)踐模塊課程標(biāo)準(zhǔn)中，植物組織培養(yǎng)的具體要求是“嘗試植物的組織培養(yǎng)”。嘗試是技能性目標(biāo)中的模仿水平，即學(xué)生仿照教師的示范性動作完成對實(shí)驗(yàn)對象的操作。植物組織培養(yǎng)是一項(xiàng)操作復(fù)雜而精細(xì)，操作難度較大的實(shí)踐活動，其操作流程包括：配制母液、培養(yǎng)基配制與滅菌、外植體選擇和消毒、接種、形成愈傷組織、誘導(dǎo)叢芽和生根、組培苗移栽等操作環(huán)節(jié)。從操作的持續(xù)時(shí)間看，完成前四項(xiàng)活動需要一天，后三項(xiàng)活動需要12個(gè)月。為了確保在有限的時(shí)間內(nèi)順利地開展實(shí)驗(yàn)教學(xué)，需要確定學(xué)生動手操作的一些重要環(huán)節(jié)和步驟，并針對這些環(huán)節(jié)和步驟提前做好實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備。1 實(shí)驗(yàn)室的準(zhǔn)備工作本實(shí)驗(yàn)需要作好三項(xiàng)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：一是提前配制各種母液；二是提前準(zhǔn)備MS培養(yǎng)基；三是選擇外植體并進(jìn)行預(yù)處理。1.1 配制母液母液中含有大量元素、微量元素、激素（植物生物調(diào)節(jié)劑）和維生素等有機(jī)成分，母液濃度是實(shí)際溶液濃度的510倍。配制母液花費(fèi)時(shí)間多，需要用到溶量瓶、移液管等精密儀器，無法由每位學(xué)生親自操作，教師可帶領(lǐng)部分學(xué)生在課外進(jìn)行。母液的類型和配制順序如下：配制母液的注意事項(xiàng)：自來水或河水中含有大量的礦質(zhì)元素，勿用配制母液；配制大量元素和微量元素母液時(shí)，應(yīng)將每種化合物單獨(dú)溶解后，再一一混合，同時(shí)還應(yīng)用適量的蒸餾水清洗燒杯內(nèi)壁，并將清洗后的蒸餾水倒入混合溶液中，這樣可以保證每種元素的濃度，混合時(shí)要按照教材附表中的順序進(jìn)行，最后加入的是氯化鈣溶液，這樣可以避免發(fā)生沉淀；配制好的母液要先倒入1 000 ml燒杯中，再由燒杯轉(zhuǎn)入1 000 ml細(xì)口瓶中，不可由容量瓶直接倒入細(xì)口瓶中；注意觀察母液中是否有絮狀物，出現(xiàn)絮狀物表明離子之間發(fā)生反應(yīng)，需要重新配制母液；植物生長調(diào)節(jié)劑難溶于水，需要堿或酸助溶，一般生長素類物質(zhì)用堿（0.1 mol/LNaOH13 ml）或酒精（7595的酒精13ml）助溶，細(xì)胞分裂素類物質(zhì)一般用酸（0.1 mol/LHCL13 ml）助溶，加入蒸餾水定溶時(shí)要緩慢，也可用水浴法助溶；用棕色細(xì)口瓶盛裝有機(jī)物母液和植物生長調(diào)節(jié)劑母液，避免透射光損害母液中的有機(jī)成分；在瓶壁上貼好各種母液的標(biāo)簽（下圖所示）；將配制好的母液放入冰箱中或陰涼處保存。MS是穆拉希吉（Murashige）和斯庫克（Skoog）兩位科學(xué)家第一個(gè)字母的縮寫，他們于1962年為培養(yǎng)煙草而設(shè)計(jì)了一種培養(yǎng)基，這就是組培使用中最為廣泛的MS培養(yǎng)基；標(biāo)簽中間一行的數(shù)字及單位表示的意義如下，例如，100ml/L，即配制1升培養(yǎng)基只需從母液中提取100ml即可；50mg/100ml，表明100ml母液中含有50mg萘乙酸，如取4mg的萘乙酸，只需提取8ml母液。除母液需提前配制好外，消毒液也需要提前配制好。外植體消毒一般采用75的酒精、210的次氯酸鈉溶液等。1.2 培養(yǎng)基的配制與滅菌培養(yǎng)基的類型有很多種，通常采用MS培養(yǎng)基。配制培養(yǎng)基的流程如下：上述的培養(yǎng)基配制流程中，加入各種母液的時(shí)間是在瓊脂溶化之后，這樣既可避免加熱使母液中的各種離子發(fā)生反應(yīng)，又可避免有機(jī)物母液和植物生長調(diào)節(jié)劑因高溫受到損害。將母液加入培養(yǎng)基的順序是：先提取大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)物母液，后提取植物生長調(diào)節(jié)劑母液，切勿先提取植物生長調(diào)節(jié)劑母液，這是因?yàn)樵撊芤褐泻兴峄驂A，容易與其他元素形成沉淀而失敗。培養(yǎng)基通常采用高壓蒸汽滅菌，滅菌時(shí)間一般為1520min，滅好菌的培養(yǎng)基不易保存過長時(shí)間，通常是現(xiàn)用現(xiàn)配。在對培養(yǎng)基滅菌的同時(shí)，也要對解剖刀、鑷子、燒杯、錐形瓶、牛皮紙等必要的儀器設(shè)備進(jìn)行滅菌。1.3 外植體的選擇和預(yù)處理根據(jù)植物細(xì)胞的全能性原理，選擇任何活的植物體都能培養(yǎng)出組培苗，但不同植物的各種組織和器官的分裂能力不同，同時(shí)還要考慮消毒處理的特殊情況，因此，選擇恰當(dāng)?shù)耐庵搀w進(jìn)行接種既有利于消毒，避免污染，又有利于在較短時(shí)間內(nèi)形成組培苗，從而提高組培成功率。下面是選擇外植體時(shí)需要考慮的一些因素及說明?？紤]的因素 說 明外植體的年齡一般情況外植體的年齡越小，分化的程度越小，組培的成功率就越高，因此，盡量選擇幼嫩的植物組織或器官作為外植體外植體的大小外植體很小和很大都不合適，很小的外植體極容易死亡，很大的外植體不容易消毒，因此，要選擇大小適中的外植體。例如，如果用菊花的芽進(jìn)行組培，選取的芽可為3mm左右外植體所在的部位一般選擇植物的芽尖、根尖或幼嫩的莖作為外植體，這些部位的組織分裂能力強(qiáng)，容易形成愈傷組織外植體的外觀形態(tài)由于外植體的消毒工作非常重要，因此，要選擇哪些表面相對光滑容易消毒的外植體較好選擇好外植體后教師還要做一些預(yù)處理，以便學(xué)生進(jìn)一步消毒時(shí)能有效地殺死外植體表面的微生物。預(yù)處理包括：用清水沖洗；用洗滌靈或洗衣粉清洗；芽作為外植體時(shí)要放在錐形瓶中加清水反復(fù)振蕩，如果芽中有很多凹陷，還需要用毛刷輕刷；用自來水細(xì)流沖洗24小時(shí)左右。組培室要進(jìn)行紫外線消毒，或用化學(xué)藥劑如甲醛和高錳酸鉀進(jìn)行蒸汽消毒。操作臺、接種器械、工作服等都要提前進(jìn)行消毒，等等。2教學(xué)建議2.1 重視實(shí)驗(yàn)原理的學(xué)習(xí)，幫助學(xué)生形成網(wǎng)絡(luò)化的知識結(jié)構(gòu)組培的原理及過程是教學(xué)中的重點(diǎn)，對于學(xué)生理解組培在生產(chǎn)實(shí)踐中的重要性具有十分積極的現(xiàn)實(shí)意義，同時(shí)，有助于學(xué)生理解生命的本質(zhì)，以及人類對生命現(xiàn)象進(jìn)行干預(yù)的意義。組培的原理、過程及作用可用下面的圖示表示。為幫助學(xué)生理解組培的原理、操作和過程，教學(xué)時(shí)可引導(dǎo)學(xué)生討論下列問題：滅菌和消毒的區(qū)別以及在組培中是如何應(yīng)用的？在脫分化和再分化過程中怎樣使用植物生長調(diào)節(jié)劑? 組培過程中有時(shí)需要換瓶操作，這是為什么（改變培養(yǎng)基中的植物生長調(diào)節(jié)劑的濃度比例）? 組培過程中的每一步都需要光照嗎（愈傷組織的形成不一定需要光照，但叢芽和根的形成需要光照）?組培中用的蔗糖作為能源和原料物質(zhì)，用葡萄糖行不行（使用蔗糖主要是考慮經(jīng)濟(jì)因素，也可用葡萄糖或果糖替代）？花藥離體培養(yǎng)獲得的植物幼苗都是單倍體嗎（不是，也有正常的植物體）？等等。2.2 合理安排時(shí)間，確保學(xué)生動手操作關(guān)鍵的步驟既然我們不可能讓每一位學(xué)生都經(jīng)歷組培的全過程，但又要讓學(xué)生實(shí)踐操作，因此，選擇什么樣的操作環(huán)節(jié)讓學(xué)生實(shí)踐就顯得尤為重要。以下的幾種方案供參考和借鑒。方案1：學(xué)生完成外植物體的消毒和接種工作。外植體的消毒工作至關(guān)重要，需要那些操作認(rèn)真、細(xì)致的學(xué)生才能夠很好地完成，因此這種方案要求學(xué)生具備一定的操作技能，并且做到耐心、細(xì)致。外植體的消毒流程如下。上述流程中，酒精起到表面消毒的作用，次氯酸鈉溶液的消毒作用更強(qiáng)。這兩種消毒劑的使用時(shí)間可根據(jù)外植體的種類決定，一般而言，芽尖等相對幼嫩的組織消毒的時(shí)間要短些，而莖、根的消毒時(shí)間可用時(shí)長一些?？偟脑瓌t是，既要?dú)缤庵搀w表面的全部微生物，又要避免損害和殺死外植體本身。除上述的消毒劑外，過氧化氫溶液（10，515min）和氯化汞溶液（0.10.5，27min）也是極好的消毒劑。通過以上操作學(xué)生能體會到無菌對于組織培養(yǎng)成功的重要作用，從而提高他們的實(shí)驗(yàn)操作技能、嚴(yán)謹(jǐn)認(rèn)真的科學(xué)精神和態(tài)度。方案2：學(xué)生完成愈傷組織的繼代培養(yǎng)或分化換瓶。由于減少了外植體消毒這一重要的環(huán)節(jié)，操作相對簡單，成功率很高，學(xué)生容易獲得成功的滿足感。因此，這種方案是針對那些實(shí)踐操作能力一般的學(xué)生而設(shè)置的。一方面可以讓學(xué)生體驗(yàn)組培接種的操作過程，另一方面保證了實(shí)驗(yàn)的成功率，節(jié)約了實(shí)驗(yàn)時(shí)間。方案3：探討植物生長調(diào)節(jié)劑的不同濃度對組培的影響。為強(qiáng)凋不同濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑在誘導(dǎo)愈傷組織分化形成叢芽或生根中的作用，可配制植物生長調(diào)節(jié)劑不同濃度的培養(yǎng)基，然后讓學(xué)生根據(jù)自己的意愿選擇這些培養(yǎng)基進(jìn)行換瓶操作。當(dāng)學(xué)生看到植物生長調(diào)節(jié)劑的神奇作用時(shí)，一定能夠深刻地理解激素對植物生長的重要作用，從而激發(fā)學(xué)生濃厚的探究興趣。下表為組培中常用的植物生長調(diào)節(jié)劑的類型及作用。調(diào)節(jié)劑名稱濃度范圍作用生長素類2，4二氯苯氧乙酸（2，4D）、萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）等0.015mg/L促進(jìn)細(xì)胞的伸長和分裂，促進(jìn)愈傷組織和根的形成細(xì)胞分裂素類激動素（KT）、6芐基腺嘌呤（BA或6BA）、玉米素（ZT）等0.510mg/L促進(jìn)細(xì)胞的橫向生長和分裂，促進(jìn)芽的分化和形成誘導(dǎo)外植體形成不定芽時(shí)，一般用細(xì)胞分裂素類物質(zhì)的濃度較高，生長素類物質(zhì)的濃度較低；如果這兩類物質(zhì)的濃度相同，則有利于形成愈傷組織；如果其比值小于1，則有利于生根。教學(xué)中可選擇不同的配比濃度，探討哪種配比濃度更有利于芽的形成，哪種配比濃度更有利于根的形成。2.3 成立課外活動小組，培養(yǎng)學(xué)生中的積極分子組培實(shí)驗(yàn)的操作繁多而復(fù)雜，需要教師提前做好大量的準(zhǔn)備工作，因此，成立活動小組，培養(yǎng)學(xué)生中的積極分子十分重要。活動小組主要完成以下工作：（1）幫助老師完成實(shí)驗(yàn)室的前期準(zhǔn)備，如各種母液的配制、各種培養(yǎng)基的配制和滅菌，等等；（2）做好接種的示范操作，并拍成錄像，提供給其他學(xué)生借鑒；（3）接種后的觀察和記錄；（4）進(jìn)行繼代培養(yǎng)和分化轉(zhuǎn)瓶；（5）幼苗的移栽及管理；（6）進(jìn)行課題延伸項(xiàng)目的研究，等等。