乙肝病毒檢測,方法學評價,乙肝病毒結構,（一） 乙型肝炎病毒結構特點,HBsAg：是HBV感染的主要標志 HBsAb：保護性抗體 HBcAg：僅存于感染的肝細胞核內， 一般不存在于血循環(huán)中 HBcAb: 非保護性抗體，HBcAb-IgM 提示HBV處于復制狀態(tài) HBeAg：HBV復制及強感染性的指標 HBeAb：有一定的保護作用，預后良好,患者血清中存在三種基本形態(tài),大球型顆粒，又稱Dane顆粒；小球型顆粒；管型顆粒 小球型顆粒；管型顆粒 管型顆粒,乙型肝炎病毒的實驗室診斷,（一）血清學檢查 （二）生化學檢查 （三）HBV DNA、基因型和變異檢查,血清學檢查,項目：HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc以及抗-HBc IgM 方法 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay，最常用，定性),HBsAg 感染的標志 Anti-HBs 既往感染/接種疫苗 Anti-HBc IgM 急性感染標志 Anti-HBc IgG 既往或慢性感染 HBeAg 急性病毒復制，有傳染性 Anti-HBe 病毒不再復制 HBV-DNA 急性病毒復制，比HBeAg更準確；主要用于監(jiān)測治療反應,HBV血清學標志物的臨床意義,兩對半的意義, 乙型肝炎的診斷 判斷傳染性 判斷預后 篩查獻血員 流行病學調查,乙肝三系定性檢查是用來判斷是否感染乙肝或粗略估計病毒復制水平的初步檢查，對患者病情程度的評估參考性不大，所以乙肝患者在做乙肝三系定性檢查的時候，應結合肝功能檢查、乙肝病毒DNA檢查、B超檢查等來判定病情的輕重，,ELISA檢測靈敏低的原因及局限,ELISA法受其自身敏感性和特異性的限制; HBV S和前C基因區(qū)出現(xiàn)位點突變導致HBsAg和HBeAg表達缺陷。 影響因素多,如加樣時間,試劑平衡時間,樣本溶血程度等等。特別是低濃度樣本易導致假陰性結果,使弱陽性樣本漏檢。 急性感染的窗口期; HBsAg檢測方法靈敏度不足;血清亞型的漏檢等。 標本中病毒顆粒少;,血清學檢測的局限性,HBV具有“檢測窗口期 假陰性結果 無法檢測突變株及抗體,乙肝病毒的定量檢測,1、乙肝表面抗原（HBsAg）定量檢測： 1）參考值：0-0.05IU/mL 2）臨床意義： （1）可作為HBV攜帶者乙肝病毒復制的參考指標 （2）評價拉美呋定的治療效果 （3）監(jiān)測應用alpha-干擾素治療病人的乙肝病毒復制 （4）確定肝移植病人免疫球蛋白的使用劑量,2.乙肝表面抗體（抗-HBs）定量測定：,是HBsAg刺激機體產(chǎn)生的特異性抗體，是一種保護性抗體，能中和HBV。 （1）抗-HBs含量在0-10mIU/ml，表示不具有保護性，需要注射乙肝疫苗（3針：0-1-6方案）。 （2）抗-HBs含量在10-100mIU/ml，表示具有保護性，但較弱，需要乙肝疫苗強化注射（1針）。 （3）抗-HBs含量大于100mIU/ml，表示具有很強的保護性，不需要注射乙肝疫苗。,3、乙肝病毒e抗原（HBeAg） HBeAg增高說明病毒復制，具有很強的傳染性。 4、乙肝病毒e抗體（抗-HBe） 抗-HBe陽性說明病毒復制減少，傳染性弱，但并非沒有傳染性。抗HBe不是保護性抗體 。,5、乙肝病毒核心抗體（抗-HBc） 抗-HBc：不是中和抗體，有IgG和IgM兩種形式。IgM在早期出現(xiàn)，而IgG在恢復期出現(xiàn)，可持續(xù)多年或終身存在。,乙肝五項定量檢測的優(yōu)點,由于乙肝病毒容易發(fā)生變異，再加上乙肝定性檢測方法的局限性，會出現(xiàn)假陰性結果，導致不能及時發(fā)現(xiàn)乙肝的感染，也就不能得到及時的治療，對醫(yī)護人員和其他患者也存在著被感染的威脅。 乙肝五項定量應用目前最先進的化學發(fā)光法檢測，避免了假陰性和漏檢的問題，而且準確，尤其對乙肝病人的療效觀察提供了依據(jù)，這是檢驗發(fā)展的趨勢。,兩對半定量檢測極大地提高了檢測的靈敏度，LiCa技術檢測HBsAg靈敏度可達05ng/ml，而ELISA檢測HBsAg達到2ng/ml時才會陽性。 急性乙肝早期定量能及早檢出HBsAg，確證HBV感染，幾乎能與PreSi同時檢測，在病程觀察中大大縮短了“窗口期”，而酶標檢測在乙肝早期往往HBsAg呈陰性。 慢性乙肝一些患者由于機體常缺乏對HBV包膜蛋白的免疫應答，HBsAg表達較低，酶標檢測可出現(xiàn)HBsAg和HBsAb均陰性的情況，而定量檢測則可避免這些情況的出現(xiàn)，為正確判斷病情提供依據(jù)。 靈敏度如病毒發(fā)生變異后，表達量較低，常規(guī)ELISA測不出抗原，而定量檢測具有極高的靈敏度，可發(fā)現(xiàn)極有可能同時檢測出HBsAg和HBsAb，血清中HBsAg含量與病人對HBsAg細胞免疫成反比關系，而肝功能改變則與此種細胞免疫成正比。定量HBsAg是反映這一關系的唯一手段?？砂l(fā)現(xiàn)低濃度的HBsAg攜帶者，特別是一些群體如醫(yī)務工作者及病人家屬等。,定量檢測意義,監(jiān)測疾病發(fā)展 評估藥物療效 指導疫苗接種,國內疫苗評價標準,無應答者:無抗體產(chǎn)生 (5%) - 加強計量復種 低應答者:100 IU/L (20%) - 無須復種,PCR技術在乙肝方面的應用,乙型肝炎病毒屬嗜肝DNA病毒科（hepadnaviridae），基因組長度3.2kb 目前感染人類最小的DNA病毒 部分雙鏈環(huán)狀DNA。,定量PCR的特點,可定量結果，準確靈敏地反應了病原體的感染和治療恢復情況 光譜分析儀直讀結果，自動分析， 增強了靈敏性和客觀性。,HBV基 因 及 編 碼 蛋 白,HBV-DNA定量檢測的臨床應用,慢性乙肝診斷 治療監(jiān)測和療效評價 跟蹤隨訪 預后判斷,（二） HBV-DNA與“兩對半”,1. “兩對半” ：機體的免疫反應狀態(tài)； FQ-PCR：檢測的是HBV本身的遺傳物質DNA，是 病毒存在和復制的最可靠、最直接的指標。 2. “攜帶者”、“大三陽”、“小三陽”等免疫學指標不能 反應體內病毒復制水平與感染程度。,3. 血清學指標()不能排除HBV感染。 4. 也可能出現(xiàn)HBsAg()，HBV-DNA()。 5. HBsAb () 、 HBcAb () 、 HBeAb ()三抗體陽性 與HBV DNA 2.5 103 copy /ml 結果解釋。,HBV-DNA檢測的臨床意義, 診斷方面： HBV DNA是HBV存在最直接的依據(jù) HBV DNA是HBV復制的標志 HBV DNA是患者具有傳染性的標志 對HBV-M起補充作用： HBeAg()/ 抗HBe()乙型肝炎 （前C區(qū)變異） HBsAg()乙型肝炎 （S區(qū)變異） 低水平感染 單項抗HBc()乙型肝炎, 療效判斷： HBV DNA是目前判斷乙肝抗病毒藥物療效最敏感的指標 預后判斷 HBV DNA水平與病情有一定的關系,一、乙肝病毒DNA檢查可檢查乙肝病毒的復制狀況。如乙肝病毒DNA測定值1000copies/ml，就提示乙肝病毒有復制，而且病毒數(shù)量的高低與病毒復制的程度成正相關。若結果陰性，則表明病毒處于不活躍階段，病情比較平穩(wěn)。 二、乙肝病毒DNA檢查還是判斷乙肝病毒傳染性的重要指標。如果乙肝病毒DNA測定值1000copies/ml，常提示具有傳染性，且檢測值越高就說明乙肝病毒復制越活躍，傳染性越強。,三、乙肝病毒DNA檢查可以作為肝病患者確診病情的主要依據(jù)。乙肝病毒DNA陽性者，即使肝功能正常，必要時也應考慮進行抗病毒治療。乙肝抗病毒治療的標準就是乙肝病毒DNA1000copies/ml，且患者轉氨酶超過正常值兩倍，此時是肝病患者抗病毒治療的最佳時機。 四、乙肝病毒DNA檢查結果還可以在一定程度上輔助判斷乙肝病毒是否產(chǎn)生了變異，如在治療過程中乙肝病毒DNA檢測結果由陰性轉為陽性時，則提示病毒已發(fā)生變異，應結合具體病情重新選擇抗病毒藥物。,基因檢測在乙肝診療各階段的應用,藥物治療方案的確定 （用藥：干擾素、拉米夫定、阿德福韋、恩替卡韋）,藥物治療 （療效評價）,前C區(qū)1896位點突變檢測,跟蹤隨訪,乙 肝 病 毒 定 量檢測,確 診,病毒學分析,乙肝病毒分型檢測,拉米夫定耐藥檢測,阿德福韋耐藥檢測,共價閉合環(huán)狀DNA (cccDNA)檢測,恩替卡韋耐藥檢測,FQ-PCR檢測的優(yōu)勢,靈敏度高可以達到 pg 級而 ELISA 只能檢測 ng級，可以檢測包括乳汁的其他低含量的標本; 不受病毒變異影響，而前C和S變異后ELISA難以檢測; 熒光定量PCR 技術采用閉管檢測, 無須凝膠電泳, 避免了交叉污染,實現(xiàn)了對HBV DNA 的定量測定, 其實時監(jiān)測技術使藥物選擇和療效觀察成為可能; 漏檢率低。,謝謝！,