金胺“O”熒光染色法在結(jié)核病細(xì)菌學(xué)檢驗中的應(yīng)用中國衛(wèi)生檢驗雜志2008年5月第l8卷第5期ChineseJournalofHealthLaboratoryTechnology,May2008;Vol18No5851【微生物檢測方法】金胺”0”熒光染色法在結(jié)核病細(xì)菌學(xué)檢驗中的應(yīng)用戴學(xué)海,金法祥,湯佳良,許鵬(浙江省紹興市第六人民醫(yī)院,浙江紹興312000)摘要目的:比較兩種抗酸桿菌染色方法的差異.方法:采用金胺”0”熒光染色法和萋一尼染色法同時對同一病人標(biāo)本進(jìn)行檢測.結(jié)果:經(jīng)過240例標(biāo)本對比實(shí)驗,熒光染色組84例陽性,其陽性率為35.O%,萋一尼染色組7O例,陽性率為29.2%,經(jīng)檢驗,X2=1.88,P>0.05,無顯著性差異.在兩組結(jié)果1+的陽性對比中,熒光染色組為15.8%,而抗酸染色組為9.6%,經(jīng)檢驗=5.56,P<0.05,兩種方法有差異;而2+,3+,4+的陽性率P值均大于0.05,無顯著性差異.結(jié)論:金胺”0”熒光染色組檢出率明顯高于萋一尼染色組,尤其是痰液標(biāo)本菌量是1+,對那些病變輕,排菌量少的肺結(jié)核病人的診斷具有重要意義.熒光染色鏡檢時間短,工作效率高,適用于大量標(biāo)本的檢測.關(guān)鍵詞熒光染色;抗酸染色;抗酸桿菌中圖分類號R446文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號10048685(2008)05085102ApplicationoffluorescencestainofauramineOtoinspectionoftuberculosisbacteriologyDaiXuehai,JinFaxiang,TangJialiang,XuPeng(ShaoxingSixthPeopleSHospital,Shaoxing312000,China)Abstract0bjective:Tocomparethedifferencesbetweenthesetwowaysofacidfaststains.Methods:TestsimultaneouslyonthespecimensfromthesamepatientsbythewaysoffluorescencestainofAuramineOandZiehiNeelsenstain.Results:Care.fulcontrastofthe240specimens,thereare84onesinthegroupofflouescencestain,whicharepositive,whosepositiverateis35.O%.WhileinthegroupofZiehiNeelsenstain,thereare70specimensprovedpositive,whosepositiverateisjust29.2%.Throughtheinspectionof,resultingin=1.88,P>0.05,wecanseethereisondifferencebetweenthesetwoways.Intermsofwatchingtheirpositivecontrastof1+.therateoffluorescencestainis15.8%.buttherateofacidfaststainisonly9.6%.Meanwhile,throughtheinspectionofX,whichresultedin=5.56,P<0.05,obviously,therearesomedifferencesbetweenthem.WhatSparedwiththeirpositiveratesof2+.3+.4+.theyareallover0.05.whichiSalmostthesame.Conclusion:ComparedwithZiehiNeelsenstain,fluorescencestainofauramineOhasaclearadvantageinseekingrates.Especiallytothepatientsofpulmonarytuberculosis.whosebacteriumvolumeofsputumspecimensis1+andthepathologicalchangesarelighterandthebacteriumcapacitiesaresmaller,atthesametime.Becauseoffluorescencestain,weneedspendlesstimeonlensexams.Whichisevenmoreefficient.Nodouhisfitsfortestingagreatspecimen.KeywordsFluorescencestain;Acidfaststain;Acidfastbacillus目前,臨床上結(jié)核病細(xì)菌學(xué)的診斷主要采用抗酸染色法,即萋一尼染色法,該法已成為抗酸桿菌檢測的經(jīng)典方法,但因該法檢測時間長,陽性檢出率低,已無法滿足臨床診斷需要.我們采用金胺”O(jiān)”熒光染色法檢測240例痰液標(biāo)本,通過與萋一尼法對比試驗,證明熒光染色法能提高抗酸桿菌的陽性檢出率.1材料與方法1.1熒光染色液的配制染色液:金胺”0”1g溶于95%乙醇100ml中,加5%石炭酸液900ml混勻即可.脫色劑:3%鹽酸酒精.復(fù)染劑:高錳酸鉀0.5g,溶于100ml蒸餾水.1.2抗酸染色液配制作者簡介戴學(xué)海(1962),男,學(xué)士,副主任醫(yī)師,主要從事老年內(nèi)年及基礎(chǔ)研究工作.按照”全國結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗規(guī)程”進(jìn)行.1.3標(biāo)本來源結(jié)核病人痰液標(biāo)本來自我院門診或住院結(jié)核病人,這些病人均經(jīng)CT,PPD試驗及結(jié)核抗體檢測等臨床診斷為肺結(jié)核病人.1.4操作方法每份痰液標(biāo)本按標(biāo)準(zhǔn)(2cm1cm)涂兩張大小及厚度相當(dāng)?shù)钠哟?火焰固定,將痰涂片隨機(jī)分成熒光染色組和抗酸染色兩組進(jìn)行染色和鏡檢.1.5染色方法將痰液涂片用熒光染色液染10min,水洗后用3%的鹽酸酒精脫色12min,至外觀無黃色為止,水洗后加復(fù)染劑12min,水洗,晾干待檢.抗酸染色法按全國結(jié)核病細(xì)菌學(xué)檢驗規(guī)程進(jìn)行.(下轉(zhuǎn)第923頁)中國衛(wèi)生檢驗雜志2008年5月第18卷第5期ChineseJournalofHealthLaboratoryTechnology,May2008:Vol18No5923統(tǒng)計結(jié)果顯示,微生物性病原是導(dǎo)致食物中毒的主要因素,其中2003,2004年副溶血性弧菌導(dǎo)致的食源性疾病分別占微生物性食源性疾病的40%和23%,已經(jīng)超過沙門氏菌成為微生物性食物中毒最大的致病菌,而深圳市20032006年細(xì)菌性食物中毒的病因分析中,副溶血性弧菌也是排在首位.副溶血性弧菌嗜鹽畏酸,在無鹽培養(yǎng)基上不能生長,在食醋中只能存活1min,加熱至56C510min滅活.由該菌引起的食物中毒多為進(jìn)食海產(chǎn)品或鹽腌漬品,其次為蛋品,肉類或蔬菜.進(jìn)食肉類或蔬菜而致病者,多因食物容器或砧板污染所引起.根據(jù)中毒患者的臨床癥狀,流行病學(xué)調(diào)查和實(shí)驗室檢查結(jié)果,可以確定本次食物中毒是一起由副溶血性弧菌引起的食物中毒.造成這起中毒事故發(fā)生的原因:一方面是由于該店環(huán)境衛(wèi)生條件不良,操作間管理混亂,冰箱內(nèi)存放的食品生熟不分,冰箱內(nèi)有血跡及積霜并出現(xiàn)滴水現(xiàn)象;廚房沒有粗加工間,砧板生熟不分,有一塊砧板出現(xiàn)爆裂現(xiàn)象(砧板1),裂縫內(nèi)有食物殘渣,未及時清除干凈;而廚房當(dāng)班廚師均留有長指甲,帶戒指,這些都可能存在交叉污染,為細(xì)菌的繁殖提供了條件;另一方面消費(fèi)者的預(yù)防意識不夠也是一個主要原因.認(rèn)為經(jīng)過火鍋的高溫煮燙食物就滅菌了,為了保證肉的鮮嫩,甚至煮很短時間就撈出食用,殊不知在高溫下作用一定時間細(xì)菌才會被殺死,時間過短將起不到應(yīng)有的殺菌作用.4建議應(yīng)加強(qiáng)對從業(yè)人員的衛(wèi)生知識培訓(xùn),提高其食品衛(wèi)生管理水平,降低操作不當(dāng)及食品加工過程可能發(fā)生的危害因素,保證食物安全衛(wèi)生;同時也提醒我們衛(wèi)生部門應(yīng)加強(qiáng)傳染病防治法宣傳,加大衛(wèi)生知識執(zhí)法力度,在食品衛(wèi)生監(jiān)督管理中,預(yù)防細(xì)菌性食物中毒應(yīng)重點(diǎn)抓住3個環(huán)節(jié):防止食品污染;控制細(xì)菌繁殖;食品食用前應(yīng)徹底加熱,以消滅病原菌的傳播.消費(fèi)者也應(yīng)多了解一些傳染病的預(yù)防知識,增加自我保護(hù)能力.參考文獻(xiàn)1扈慶華,鄭薇薇,石曉路,等.雙重實(shí)時PCR快速同時檢測霍亂弧菌和副溶血弧菌J.中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2004,24(12):1004一l007.(收稿日期:2008一O118)(上接第851頁)1.6鏡檢熒光染色組采用OLYMPUSBX41顯微鏡觀察,20X物鏡計數(shù),40X物鏡觀察抗酸桿菌菌體形態(tài),在暗視野背景下抗酸桿菌發(fā)出黃綠色熒光.抗酸染色組涂片采用普通光學(xué)顯微鏡進(jìn)行檢測.熒光染色和抗酸染色鏡檢時間和結(jié)果報告標(biāo)準(zhǔn)均以全國結(jié)核病細(xì)菌學(xué)檢驗規(guī)程為準(zhǔn),以鏡檢1+以上者作陽性計算,對于13條/50個視野不作陽性計算,應(yīng)重留標(biāo)本復(fù)杏.2結(jié)果240例肺結(jié)核病人痰液標(biāo)本抗酸染色和熒光染色檢測結(jié)果見表1.表1熒光染色和抗酸染色抗酸桿菌陽性檢測結(jié)果3討論近年來,診斷結(jié)核病仍主要依靠實(shí)驗室檢測抗酸桿菌,雖然分子生物學(xué)方法如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR),脈沖電場凝膠電泳(PEGE),IS6110一RFLP等方法檢測結(jié)核桿菌DNA,具有快速,敏感等優(yōu)點(diǎn),但臨床診斷需要仍采用痰液涂片抗酸桿菌檢測,作為結(jié)核病最重要,最直接的依據(jù).常用的萋一尼抗酸染色操作繁瑣,染色加熱時易產(chǎn)生氣溶膠;技術(shù)要求較高,油鏡觀察視野范圍小,鏡檢時間長,檢驗人員易疲勞,同時對于涂片中存在的少量細(xì)菌難以發(fā)現(xiàn).從表中資料結(jié)果顯示,兩組結(jié)果中抗酸桿菌1+的陽性率,熒光染色組為15.8%,抗酸染色組為9.6%,=5.56,P<0.05,差別有顯著性,而2+以上,均無顯著性差異,這表明熒光染色和抗酸染色陽性率差異主要體現(xiàn)在1+(即含菌量較少的痰液標(biāo)本).對于那些病變輕,排菌量少的肺結(jié)核的診斷具有重要價值,通過熒光染色可明顯提高陽性檢測率,有利于臨床診斷.熒光染色鏡檢的注意事項:熒光染色后涂片應(yīng)在24h內(nèi)鏡檢完成,遇需隔夜時,置4C保存,次Et完成鏡檢,否則熒光減退,會造成陽性結(jié)果的不確定或者漏檢;熒光素染色液應(yīng)放置于棕色瓶中暗處存放,且時間不超過2周;有個別菌體40X暗色背景難以區(qū)別的抗酸桿菌,一定要轉(zhuǎn)到IOOX油鏡下加以確認(rèn).熒光染色鏡檢抗酸桿菌在暗色背景下會發(fā)出黃綠色熒光,非常醒目,容易發(fā)現(xiàn),而且40X物鏡視野大,鏡檢速度快,而抗酸染色I(xiàn)OOX油鏡視野較小,鏡檢較慢,因此,應(yīng)用金胺“0”熒光染色法檢測抗酸桿菌是一種簡便,準(zhǔn)確方法,適合于大批量標(biāo)本檢測,值得在臨床上推廣.參考文獻(xiàn)1中國防癆協(xié)會.結(jié)核病細(xì)菌學(xué)檢驗規(guī)程J.中國防癆雜志,1996,18(1):2829.2KunimotoDY,PeppierMS,TalbotJ,eta1.AnalysisofmycobactefiumaviumcomplexisolatesfrombloodsamplesofAIDSpatientsbypulsedfieldgelelectrophoresisJ.JClinMicrobiol,2003,41(1):498499.3WillamHB,KerryHL,RandallH,eta1.Identificationofacontami.natingmycobacteriumtuberculosisstrainwithatranspositionofanIS6110insertionelementresultinginanalteredspoligotypeJ.JClinMicrobiol,2001,39(3):10921096.(收稿日期:200710一l8)