2019-2020年高中生物 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段備課教案 新人教版選修1教學(xué)目標(biāo)：（一）知識(shí)與技能1、了解PCR技術(shù)的基本操作2、理解PCR的原理3、討論P(yáng)CR的應(yīng)用（二）過程與方法在多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段的實(shí)驗(yàn)過程中，應(yīng)避免外源DNA污染，嚴(yán)格控制溫度等反應(yīng)條件（三）情感、態(tài)度與價(jià)值觀通過對(duì)PCR實(shí)驗(yàn)的操作及結(jié)果分析，培養(yǎng)學(xué)生嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)態(tài)度和實(shí)事求是的科研精神教學(xué)重點(diǎn)：PCR的原理和PCR的基本操作教學(xué)難點(diǎn)：PCR的原理教學(xué)過程：（一）引入新課在現(xiàn)代生物技術(shù)中，DNA技術(shù)可謂是尖端技術(shù)。人類基因組計(jì)劃、基因工程、基因診斷、基因檢測(cè)、古生物鑒定等都離不開對(duì)DNA分子堿基序列的分析。而分析DNA堿基序列，就需要一定量的DNA片段。怎樣迅速獲得足夠量的DNA片段呢？今天我們來(lái)研究學(xué)習(xí)DNA分子的擴(kuò)增技術(shù)PCR技術(shù)。（二）進(jìn)行新課1基礎(chǔ)知識(shí)PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA的過程，與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制過程類似：11細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制條件分析：條件組分作用模板DNA的兩條單鏈提供復(fù)制的模板原料四種脫氧核苷酸合成DNA子鏈的原料酶解旋酶DNA聚合酶打開DNA雙螺旋催化合成DNA子鏈能量ATP為解螺旋和合成子鏈供能引物RNA為DNA聚合酶提供合成的3端起點(diǎn)12細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制過程（1）DNA的反向平行結(jié)構(gòu)：（結(jié)合投影圖）核苷酸分子的結(jié)構(gòu)與方向性：（分子結(jié)構(gòu)模式圖）由核苷酸通過3,5-磷酸二酯鍵連接形成核苷酸長(zhǎng)鏈：（模式圖，體現(xiàn)方向性）。DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的反向平行結(jié)構(gòu)：（2）DNA的復(fù)制過程:解 旋：解旋酶、ATP，DNA兩條鏈打開，形成兩條DNA單鏈。引物結(jié)合：在DNA單鏈3端與DNA反向配對(duì)結(jié)合，確保引物3端與DNA單鏈準(zhǔn)確配對(duì)。DNA聚合酶結(jié)合：子鏈合成：DNA聚合酶從引物3端開始，將配對(duì)的脫氧核苷酸連接起來(lái)。后續(xù)加工：DNA聚合酶I將引物切去，并合成空缺處的DNA單鏈，再由DNA連接酶將不連續(xù)的DNA子鏈連接起來(lái)（半不連續(xù)合成。先導(dǎo)鏈，滯后鏈）子鏈合成特點(diǎn)：不能從頭合成；合成方向?yàn)椤?3合成”。感悟生命的神秘：DNA聚合酶不但能夠催化磷酸二酯鍵的形成，還具有校對(duì)功能。它在每引入一個(gè)核苷酸后都要復(fù)查一次，只有堿基配對(duì)無(wú)誤后才能繼續(xù)往下聚合，它不能從頭合成。RNA聚合酶沒有校對(duì)功能，因此RNA的合成不需要引物，而是從頭合成的，它的錯(cuò)配可能性較大，在RNA引物完成功能后即被DNA聚合酶I刪去，代之以高保真的DNA鏈。思考DNA分子能準(zhǔn)確復(fù)制的原因有哪些？DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)提供模板；堿基互補(bǔ)配對(duì)；DNA聚合酶的復(fù)查功能。思考細(xì)胞內(nèi)哪些物質(zhì)是從頭合成的？RNA合成、蛋白質(zhì)合成。13DNA分子復(fù)制的人工控制解開螺旋：在80100時(shí)，DNA雙螺旋打開，形成兩條DNA單鏈，稱為變性。恢復(fù)螺旋：在50左右時(shí)，兩條DNA單鏈重新形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，稱為復(fù)性。復(fù)制條件：緩沖液,DNA模板,四種脫氧核苷酸,熱穩(wěn)定DNA聚合酶,兩種引物。反應(yīng)場(chǎng)所：PCR儀（自動(dòng)溫度周期性調(diào)節(jié)）。思考緩沖液相當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的什么成分？（核基質(zhì)）14PCR的反應(yīng)過程延伸復(fù)性變性變性：在95時(shí)DNA解旋復(fù)性：在50時(shí)引物與DNA單鏈結(jié)合延伸：在72時(shí)合成DNA子鏈（兩個(gè)引物間的序列）2實(shí)驗(yàn)操作21 PCR反應(yīng)體系：緩沖液、DNA模板，四種脫氧核苷酸原料、熱穩(wěn)定DNA聚合酶、兩種RNA引物，水22 實(shí)驗(yàn)操作步驟23 按照PCR反應(yīng)體系配方配制反應(yīng)液；（2）將PCR反應(yīng)體系50L用微量移液器轉(zhuǎn)移到微量離心管（0.5mL）中；（3）將微量離心管放到PCR儀中；（4）設(shè)置PCR儀的工作參數(shù)。（5）DNA在PCR儀中大量擴(kuò)增。24 水浴法：將微型離心管依次在95、55、72的恒溫水浴鍋中循環(huán)處理相應(yīng)時(shí)間。3實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)31避免外源DNA污染：所用儀器、緩沖液、蒸餾水等使用前高壓滅菌。32緩沖液和酶分裝成小份，20低溫保存。33每添加一種反應(yīng)成分，更換一個(gè)移液器的槍頭。34混勻后離心處理，使反應(yīng)液集中在離心管底部。4結(jié)果分析與評(píng)價(jià)41反應(yīng)液稀釋：取2LPCR反應(yīng)液，添加98L蒸餾水；2分光光度計(jì)調(diào)零：將100L蒸餾水添加到比色杯中，在260nm處將分光光度計(jì)調(diào)整讀數(shù)為零。42將100L反應(yīng)稀釋液倒入比色杯中，測(cè)定在260nm處的光吸收值。43計(jì)算：DNA含量50光吸收值稀釋倍數(shù)（三）課堂總結(jié)、點(diǎn)評(píng)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段PCR原理DNA的復(fù)制需要酶、原料、能量、引物DNA的變性和復(fù)性受溫度影響PCR過程變性復(fù)性延伸操作步驟配制PCR反應(yīng)體系移入離心管放入PCR設(shè)置工作參數(shù)DNA擴(kuò)增測(cè)定含量稀釋調(diào)零測(cè)定并讀數(shù)計(jì)算（四）實(shí)例探究例1 在（ ）的溫度范圍內(nèi)，DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)解開A. 1020 B. 80100 C. 2030 D. 4060解析：蛋白質(zhì)大多不能忍受6080的高溫，而DNA在80以上才會(huì)變性。答案：B例2 關(guān)于DNA的復(fù)制，下列敘述正確的是（ ）A.DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，只能從5端延伸DNA鏈B.DNA復(fù)制不需要引物C.引物與DNA母鏈通過堿基互補(bǔ)配對(duì)進(jìn)行結(jié)合D.DNA的合成方向總是從子鏈的3端向5端延伸解析：由于DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，只能從引物的3端即復(fù)制方向由3端向5端延伸；由于DNA分子是反向平行的，子鏈?zhǔn)且罁?jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，在DNA聚合酶作用下合成的，其合成方向是從子鏈5端向3端延伸。答案：C綜合應(yīng)用例3 下列有關(guān)PCR描述，不正確的是（ ）A.是一種酶促反應(yīng)B.引物決定了擴(kuò)增的特異性C.擴(kuò)增產(chǎn)量按y（1X）nD.擴(kuò)增對(duì)象是氨基酸序列E.擴(kuò)增對(duì)象是DNA序列解析：PCR是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)，它以極少量的DNA為模板，以四種脫氧核苷酸為原理，在引物的作用下使DNA聚合酶從引物的3端連接脫氧核苷酸，短時(shí)間內(nèi)迅速?gòu)?fù)制上百萬(wàn)份的DNA拷貝，其擴(kuò)增產(chǎn)量為y（1X）n，y代表DNA片段擴(kuò)增后的拷貝數(shù)，x表示平均每次的擴(kuò)增效率，n代表循環(huán)次數(shù)，因此答案選D。答案：D課后探究1、PCR與生物體DNA復(fù)制有何區(qū)別？2、如果在案件偵破過程中，只收集到一根毛發(fā)，但它所含的遺傳信息太少，該怎么辦呢？教后小記教師在教學(xué)過程中，可以先引導(dǎo)學(xué)生回憶必修2的有關(guān)DNA復(fù)制的知識(shí)，在此基礎(chǔ)上，學(xué)生可加深對(duì)于PCR原理的認(rèn)識(shí)。對(duì)于PCR反應(yīng)過程的教學(xué)，應(yīng)以讀圖識(shí)圖為主。教材中反應(yīng)過程圖解詳細(xì)的描繪了參與PCR的各種組成成分；每一輪反應(yīng)的三個(gè)基本步驟變性、復(fù)性、延伸；每一步驟的作用。教師在教學(xué)中可以請(qǐng)學(xué)生在讀圖的同時(shí)，結(jié)合教科書中的文字說明來(lái)加深理解。當(dāng)學(xué)生遇到難以理解的地方時(shí)，教師要及時(shí)給予解答。