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蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用研究方法 蛋白質(zhì)與DNA相互作用研究方法,蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用的研究方法,酵母雙雜交系統(tǒng)Yeast Two-Hybrid Systerm 免疫共沉淀Co-immunoprecipitation (Co-IP) GST pull-down 技術(shù) 熒光共振能量轉(zhuǎn)移Fluorescent Resonant Energy Transfer （FRET） 雙分子熒光互補(bǔ)（Bimolecular Fluorescent Complement）BIFC 蛋白質(zhì)芯片技術(shù) 其它方法,酵母雙雜交系統(tǒng),1.1 酵母雙雜交技術(shù)的原理 酵母雙雜交系統(tǒng)由Fields和Song等首先在研究真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中建立。他的產(chǎn)生是基于對酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4性質(zhì)的研究. 基因轉(zhuǎn)錄不僅需要有特定的DNA順式序列結(jié)構(gòu)，而且也需要有反式轉(zhuǎn)錄激活因子的參與。 轉(zhuǎn)錄激活因子往往由兩個或兩個以上相互獨立的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成,其中有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA binding domain, DB)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(activation domain, AD), 它們都是轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮功能所必需的。 單獨的BD或AD都不能激活基因轉(zhuǎn)錄，但不同轉(zhuǎn)錄激活因子的DB和AD形成的雜合蛋白仍然具有正常的激活轉(zhuǎn)錄的功能。,如果要研究兩個蛋白之間有無相互作用，可以把這兩 個蛋白分別與DB和AD形成的融合蛋白。 與DB 融合的蛋白稱為“誘餌”(bait)， 與AD融合的蛋白稱為“獵物”(prey)。 如果這兩個蛋白能發(fā)生相互作用, 這兩個融合蛋白上的 DB和AD就能重新形成有活性的轉(zhuǎn)錄激活因子, 從而激活 報告基因(reporter gene)的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。 通過檢測報告基因的表達(dá)產(chǎn)物, 可判別“誘餌”和“獵物” 這兩個蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用。,1.1 酵母雙雜交技術(shù)的原理,同時將上述兩種載體轉(zhuǎn)化改造后的酵母，這種改造后的酵母細(xì)胞的基因組中既不能產(chǎn)生GAL4，又不能合成LEU、TRP、HIS、ADE，因此，酵母在缺乏這些營養(yǎng)的培養(yǎng)基上無法正常生長。當(dāng)上述兩種載體所表達(dá)的融合蛋白能夠相互作用時，功能重建的反式作用因子能夠激活酵母基因組中的報告基因HIS、ADE、LACZ、MEL1，從而通過功能互補(bǔ)和顯色反應(yīng)篩選到陽性菌落。,1.2 酵母雙雜交操作主要流程 1. 分別構(gòu)建BD和AD融合蛋白載體 2. 分別將重組載體轉(zhuǎn)化酵母菌細(xì)胞 3. 對酵母轉(zhuǎn)化子進(jìn)行自激活檢測 4. 將重組載體共轉(zhuǎn)化酵母菌細(xì)胞 5. 檢測報告基因表達(dá)產(chǎn)物 6. 分析酵母雙雜交實驗結(jié)果,,,BD,AD,BD,AD,,,,,,,,,,,BD,AD,,,,,,,,,,,,x,Y,Identification and Characterization of FAM124B as a Novel Component of a CHD7 and CHD8 Containing Complex,實例,Method： For yeast two hybrid studies we generated the constructs FAM124B-1,3-pGADT7 (transcript variant 1) and FAM124B-1,2-pGADT7 (transcript variant 2) FAM124B-1,3-pGBKT7 (transcript variant 1, FAM124B-1,2-pGBKT7 (transcript variant ),,These both plasmids were co-transformed into Y2HGold strain cells together with either the CHD7-CR1-3-pGBKT7 (amino acids 1591-2181) or the CHD8-pGBKT7 (amino acids 1789–2302) plasmids.,Tserendulam Batsukh, Yvonne Schulz,et.al.Identification and Characterization of FAM124B as a Novel Component of a CHD7 and CHD8 Containing Complex.PLoS One. 2012; 7(12): e52640,Yeast two hybrid assay. Direct yeast two hybrid experiment with the constructs FAM124B-1,3-pGADT7 (full length transcript variant 1) and CHD7-CR1-3-pGBKT7 (amino acids 1591-2181, demonstrating no direct interaction between FAM124B transcript variant 1 and the CHD7 part, while (B) Direct yeast two hybrid experiment with the constructs FAM124B-1,3-pGADT7 (full length transcript variant 1) and CHD8-pGBKT7 (amino acids 1789–2302, shows a direct interaction. The same experiments were performed for FAM124B transcript variant 2. (C) Direct yeast two hybrid experiment with the constructs FAM124B-1,2-pGADT7 (full length transcript variant 2) and CHD7-CR1-3-pGBKT7 (amino acids 1591-2181, (D) Direct yeast two hybrid experiment with the constructs FAM124B-1,2-pGADT7 (full length transcript variant 2) and CHD8-pGBKT7 (amino acids 1789–2302, FAM124B transcript variant 2 interacts directly with the CHD8 part, while no direct interaction with the CHD7 part could be observed.,酵母雙雜交系統(tǒng)是一種在酵母細(xì)胞內(nèi)分析蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)。主要有二類載體: a 含DNA -binding domain的載體; b 含Transcription-activating domain的載體。另外還需要特殊的酵母菌株如GAL4缺陷型。,1.3 應(yīng)用,它可用于： 檢驗蛋白質(zhì)間的相互作用； 分析蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)構(gòu)域； 發(fā)現(xiàn)新的作用蛋白質(zhì)。,1.4 酵母雙雜交技術(shù)的優(yōu)點： 是一種細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)，比體外的蛋白質(zhì)相互作用技術(shù)更接近生物體內(nèi)的真實情況。 基于基因重組技術(shù)和分子遺傳學(xué)的原理，更便于觀察和檢測實驗結(jié)果。 酵母菌是一種低等真核微生物，能反映真核生物的基本生命現(xiàn)象和規(guī)律。 4. 酵母菌生長迅速、容易培養(yǎng)，便于進(jìn)行高通量、大規(guī)模的組學(xué)研究。,1.5 酵母雙雜交技術(shù)的弱點： 1. 假陽性：自激活、多因子參與…… 假陰性：毒性蛋白、膜蛋白、難表達(dá)的蛋白…… 低等真核細(xì)胞不能完全等同于高等真核生物的情況 酵母雙雜交實驗的結(jié)果必須經(jīng)過多方面的驗證，包括： 體外相互作用驗證 體外親和純化（GST pull-down）、體外免疫共沉淀…… 哺乳動物細(xì)胞內(nèi)驗證 亞細(xì)胞共定位、體內(nèi)免疫共沉淀……,優(yōu)點：生理條件下的結(jié)合 缺點：可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用,二、免疫共沉淀,2.1 定義及原理 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）：是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。 原理：當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質(zhì)x的抗體免疫沉淀x，那么與x在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)y也能沉淀下來。這種方法常用于測定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合；也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。,2.2 方法 1) 收獲培養(yǎng)的細(xì)胞（1×107－1×108）冷PBS洗滌2次 2）細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，冰浴30min 3) 12000rpm 離心 30min 4）收集上清并加入適量抗體，4oC搖動1h～過夜 5）加入ProteinA/G-Sepharose(瓊脂糖凝膠)懸液， 4oC搖動1h 6）細(xì)胞裂解液洗滌ProteinA/G-Sepharose混合液 7）離心棄上清 8）沉淀加2×蛋白Loading Buffer煮沸5－10min 9）離心，上清液跑SDS-PAGE 膠 10）考馬氏亮蘭染色、銀染 Western Blot 質(zhì)譜分析,3.注意事項 1）細(xì)胞裂解 采用溫和的裂解條件，不能破壞細(xì)胞內(nèi)存在的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用，多采用非離子變性劑（NP40或Triton X-100)。每種細(xì)胞的裂解條件是不一樣的，通過經(jīng)驗確定。 不能用高濃度的變性劑（0.2％SDS)，細(xì)胞裂解液中要加各種蛋白酶酶抑制劑，如商品化的cocktailer。 2）使用明確的抗體，有的抗體不適宜做免疫共沉淀。 3) 對照實驗的設(shè)計。,Identification and Characterization of FAM124B as a Novel Component of a CHD7 and CHD8 Containing Complex,實例,,(A) Using the anti-CHD8 (abcam, ab84527) or the anti-CHD7 (abcam, ab31824) antibody for precipitation, we detected with the anti-HA antibody (Roche) an approximately 51 kDa band corresponding to the estimated size of FAM124B transcript variant 1. Lane 1: co-transfected Co-IP, lane 2: untransfected HeLa cells as negative control.,三、GST pull—down技術(shù),3.1 定義及原理 —定義：該技術(shù)是通過以適當(dāng)標(biāo)簽 和目的基因進(jìn)行融合表達(dá)作為誘餌．從細(xì)胞提取物中釣出與目的蛋白相互作用的蛋白。多組分蛋白質(zhì)復(fù)合物的分離主要利用固定在瓊脂糖樹脂的反標(biāo)簽系統(tǒng)完成。 —原理：將誘餌蛋白質(zhì)和用谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶(glutathione-transferase，GST）標(biāo)簽融合表達(dá)，一步純化后與含有目的蛋白質(zhì)的溶液進(jìn)行孵育．利用谷胱甘肽瓊脂糖球珠將GST-融合蛋白-目的蛋白復(fù)合物沉淀下來，然后進(jìn)行聚丙烯酞胺凝膠電泳(SDS—PAGE) 鑒定與誘餌蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì),兩種應(yīng)用： 1）確定融合（或探針）蛋白與未知（或靶）蛋白間的新的相互作用 2）證實探針蛋白與已知蛋白質(zhì)間可疑的相互作用,3.2 方法： 1） GST融合蛋白先與下列蛋白溶液之一孵育（a, 單一明確的重組蛋白；b，細(xì)胞裂解蛋白混合液；c, 體外翻譯cDNA表達(dá)得到的未知蛋白） 2）混合液與谷胱甘肽瓊脂糖球珠反應(yīng) 4oC 2h 3）離心棄上清 4）沉淀加入2× 蛋白Loading Buffer煮沸，離心 5）取上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳， 6）考馬氏亮蘭染色觀察特異沉降的蛋白帶，進(jìn)一步做質(zhì)譜分析確定沉降的蛋白；電泳后的膠也可以做Western Blot來確定沉降的蛋白中是否有目的蛋白 注意：該實驗設(shè)立GST對照，反應(yīng)均在4oC進(jìn)行,,右邊為GST對照,3.3 GST 融合蛋白沉降實驗結(jié)果,CK2α′,GST-TP1,GST,Fig 10 GST pull down assay M: protein molecular weight standard Lane 1: GST Lane 2: GST-TP1+ CK2α′ Lane 3: CK2α＇,3.4 GST pull-down技術(shù)優(yōu)缺點,優(yōu)點： 融合蛋白親具有高通量性、高選擇性的特點，由于融合蛋白的多樣性以及表達(dá)系統(tǒng)的多樣性(如細(xì)菌、果蠅、哺乳動物)，該方法能夠研究蛋白質(zhì)在復(fù)雜體系中的相互作用。 缺點： 該方法的成功應(yīng)用取決于是否能夠得到足夠多，并且保持蛋白質(zhì)活性的重組融合蛋白，以及如何避免內(nèi)源性誘餌蛋白的干擾。,四、熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET） Fluorescence resonance energy transfer,4.1 熒光信號的產(chǎn)生 熒光基團(tuán)在某波長的激發(fā)光刺激下，產(chǎn)生一個更長波長的發(fā)射光。,4.2 什么是FRET? 熒光能量共振轉(zhuǎn)移是距離很近的兩個熒光分子間產(chǎn)生的一種能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。當(dāng)供體熒光分子的發(fā)射光譜與受體熒光分子的吸收光譜重疊，并且兩個分子的距離在10nm范圍以內(nèi)時，就會發(fā)生一種非放射性的能量轉(zhuǎn)移，即FRET現(xiàn)象，使得供體的熒光強(qiáng)度比它單獨存在時要低的多（熒光猝滅），而受體發(fā)射的熒光卻大大增強(qiáng)（敏化熒光）實際相當(dāng)于將短波長熒光基團(tuán)釋放的熒光屏蔽。,4.3 綠色熒光蛋白 60年代，Shimomura等首先從水母（Aequoria Victoria ）中分離出一種水母發(fā)光蛋白(aequoren)，該蛋白與鈣和腸腔素結(jié)合后可產(chǎn)生藍(lán)色熒光。然而水母中提取的顆粒都呈綠色，后經(jīng)證實在水母體內(nèi)還存在另外一種發(fā)光蛋白即綠色熒光蛋白 GFP, 后經(jīng)研究表明，在水母體內(nèi)Ca2+和腸腔素與水母發(fā)光蛋白結(jié)合后，水母發(fā)光蛋白產(chǎn)生藍(lán)色熒光，GFP在藍(lán)光的激發(fā)下，產(chǎn)生綠色熒光 。,人們在GFP基因的基礎(chǔ)上已經(jīng)制造出藍(lán)色熒光蛋白，黃色熒光蛋白，青色熒光蛋白，又發(fā)現(xiàn)了紅色熒光蛋白。,其中蘭色熒光蛋白和綠色熒光蛋白， 青色熒光蛋白和黃色熒光蛋白之間可以發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移,,Tsien & Miyawaki采用FRET技術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)Ca2+的濃度變化。他們將CFP和YFP分別于鈣調(diào)蛋白和鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽融合表達(dá)于同一個細(xì)胞內(nèi)。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)具有高的Ca2+濃度時，鈣調(diào)蛋白和鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽結(jié)合，可誘發(fā)FRET，使受體蛋白YFP發(fā)出黃色熒光，因此細(xì)胞呈黃色。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度低時，F(xiàn)RET幾乎不發(fā)生，因此檢測時CFP被激發(fā)，發(fā)出綠色熒光，細(xì)胞呈綠色。,4.4 應(yīng)用,在生命科學(xué)領(lǐng)域，F(xiàn)RET技術(shù)是檢測活體中生物大分子納米級距離和納米級距離變化的有力工具，可用于檢測某一細(xì)胞中兩個蛋白質(zhì)分子是否存在直接的相互作用。正如前述，當(dāng)供體發(fā)射的熒光與受體發(fā)色團(tuán)分子的吸收光譜重疊，并且兩個探針的距離在10nm范圍以內(nèi)時，就會產(chǎn)生FRET現(xiàn)象。而在生物體內(nèi)，如果兩個蛋白質(zhì)分子的距離在10nm之內(nèi)，一般認(rèn)為這兩個蛋白質(zhì)分子存在直接相互作用。,五、雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)（BiFC） (Bimolecular Fluorescence Complementation),基本原理：方法利用綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)及其突變體的特性作為報告基因，將熒光蛋白分割成兩個不具有熒光活性的分子片段，再分別與目標(biāo)蛋白連接.如果兩個目標(biāo)蛋白因為有相互作用而靠近，就使得熒光蛋白的兩個分子片段在空間上相互靠近，重新形成活性的熒光基團(tuán)而發(fā)出熒光.在熒光顯微鏡下，就能直接觀察到兩目標(biāo)蛋白是否具有相互作用，并且在最接近活細(xì)胞生理狀態(tài)的條件下觀察到其相互作用發(fā)生的時間、位置、強(qiáng)弱等情況。,,將熒光蛋白分割成兩個不具有熒光活性的分子片段,分別與目標(biāo)蛋白連接. 如果兩個目標(biāo)蛋白因為有相互作用而靠近，就使得熒光蛋白的兩個分子片段在空間上相互靠近，重新形成活性的熒光基團(tuán)而發(fā)出熒光,Identification of the SIRTUIN1 (SIRT1)-binding domain of BMAL1.,Binding of SIRT1 to BMAL1 deletion mutants was analyzed by bimolecular fluorescence complementation (BiFC). COS7 cells were transfected with plasmids encoding SIRT1-N-terminal of Venus (VN) and BMAL1-C-terminal of Venus (VC) wildtype (WT) or its various mutants (Δnuclear localization sequence [NLS], BMAL1 without a functional nuclear localization signal; Δbasic-helix-loop-helix [bHLH], encoding BMAL1 Δ71 to 140; ΔPer-Arnt-Sim [PAS]-A, BMAL1 Δ210 to 320; ΔPAS-B, BMAL1 Δ350 to 480; Δtranscriptional activation domain [TAD], BMAL1 Δ553 to 625). The images were captured by fluorescence imaging microscopy using specific filter sets for yellow fluorescent protein and red fluorescent protein.,六、蛋白質(zhì)芯片技術(shù) 蛋白質(zhì)芯片可以用來大規(guī)模篩選蛋白之間的相互作用。將熒光標(biāo)記的探針蛋白與蛋白質(zhì)芯片孵育，洗脫非特異性結(jié)合的蛋白后，可以通過掃描芯片上的熒光點檢測到穩(wěn)定的相互作用蛋白點 。,Gong W. et al. (2008) Molecular Plant 1: 27-41.,其它蛋白互作技術(shù),串聯(lián)親和純化（TAP） 表面等離子共振（SPR） 噬菌體展示技術(shù)(phage display approach) 融合蛋白親和色譜法(protein fusion affinity chromatography) 原子作用力顯微技術(shù)(atomic force microscopy, AFM ),蛋白質(zhì)與DNA相互作用 （一）酵母單雜交系統(tǒng)（Yeast one-hybrid system） 該技術(shù)是上世紀(jì)90年代中發(fā)展起來的研究DNA-蛋白質(zhì)之間相互作用的新技術(shù)，在酵母細(xì)胞內(nèi)研究真核生物中DNA-蛋白質(zhì)之間的相互作用，并通過篩選DNA文庫直接獲得靶序列相互作用蛋白的編碼基因。,基本原理：將順式作用元件與最基本啟動子（minimal promoter，Pmin）相連并將報告基因連到Pmin下游，將待測轉(zhuǎn)錄因子cDNA與酵母轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（transcription-activating domain, AD）融合表達(dá)載體導(dǎo)入酵母細(xì)胞，該基因產(chǎn)物如果能夠與順式作用元件相結(jié)合，就激活Pmin啟動子，報告基因表達(dá)。,從擬南芥cDNA文庫中篩選與順式元件DRE結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子示意圖。,（二）噬菌體展示技術(shù),基本原理：將已知的啟動子DNA片段與固相支持物結(jié)合； 以改構(gòu)的噬菌體為載體，把待選基因片段（編碼啟動子DNA結(jié)合蛋白的cDNA）定向插入噬菌體外殼蛋白基因區(qū)，形成的融合蛋白表達(dá)在噬菌的表面，不影響噬菌體的生活周期及天然構(gòu)型。外源蛋白或多肽表達(dá)于噬菌體的表面，與固定或固相支持物結(jié)合，通過適當(dāng)?shù)奶韵?，洗去非特異性結(jié)合的噬菌體(即親和富集法)，選出目的噬菌體，而編碼基因作為病毒基因組的一部分可通過分泌型噬菌體的單鏈DNA測序得知.,（三）DNAase I 足跡實驗,足跡試驗不僅能找到與特異性DNA結(jié)合的目標(biāo)蛋白，而且能告知目標(biāo)蛋白結(jié)合在哪些堿基部位，足跡試驗的方法較多，常用的有DNase Ⅰ足跡試驗、硫酸二甲酯足跡試驗(dimethylsulfate，DMS)，二者原理基本相同.,DNase Ⅰ足跡試驗的基本原理為: 蛋白結(jié)合在DNA片段上，保護(hù)結(jié)合部位不被DNase破壞，這樣，蛋白質(zhì)在DNA片段上留下了“足跡”，在電泳凝膠的放射性自顯影圖片上，相應(yīng)于蛋白質(zhì)結(jié)合的部位沒有放射性標(biāo)記條帶。,技術(shù)流程為： (1)待檢雙鏈DNA分子用P32作末端標(biāo)記，通常只標(biāo)記一端; (2)蛋白質(zhì)與DNA混合，等二者結(jié)合后，加入適量的DNase Ⅰ，消化DNA分子，控制酶的用量，使之達(dá)到每個DNA 分子只發(fā)生一次磷酸二酯鍵斷裂，同時設(shè)未加蛋白質(zhì)的 對照; (3)從DNA上除去蛋白質(zhì)，將變性的DNA加樣在測序凝膠中 作電泳和放射性自顯影，與對照組相比后解讀出足跡部 位的核苷酸序列.,（四）CHIP (Chromatin Immunoprecipitation),染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù), 一種可用來確定與某一特定蛋白結(jié)合或蛋白定位所在的特異性DNA序列的技術(shù),（五）EMSA (電泳遷移率實驗),