項(xiàng)目名稱： 木質(zhì)纖維素資源高效生物降解轉(zhuǎn)化中的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題研究首席科學(xué)家： 曲音波 山東大學(xué)起止年限： 2011.1 至 2015.8依托部門(mén)： 教育部 山東省科技廳二、預(yù)期目標(biāo)總體目標(biāo)：提出 3-5 套新的木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)生物轉(zhuǎn)化液體燃料和化學(xué)品的生物煉制技術(shù)方案，培養(yǎng)一支高水平的基礎(chǔ)研究和技術(shù)開(kāi)發(fā)隊(duì)伍，最終為在我國(guó)建立大規(guī)模利用木質(zhì)纖維素資源轉(zhuǎn)化液體燃料和大宗化學(xué)品的新型工業(yè)體系，實(shí)現(xiàn)社會(huì)經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展提供理論與技術(shù)基礎(chǔ)。五年預(yù)期目標(biāo)：1）通過(guò)闡述植物生物質(zhì)抗生物降解的組成和結(jié)構(gòu)特征，建立起改造纖維生物質(zhì)組成和結(jié)構(gòu)以提高降解效率的理論體系；解析預(yù)處理技術(shù)對(duì)提高纖維生物質(zhì)降解性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，提出高效、經(jīng)濟(jì)和實(shí)用的預(yù)處理技術(shù)方案；2）研究微生物對(duì)天然或預(yù)處理后底物的降解機(jī)理，特別是纖維素解聚機(jī)理、去結(jié)晶化途徑以及提高纖維素酶的持續(xù)化降解能力的途徑等，探討采用現(xiàn)代系統(tǒng)生物技術(shù)，從復(fù)雜纖維質(zhì)降解多酶體系中，篩選和發(fā)現(xiàn)新的高效、耐逆、適合工業(yè)要求的纖維質(zhì)降解酶類；為降解不同的木質(zhì)纖維素資源研制出低成本且高效的復(fù)合酶系；3）選育適于轉(zhuǎn)化纖維質(zhì)糖分為平臺(tái)化合物的微生物，研究其代謝調(diào)控機(jī)理與機(jī)制，指導(dǎo)構(gòu)建高效代謝工程菌，研究定向轉(zhuǎn)化平臺(tái)化合物的過(guò)程及相關(guān)產(chǎn)品的利用途徑；進(jìn)而通過(guò)對(duì)預(yù)處理、產(chǎn)酶、酶解和發(fā)酵的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)、工程學(xué)和方法論的研究，將預(yù)處理技術(shù)、生物反應(yīng)與分離過(guò)程耦合起來(lái)，提出新的生物煉制技術(shù)方案。4）從木質(zhì)纖維素生物降解轉(zhuǎn)化角度，構(gòu)建纖維素降解和糖轉(zhuǎn)化利用的數(shù)據(jù)庫(kù)，其中包括木質(zhì)纖維素原料組成與結(jié)構(gòu)特征、纖維素降解微生物類群與特性、纖維素酶、半纖維素酶和木素酶及復(fù)合酶系，新型糖代謝的功能微生物等，建立專門(mén)的信息共享平臺(tái)和網(wǎng)站，為實(shí)現(xiàn)大規(guī)模降解轉(zhuǎn)化木質(zhì)纖維素資源提供理論、技術(shù)和信息支撐。五年的可考核指標(biāo): 提出 2-3 種新的高效、低能耗、少抑制物的預(yù)處理方案；篩選到 5-10 種新的關(guān)鍵酶或非酶降解因子，構(gòu)建出高效的纖維素降解酶系，使酶解轉(zhuǎn)化率大于 90%；使噸乙醇用酶成本從 2000 元以上降到 800 元以下；構(gòu)建出能全糖共利用、表達(dá)纖維降解相關(guān)酶組分的統(tǒng)合生物加工工程菌株3-5 株，發(fā)酵性能達(dá)到國(guó)際先進(jìn)水平；綜合前述進(jìn)展，設(shè)計(jì)出多技術(shù)集成、全組分利用、多產(chǎn)品選擇、經(jīng)濟(jì)上有競(jìng)爭(zhēng)力的木質(zhì)纖維素生物煉制技術(shù)路線 3-5 條；發(fā)表相關(guān)研究論文 200 篇以上，包括 SCI 影響因子超過(guò) 5 的論文 5-10 篇，總影響因子超過(guò) 300；三、研究方案1）學(xué)術(shù)思路： 以研究植物木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)對(duì)生物降解的抗性屏障及其破解之道為核心，深入研究微生物的多種多樣的降解天然纖維的策略，探索人類干預(yù)生物降解過(guò)程，認(rèn)識(shí)降解產(chǎn)物的復(fù)雜性，提高其降解轉(zhuǎn)化效率，實(shí)現(xiàn)全部降解糖類的代謝轉(zhuǎn)化，使之轉(zhuǎn)而為人類可持續(xù)發(fā)展服務(wù)的可能途徑。該學(xué)術(shù)思想可以用下圖簡(jiǎn)示：2）技術(shù)途徑： 以植物有效防止微生物及酶降解的抗性屏障為切入點(diǎn)，從宏觀（細(xì)胞） 、微觀（大分子）層次分析納米級(jí)生物催化劑在降解過(guò)程效率低下的原因出發(fā)，植物的防御屏障 纖維素結(jié)晶結(jié)構(gòu) 多種高分子聚集 細(xì)胞壁分層構(gòu)造微生物的破解策略 單酶組分分解反應(yīng) 游離復(fù)合多酶體系 多酶組分協(xié)同作用 固定多酶組合構(gòu)造 生物之間協(xié)同作用物理化學(xué)措施（預(yù)處理技術(shù)） 蒸汽爆碎 酸堿處理 有機(jī)溶劑 綜合法預(yù)處理生物學(xué)措施 新降解因子發(fā)現(xiàn) 酶分子設(shè)計(jì)改造 復(fù)合酶系的重構(gòu) 微生物代謝工程工程技術(shù)措施 單一過(guò)程優(yōu)化 復(fù)合過(guò)程集成 綜合評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 精煉方案設(shè)計(jì)研究可能的物理化學(xué)預(yù)處理途徑，使之有利于納米級(jí)酶分子的作用（擴(kuò)散、持續(xù)性降解與酶分子協(xié)同作用） ，同時(shí)，加強(qiáng)對(duì)微生物降解機(jī)理及其多樣性、酶系組分協(xié)同作用及其合成調(diào)控機(jī)理的研究，對(duì)微生物酶分子和復(fù)合酶系進(jìn)行定向進(jìn)化或理性改造，加強(qiáng)對(duì)纖維降解糖類代謝網(wǎng)絡(luò)的研究和代謝（進(jìn)化）工程菌的構(gòu)建研究，進(jìn)而將一系列的工程技術(shù)手段集成起來(lái)，建立起高效的復(fù)合生物煉制轉(zhuǎn)化系統(tǒng)?？偟募夹g(shù)途徑可以用下圖表示：天然超分子結(jié)構(gòu)分析抗降解性研究預(yù)處理樣品結(jié)構(gòu)分析酶解過(guò)程構(gòu)效關(guān)系 酶系重構(gòu)研究降解機(jī)理研究代謝工程改造代謝網(wǎng)絡(luò)分析糖化、發(fā)酵工程 技術(shù)研究酶系合成調(diào)控研究天然植物生物質(zhì)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料纖維水解糖過(guò)程耦合集成代謝工程菌株纖維降解酶非酶降解因子高效降解酶系纖維素降解微生物發(fā)酵微生物燃料與化學(xué)品3) 創(chuàng)新點(diǎn)與特色： （1）提出木質(zhì)纖維素的抗降解性是生物質(zhì)難以高效轉(zhuǎn)化的核心問(wèn)題，從納米尺度和生物降解角度來(lái)研究木質(zhì)纖維素超分子結(jié)構(gòu)；（2）深入研究生物質(zhì)的微生物降解的多樣性，尋找新的生物降解因子，設(shè)計(jì)出高效的復(fù)合生物催化劑；（3）使用分子生物學(xué)改造相關(guān)的產(chǎn)酶和發(fā)酵微生物，設(shè)計(jì)和構(gòu)建工程微生物，實(shí)現(xiàn)全糖定向生物轉(zhuǎn)化為生物基產(chǎn)品，并使應(yīng)用生物轉(zhuǎn)化過(guò)程的成本及投資明顯降低；（4）完成木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)生物轉(zhuǎn)化技術(shù)的優(yōu)化、耦合和系統(tǒng)集成，為生物質(zhì)綜合生物煉制產(chǎn)業(yè)的建立構(gòu)建理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。課題設(shè)置課題 1、植物生物質(zhì)抗生物降解屏障解析與破解途徑探索研究?jī)?nèi)容：1. 植物纖維類生物質(zhì)抗降解屏障的定量解析高通量、快速纖維生物質(zhì)結(jié)構(gòu)和組成分析。利用近紅外（NIR）結(jié)合 GC-MS細(xì)胞壁組份分析等技術(shù)建立高通量分析、快速測(cè)定生物質(zhì)結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成的技術(shù)，為明確生物質(zhì)結(jié)構(gòu)和組成與纖維生物質(zhì)降解轉(zhuǎn)化之間的關(guān)系以及鑒定經(jīng)分子改良的優(yōu)良品系提供便捷的分析手段。2. 植物細(xì)胞壁生物質(zhì)特性與降解轉(zhuǎn)化效率的關(guān)系建立表征細(xì)胞壁超分子組成與結(jié)構(gòu)的方法，測(cè)定木質(zhì)纖維素生物質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程中基本的物理化學(xué)限制因子；利用木素酶、半纖維素酶、纖維素酶等處理，研究細(xì)胞壁超分子結(jié)構(gòu)中不同組分的構(gòu)效關(guān)系；基于木質(zhì)纖維素超分子結(jié)構(gòu)研究纖維素酶催化過(guò)程的定量構(gòu)效關(guān)系，與酶分子催化動(dòng)力學(xué)過(guò)程，基于定向進(jìn)化、定點(diǎn)突變等新技術(shù)提高酶組分的活力。3預(yù)處理過(guò)程中降解屏障的解構(gòu)過(guò)程及其優(yōu)化研究預(yù)處理技術(shù)對(duì)降解屏障的影響，建立高效打開(kāi)酶分子通道的可行方案?？疾觳煌A(yù)處理?xiàng)l件下的底物成分變化（如纖維素、半纖維素、木素含量變化）和結(jié)構(gòu)變化（纖維素結(jié)晶度、聚合度變化）以及對(duì)可降解性能的影響。探討預(yù)處理過(guò)程中發(fā)酵抑制物的生成動(dòng)力學(xué)。經(jīng)費(fèi)比例：15%承擔(dān)單位：中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所、山東大學(xué)課題負(fù)責(zé)人：陳洪章學(xué)術(shù)骨干：趙建、王祿山、邱衛(wèi)華課題 2、木質(zhì)纖維素生物降解多樣性、新降解因子及相關(guān)機(jī)理研究?jī)?nèi)容：1. 結(jié)晶纖維素結(jié)構(gòu)解聚的分子機(jī)理及相關(guān)生物因子的分離鑒定與特征化在生化分離分析的基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)特定菌種或群落的不同酶活組分及非酶組分的組合配比，借助蛋白質(zhì)組學(xué)定性和定量分析鑒定技術(shù)，分離鑒定能提高木質(zhì)纖維素協(xié)同酶解活性的關(guān)鍵組分；結(jié)合底物超微結(jié)構(gòu)觀察及酶分子吸附模擬，深入研究闡述酶分子在木質(zhì)纖維素高效酶解過(guò)程中的作用機(jī)制。2. 天然纖維素降解的多樣性分析2.1 天然生境纖維素降解微生物群系分析。2.2 分離新型纖維素降解微生物。2.3 用比較基因組學(xué)技術(shù)探尋新的降解策略。3. 新纖維素降解酶和降解因子的發(fā)現(xiàn) 分析新生物降解因子參與纖維素降解或解聚作用的模式與相關(guān)機(jī)理。分析特定環(huán)境高效酶解體系的多樣性與結(jié)構(gòu)組成，從中尋找能促進(jìn)提高現(xiàn)有酶系催化水解效率的新酶、非酶蛋白質(zhì)或非蛋白因子，并獲得新酶或非酶蛋白因子的克隆表達(dá)；在深入研究闡述這些新降解因子在特殊環(huán)境中木質(zhì)纖維素高效酶解過(guò)程中作用機(jī)制的基礎(chǔ)上，從中篩選和發(fā)現(xiàn)新的高效、耐逆、適合工業(yè)要求的促纖維質(zhì)降解因子。經(jīng)費(fèi)比例：15%承擔(dān)單位：中國(guó)科學(xué)院微生物研究所、山東大學(xué)課題負(fù)責(zé)人：董志揚(yáng)學(xué)術(shù)骨干：陳冠軍、劉巍峰、盧雪梅、倪金 鳳課題 3、真菌游離酶系纖維素降解機(jī)理、酶系合成調(diào)控與高效酶系重構(gòu)研究?jī)?nèi)容：1. 真菌纖維素酶合成代謝調(diào)控分子機(jī)制研究在基本完成了對(duì)斜臥青霉原始菌株和抗降解物阻遏的工業(yè)高產(chǎn)纖維素酶突變株的全基因組測(cè)序的基礎(chǔ)上，采用高通量基因組測(cè)序、數(shù)字化全基因組表達(dá)譜分析、熒光差異蛋白表達(dá)分析、RNA 沉默、酵母雙雜交等先進(jìn)技術(shù)，通過(guò)比較基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)等方法，鑒定出關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因/蛋白及其在纖維素酶表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的位置和功能；并利用高效轉(zhuǎn)化和基因評(píng)價(jià)體系對(duì)候選基因進(jìn)行快速功能驗(yàn)證和評(píng)價(jià)，解析哪些基因或通路的改變導(dǎo)致了表型（高產(chǎn)纖維素酶突變、抗降解物阻遏）的變化，從而闡明纖維素酶合成的誘導(dǎo)機(jī)制、阻遏機(jī)理和高產(chǎn)纖維素酶突變的分子基礎(chǔ)，為進(jìn)一步提高菌株產(chǎn)酶能力和改進(jìn)酶系組成提供指導(dǎo)。2.真菌木質(zhì)纖維素降解復(fù)合酶各組分間的協(xié)同作用構(gòu)建纖維素酶、半纖維素酶和最佳酶系的組成和比例以及纖維素材料物理化學(xué)性質(zhì)的數(shù)據(jù)庫(kù)，為降解不同的木質(zhì)纖維素資源調(diào)制低成本且高效的復(fù)合酶系提供理論依據(jù)。分離鑒定能提高木質(zhì)纖維素協(xié)同酶解活性的關(guān)鍵組分，構(gòu)建特定環(huán)境高效酶解體系的結(jié)構(gòu)組成及其相互作用模式，提高纖維素酶各組分酶協(xié)同水解效率，最大限度降低纖維素酶水解過(guò)程中產(chǎn)物反饋抑制效應(yīng)。3. 真菌纖維素酶合成代謝調(diào)控的改造及纖維素酶系的優(yōu)化重構(gòu)選育高分泌表達(dá)菌株；結(jié)合相關(guān)蛋白運(yùn)輸分泌蛋白的轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析，探詢纖維素酶的高分泌機(jī)制。構(gòu)建纖維素酶的高效表達(dá)新系統(tǒng)，培育高效產(chǎn)酶優(yōu)良菌種。針對(duì)絲狀真菌纖維素酶合成代謝關(guān)鍵調(diào)控因子，通過(guò)嵌合體技術(shù)、基因敲除技術(shù)、RNA 干擾技術(shù)和基因過(guò)量表達(dá)技術(shù)等對(duì)真菌纖維素酶表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行人工改造，探索真菌纖維素酶整體表達(dá)水平提高及纖維素酶各組分酶表達(dá)水平的精確調(diào)控，重構(gòu)具有對(duì)纖維素高效水解糖化能力的纖維素酶系，優(yōu)化纖維素酶各組分的結(jié)構(gòu)。經(jīng)費(fèi)比例：25%承擔(dān)單位：山東大學(xué)、中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院、天津工業(yè)生物技術(shù)研究所課題負(fù)責(zé)人：曲音波學(xué)術(shù)骨干：田朝光、方詡、汪天虹、嚴(yán)興、 張磊課題 4、細(xì)菌酶復(fù)合體纖維素降解轉(zhuǎn)化機(jī)理和纖維小體的解析、重構(gòu)研究?jī)?nèi)容：1. 高溫厭氧纖維素降解細(xì)菌及纖維小體的篩選和多樣性研究1.1 從極端環(huán)境中篩選和構(gòu)建厭氧纖維素降解菌群，建立不可培養(yǎng)微生物篩選手段，發(fā)掘高溫厭氧纖維素高效降解細(xì)菌，結(jié)合 16S rRNA 基因分析，研究不可培養(yǎng)微生物的篩選策略；1.2 運(yùn)用高通量基因組測(cè)序技術(shù)，從高效纖維素降解群落中通過(guò)宏基因組分析獲取關(guān)鍵基因信息。分析包括不可純培養(yǎng)細(xì)菌在內(nèi)的高溫厭氧纖維素降解細(xì)菌群落中纖維素降解相關(guān)基因的分布、豐度、可能的協(xié)作及進(jìn)化關(guān)系。通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)分析，結(jié)合生理生化驗(yàn)證，研究纖維素降解復(fù)合體，尤其是纖維小體的組成及多樣性。結(jié)合微生物篩選以及酶活力驗(yàn)證，獲得新的纖維素降解關(guān)鍵基因及輔助因子。2. 纖維小體的解析、體外重構(gòu)、性能改良2.1 研究高效纖維素降解菌株的纖維小體的組成成分，分析各成員在空間上的排列及蛋白蛋白相互作用，解析酶在空間上的集群與功能上的相互配合對(duì)結(jié)晶纖維素降解效率的影響。對(duì)關(guān)鍵蛋白或復(fù)合體進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)解析，從分子水平分析結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系。2.2 體外重構(gòu)纖維小體。進(jìn)一步了解及驗(yàn)證纖維小體的結(jié)構(gòu)、功能及其裝配機(jī)制，為其性狀改良奠定必要的理論基礎(chǔ)。對(duì)纖維小體骨架蛋白進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)、表達(dá)；同時(shí)利用功能基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，對(duì)纖維小體關(guān)鍵酶進(jìn)行篩選并重組表達(dá)，在此基礎(chǔ)上體外構(gòu)建人工纖維小體，并進(jìn)行性狀鑒定。2.3 對(duì)纖維小體進(jìn)行性能改良：廣泛篩選各種互補(bǔ)性酶組分， 在底物特異性、抗逆性、催化活性、功能互補(bǔ)性等方面尋求最佳酶組合，充分發(fā)揮纖維小體固有的協(xié)同效應(yīng)。對(duì)關(guān)鍵酶進(jìn)行理性設(shè)計(jì)或定向進(jìn)化改造，以期提高對(duì)預(yù)處理過(guò)程產(chǎn)生的抑制物的抗逆性，拓寬底物譜，解除產(chǎn)物抑制，最終提高重構(gòu)纖維小體的總體木質(zhì)纖維素降解效率。最后通過(guò)設(shè)計(jì)緊湊型微型纖維小體，降低體外重組纖維小體的難度，以期減少酶生產(chǎn)成本，最終達(dá)到實(shí)用化。3.纖維小體的合成代謝調(diào)控機(jī)制及 CBP 乙醇生產(chǎn)技術(shù)路線的設(shè)計(jì)及改造3.1 對(duì)中高溫產(chǎn)纖維小體模式菌株，包括 C. thermocellum 和 C. cellulolyticum，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析分析，比較菌株在含有纖維素或者其它碳源培養(yǎng)基中基因的表達(dá)情況，通過(guò)蛋白質(zhì)組分析纖維小體的組成變化，根據(jù)這些組學(xué)數(shù)據(jù)，研究嗜熱厭氧菌纖維小體在功能上的進(jìn)化、表達(dá)和調(diào)控機(jī)理。3.2 對(duì)模式菌株熱纖梭菌（C. thermocellum）LQR1 進(jìn)行遺傳改造，設(shè)計(jì)高溫厭氧細(xì)菌混合培養(yǎng)或熱纖梭菌超級(jí)工程菌產(chǎn)乙醇的 CBP 路線。通過(guò)遺傳改造，提高纖維小體的質(zhì)量和數(shù)量，敲除產(chǎn)酸代謝途徑，通過(guò)互補(bǔ)混合培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)五、六碳糖共代謝，提升整體纖維素降解效率，降低生產(chǎn)成本。對(duì)纖維素生物轉(zhuǎn)化過(guò)程采取多種物理化學(xué)手段進(jìn)行表征，監(jiān)測(cè)從預(yù)處理到發(fā)酵完成過(guò)程中木質(zhì)纖維素原料的變化、抑制物及產(chǎn)物的表觀曲線，監(jiān)測(cè)纖維小體在發(fā)酵過(guò)程中組成成分及酶活性的變化，通過(guò)代謝流和代謝組學(xué)分析，對(duì) CBP 發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化，為實(shí)現(xiàn)木質(zhì)纖維素乙醇產(chǎn)業(yè)化奠定基礎(chǔ)。4. 基于纖維小體產(chǎn)生菌生物強(qiáng)化的木質(zhì)纖維素高效降解機(jī)理以木質(zhì)纖維素發(fā)酵制氫為目標(biāo)體系，研究基于中高溫產(chǎn)纖維小體梭菌 C. thermocellum 和 C. cellulolyticum 強(qiáng)化的木質(zhì)纖維素生物降解過(guò)程，建立該降解過(guò)程與發(fā)酵制氫匹配的體系。利用微生物分子生態(tài)手段，追蹤產(chǎn)纖維小體梭菌在混合培養(yǎng)體系中的動(dòng)態(tài)分布；研究纖維小體與木質(zhì)纖維素的相互作用；解析纖維小體在木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化過(guò)程中的功能，從而解析基于纖維小體產(chǎn)生菌生物強(qiáng)化的木質(zhì)纖維素高效降解及轉(zhuǎn)化的機(jī)理。5. 人工菌群設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)木質(zhì)纖維素同步糖化產(chǎn)氫以構(gòu)建木質(zhì)纖維素高效發(fā)酵制氫體系為目標(biāo)，研究中高溫產(chǎn)纖維小體梭菌與產(chǎn)氫菌混合發(fā)酵同步糖化產(chǎn)氫過(guò)程，揭示菌群間的相互作用機(jī)制。通過(guò)人工菌群合理設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)纖維素降解菌和產(chǎn)氫菌的協(xié)同作用，研究人工菌群在糖轉(zhuǎn)化（纖維素、寡糖、二糖、己糖、戊糖） 、中間代謝中產(chǎn)物（甲酸等有機(jī)酸）的代謝流相互作用，構(gòu)建人工菌群代謝網(wǎng)絡(luò)模型，解析混合菌群的關(guān)鍵代謝調(diào)控節(jié)點(diǎn)，特別是研究人工菌群中糖代謝對(duì)纖維素降解的解抑制及其緩釋提高產(chǎn)氫菌產(chǎn)氫得率的機(jī)理和方法。經(jīng)費(fèi)比例：14%承擔(dān)單位：中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所、清華大學(xué)課題負(fù)責(zé)人：崔球?qū)W術(shù)骨干：邢新會(huì)、李福利、宋厚輝課題 5、纖維降解組分高效生物轉(zhuǎn)化的代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控與改造研究?jī)?nèi)容：1. 微生物戊糖代謝與轉(zhuǎn)運(yùn)網(wǎng)絡(luò)的解析解析相關(guān)菌株的戊糖代謝相關(guān)基因的功能與作用，解析戊糖運(yùn)輸和代謝機(jī)理；考察葡萄糖和戊糖的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，并對(duì)其各自轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)進(jìn)行研究，進(jìn)一步解析葡萄糖對(duì)戊糖利用的抑制作用，研究如何解除抑制的方法，為進(jìn)一步提高戊糖的利用效率提供理論支撐；開(kāi)展轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析、代謝控制分析和代謝流向分析，研究菌株的代謝途徑、代謝節(jié)點(diǎn)以及各種調(diào)節(jié)機(jī)制的變化，加深對(duì)戊糖代謝調(diào)控機(jī)理的認(rèn)識(shí)；根據(jù)輔酶工程理念，進(jìn)行分子改造或發(fā)酵工程調(diào)控，改變輔酶特異性，解決氧化還原不平衡問(wèn)題；構(gòu)建高效能的磷酸戊糖途徑，使木糖、阿拉伯糖等戊糖代謝的中間產(chǎn)物進(jìn)入中心代謝途徑并向目標(biāo)代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)化。2. 微生物遺傳操作體系的建立根據(jù)微生物的遺傳特性，利用基因工程技術(shù)，建立或改進(jìn)其分子操作體系，為菌株的遺傳改造提供高效的技術(shù)平臺(tái)。首先，對(duì)已成熟的大腸桿菌和酵母遺傳操作體系進(jìn)行改進(jìn)，根據(jù) Cre/lox 位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)的特點(diǎn)，建立適用于酵母等工業(yè)菌株的位點(diǎn)特異性系統(tǒng)及規(guī)范化操作流程，以去除因分子生物學(xué)操作引入基因組中的抗性標(biāo)記基因；進(jìn)而建立以不同啟動(dòng)強(qiáng)度的啟動(dòng)子為基礎(chǔ)的能夠不同水平表達(dá)目標(biāo)基因的表達(dá)體系；直接在酵母中表達(dá) -葡萄糖苷酶等纖維降解酶系組分。其次，對(duì)遺傳操作不成熟的放線桿菌、梭菌等，進(jìn)行遺傳體系的探索與建立，為其代謝工程改造提供技術(shù)支撐。3. 利用進(jìn)化或系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)提高相關(guān)工程菌的抗逆性能分析不同預(yù)處理?xiàng)l件下纖維素原料水解液中的主要毒性成分及其含量，通過(guò)現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)與經(jīng)典的微生物選育技術(shù)相結(jié)合，獲得對(duì)纖維素水解液中抑制因子的高抗性菌株。利用系統(tǒng)性擾動(dòng)與高通量的分析技術(shù)（如各種組學(xué)技術(shù)） ，結(jié)合代謝網(wǎng)絡(luò)的定量調(diào)控和計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)，對(duì)菌株抗逆性能機(jī)制進(jìn)行研究。4. 大宗化學(xué)品生產(chǎn)用代謝工程菌的研究和改造4.1 構(gòu)建利用纖維降解組分的工程菌，生產(chǎn)大宗平臺(tái)化合物。選擇大腸桿菌、酵母、梭菌、運(yùn)動(dòng)單胞菌等作為出發(fā)菌株，通過(guò)基因操作的手段，運(yùn)用發(fā)酵和代謝工程的技術(shù)方法，可控制地生產(chǎn)重要平臺(tái)化合物。通過(guò)對(duì)菌體膜運(yùn)輸系統(tǒng)的研究和改造，提高菌體對(duì)底物的利用能力，消除二階段生長(zhǎng)現(xiàn)象，使其能夠同時(shí)利用纖維素水解物中的多種碳源；提高菌體的抗逆及抗不良環(huán)境（耐酸和耐抑制物）的能力；以琥珀酸、乙醇等為代表，通過(guò)異源表達(dá)和代謝阻遏提高菌體合成目標(biāo)化合物的能力。4.2 建立利用纖維水解全糖組分的系統(tǒng)或者體系，并注重體系的協(xié)同效應(yīng)和高值轉(zhuǎn)化利用。在大腸桿菌、運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌等菌株中構(gòu)建以木糖 /阿拉伯糖為唯一碳源的工程菌，并利用工程菌生產(chǎn)乳酸、琥珀酸、聚羥基脂肪酸酯（PHA） 、丁醇、氨基酸、木糖醇等。經(jīng)費(fèi)比例：17%承擔(dān)單位：南京工業(yè)大學(xué)、山東大學(xué)、中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所課題負(fù)責(zé)人：姜岷學(xué)術(shù)骨干：祁慶生、鮑曉明、何冰芳、蔡恒、譚海東課題 6、木質(zhì)纖維素降解轉(zhuǎn)化過(guò)程強(qiáng)化的工程學(xué)原理與方法研究?jī)?nèi)容：1. 產(chǎn)酶、酶解和發(fā)酵過(guò)程特性與優(yōu)化控制研究1.1 產(chǎn)酶、酶解和發(fā)酵的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究：以降低能耗為目標(biāo)，通過(guò)實(shí)驗(yàn)和理論分析，解析上述反應(yīng)系統(tǒng)中各因素的相互作用關(guān)系，采用分層建模方式（由簡(jiǎn)單到復(fù)雜）逐步完善纖維質(zhì)原料同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)乙醇過(guò)程的動(dòng)力學(xué)模型，并根據(jù)敏感性分析，探討底物中抑制物濃度、底物酶解性能與發(fā)酵性能三者之間的定量關(guān)系。由動(dòng)力學(xué)模型從理論上分析同步糖化發(fā)酵過(guò)程的控制策略。1.2 非均相酶解發(fā)酵過(guò)程的優(yōu)化控制：考慮非均相酶解過(guò)程的主要特點(diǎn)，包括纖維素原料的特點(diǎn)（結(jié)晶度、聚合度、粘度） 、纖維質(zhì)原料對(duì)纖維素酶的吸附（特別是木素對(duì)纖維素酶的不可逆失活吸附）等酶解性能與發(fā)酵性能之間的定量關(guān)系，分析溫度、酶用量、底物濃度控制策略。對(duì)不同反應(yīng)器規(guī)模下的發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化和控制。1.3 纖維素降解轉(zhuǎn)化過(guò)程放大的基礎(chǔ)研究：針對(duì)木質(zhì)纖維素降解轉(zhuǎn)化過(guò)程的特點(diǎn)（極限低水用量、極高固體含量、極低纖維素酶用量與發(fā)酵營(yíng)養(yǎng)等） ，研究工業(yè)化約束條件下的資源節(jié)約型過(guò)程集成中的基礎(chǔ)理論問(wèn)題和過(guò)程放大方法論；高粘度多相流體系的混合與傳遞過(guò)程的數(shù)學(xué)模擬、生物轉(zhuǎn)化與代謝過(guò)程中酶與細(xì)胞狀態(tài)的定量表征與調(diào)控、復(fù)雜化學(xué)反應(yīng)與酶反應(yīng)體系的反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)動(dòng)力學(xué)模型與過(guò)程強(qiáng)化；木質(zhì)纖維素降解產(chǎn)物的直接分離技術(shù)以及其它新型節(jié)能型分離技術(shù)；木質(zhì)纖維素全組分的物性數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建；基于 Aspen plus 平臺(tái)上的過(guò)程模型化與優(yōu)化；木質(zhì)纖維素降解過(guò)程全流程集成的 Mini-Plant 評(píng)價(jià)系統(tǒng)。2. 預(yù)處理技術(shù)、生物反應(yīng)與分離過(guò)程的耦合和集成系統(tǒng)2.1 適合預(yù)處理的物料與聯(lián)產(chǎn)反應(yīng)條件：測(cè)量底物預(yù)處理前后的纖維素、半纖維素、木素含量變化、纖維素結(jié)晶度、聚合度變化等參數(shù)，研究不同預(yù)處理?xiàng)l件下發(fā)酵抑制物（乙酸、糠醛、5-羥甲基糠醛等）的生成動(dòng)力學(xué)；研究異質(zhì)性底物降解過(guò)程中反應(yīng)的不均一性；研究酶組分耐酸堿性環(huán)境、耐毒性物質(zhì)的適應(yīng)機(jī)理，對(duì)其進(jìn)行定向進(jìn)化與理性改造；探索針對(duì)特定預(yù)處理物料的高效酶組分組合的轉(zhuǎn)化產(chǎn)糖系統(tǒng)；并建立潛在的污染評(píng)價(jià)體系。2.2 預(yù)處理、生化反應(yīng)和產(chǎn)物分離過(guò)程的節(jié)能和酶循環(huán)利用：為代替?zhèn)鹘y(tǒng)的高耗能濃縮生物燃料蒸餾法，致力于將有機(jī)溶劑和水有效分離的新型材料的基礎(chǔ)研究，力圖開(kāi)發(fā)省能源、可連續(xù)式生產(chǎn)的新型膜分離技術(shù)；研究新型酶載體，開(kāi)發(fā)纖維素酶回收技術(shù)，通過(guò)纖維素酶的再循環(huán)利用，降低酶的成本； 2.3 物料的全轉(zhuǎn)化與高值產(chǎn)品的多樣化：發(fā)展新的過(guò)程耦合技術(shù)和集成系統(tǒng)；優(yōu)化預(yù)處理-酶解糖化-雜多糖發(fā)酵過(guò)程，通過(guò)高效發(fā)酵與代謝流控制產(chǎn)生多種高值化工產(chǎn)品。經(jīng)費(fèi)比例：14%承擔(dān)單位：清華大學(xué)、華東理工大學(xué)課題負(fù)責(zé)人：鮑杰學(xué)術(shù)骨干：劉德華、張建安、葉蕊芳、程可可四、年度計(jì)劃研究?jī)?nèi)容 預(yù)期目標(biāo)第一年1、研究不同生長(zhǎng)期、不同干燥方式、不同產(chǎn)地等對(duì)原料細(xì)胞壁的生物結(jié)構(gòu)、化學(xué)組成的影響?？疾觳煌A(yù)處 理?xiàng)l件下木質(zhì)纖維素原料的成分變化，2、開(kāi)展特殊環(huán)境微生物元基因 組研究，建立纖維素降解酶高通量 篩選平臺(tái)，對(duì)堆肥、熱泉等微生物生態(tài)群系及糖苷水解酶進(jìn)行動(dòng)態(tài)分析。3、針對(duì)重要纖維素降解微生物開(kāi)展基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組 學(xué)研究，探索各酶及蛋白因子在纖維素降解過(guò)程中的機(jī)制及協(xié)同作用。4、研究絲狀真菌纖維素酶合成以及分泌過(guò)程中的關(guān)鍵因子，鑒定 纖維素酶合成、分泌、修飾的結(jié)構(gòu)基因或 調(diào)控基因。5、研究纖維小體結(jié)構(gòu)域的基因聚 類及信息學(xué)分析，對(duì)代表性類型 進(jìn)行重組表達(dá)；對(duì)代表性纖維素降解體系的關(guān)鍵蛋白質(zhì)成分進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析；6、利用微生物誘變選育技術(shù)和分子生物學(xué)手段選育優(yōu)良的突變菌株或基因工程菌株；對(duì)大腸桿菌、酵母等開(kāi)展系 統(tǒng)分析、代謝控制分析和代謝流向分析，研究菌株的代謝途徑、代謝節(jié)點(diǎn)以及各種 調(diào)節(jié)機(jī)制的變化，深化對(duì)微生物戊糖代 謝調(diào)控機(jī)理的認(rèn)識(shí)。7、啟動(dòng)產(chǎn)酶發(fā)酵、酶水解和乙醇發(fā)酵體系的動(dòng)力學(xué)與過(guò)程特性研究，木 質(zhì)纖維素降解轉(zhuǎn)化過(guò)程放大的工程學(xué)基礎(chǔ)研究，預(yù)處理體系與生物煉制聯(lián)產(chǎn) 系統(tǒng)的綜合評(píng)價(jià)。1、建立高通量分析、快速測(cè)定生物質(zhì)結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成的技術(shù)2、構(gòu)建 2-3 個(gè)特殊環(huán)境微生物元基因組文庫(kù)；篩選、發(fā)現(xiàn)新的與纖維 素降解相關(guān)新基因 10-20 個(gè)，克隆 5-10 個(gè)不同來(lái)源纖維素酶組分酶基因及非酶蛋白因子基因，確定其酶學(xué)性質(zhì)3、完成木霉、哈氏嗜纖維菌等不同纖維素酶誘導(dǎo)和抑制條件下差異表達(dá)譜的分析；發(fā)現(xiàn) 2-3 個(gè)絲狀真菌 纖維素酶合成、修飾、分泌過(guò)程中起關(guān)鍵作用的基因。4、獲得高溫厭氧纖維素高效降解 細(xì)菌 15 株，建立不可培養(yǎng)微生物的 篩選策略。5、構(gòu)建 Cohesin 和 Dockerin 的重組表達(dá)體系，獲得純化的重組蛋白；確定代表性纖維素降解體系的關(guān)鍵成分；6、解析基于纖維小體產(chǎn)生菌生物 強(qiáng)化的木質(zhì)纖維素高效降解機(jī)理， 實(shí)現(xiàn)汽爆秸稈的高效水解，得糖率達(dá)到 80%以上；7、建立并改進(jìn)適用于相關(guān)微生物的方便實(shí)用的多套遺傳操作體系；選育多株抗逆性良好、戊糖代謝能力較強(qiáng) 的突變菌株或基因工程菌株；8、構(gòu)建纖維質(zhì)原料的產(chǎn)酶發(fā)酵、同步糖化發(fā)酵過(guò)程的動(dòng)力學(xué)模型，完成不同預(yù)處理?xiàng)l件下發(fā)酵抑制物的生成動(dòng)力學(xué)。發(fā)表論文 35-40 篇，專著 1-2 本。申請(qǐng)專利 5 項(xiàng)左右。研究?jī)?nèi)容 預(yù) 期目標(biāo)第二年1、測(cè)定纖維素的超微結(jié)構(gòu)與整體 結(jié)構(gòu)性質(zhì)；利用纖維素晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，構(gòu)建寡糖、纖維素微纖絲及其聚集體的 結(jié)構(gòu)模型。2、采用 HPLC、質(zhì)譜等分析手段，定性分析不同預(yù)處理?xiàng)l件下木質(zhì)纖維素原料抑制物生成種類。3、繼續(xù)進(jìn)行元基因組文庫(kù)纖維 素酶高通量篩選，對(duì)新發(fā)現(xiàn)的纖維 素降解酶進(jìn)行克隆表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)分析。 進(jìn)行纖維素酶持續(xù)性催化的熱力學(xué)/動(dòng)態(tài) 學(xué)過(guò)程和非酶因子在纖維素降解過(guò)程中作用機(jī)制的研究，發(fā)現(xiàn)的纖維素降解復(fù)合體（ 纖維小體）中新的酶組分進(jìn)行純化、鑒 定。解析纖維小體的酶空間集群排列；進(jìn)行腳架蛋白的設(shè)計(jì)及制備；4、分析不同株系絲狀真菌、好氧細(xì)菌、厭氧細(xì)菌纖維素降解相關(guān)基因在不同誘導(dǎo)和阻遏條件下、不同時(shí)期表達(dá)水平和動(dòng)態(tài)變化，考察差異基因?qū)w維 素酶合成的影響，系統(tǒng)闡述多種不同生物的 纖維素降解策略。5、分別建立中高溫/中溫解纖維梭菌強(qiáng)化的木質(zhì)纖維素高效降解汽爆玉米秸稈工藝；選擇與木質(zhì)纖維素降解菌生長(zhǎng)條件匹配的高效產(chǎn)氫菌株；研究各種產(chǎn)氫菌株的特性，優(yōu)化其培養(yǎng)基及培養(yǎng)工 藝條件；混合培養(yǎng)產(chǎn)氫菌株與產(chǎn)纖維小體梭菌，研究各組合菌株的協(xié)同度。6、對(duì)能夠利用戊糖的菌株（重 組酵母、丙酮丁醇梭菌、芽孢桿菌等），考察其相關(guān)耐受性( 相關(guān)毒素、產(chǎn)物) ，對(duì)其抗逆性能機(jī)制進(jìn)行研究；針對(duì)不同產(chǎn)品， 結(jié)合代謝網(wǎng)絡(luò)分析，剖析菌體生長(zhǎng) 與主產(chǎn)物抑制的關(guān)鍵因子；考察菌株利用纖維水解糖液代謝合成重要平臺(tái)化合物的性能。7、繼續(xù)產(chǎn)酶發(fā)酵、酶水解和乙醇發(fā)酵體系的動(dòng)力學(xué)與過(guò)程特性研究，非均相酶解與發(fā)酵過(guò)程的優(yōu)化控制，木 質(zhì)纖維素降解轉(zhuǎn)化過(guò)程放大的工程學(xué)基礎(chǔ)研究， 預(yù)處理體系與生物煉制聯(lián)產(chǎn)系統(tǒng)綜合評(píng)價(jià)。1、闡明木質(zhì)纖維素原料的微纖絲 與其它主要結(jié)構(gòu)成分（木素和非纖維素類的多糖）的相互關(guān)系；揭示生物質(zhì)在各種條件預(yù)處理過(guò)程中的物理和化學(xué)變化規(guī)律；2、篩選到纖維素酶新基因 10-30 個(gè)；確定 3-5 個(gè)影響纖維素酶高效表達(dá) 調(diào)控新基因的生物學(xué)功能，揭示其參與纖維素酶合成代謝調(diào)控分子機(jī)制；發(fā)現(xiàn) 2-3 個(gè)絲狀真菌纖維素酶合成、修飾、分泌過(guò)程中受不同誘導(dǎo)條件調(diào)控的關(guān)鍵新基因；獲得 1-2 種高效降解木質(zhì)纖維素的復(fù)合 酶系。3、獲得特定菌株降解纖維素的最佳條件及作用范圍，發(fā)現(xiàn)新的酶組 分并闡述其降解性質(zhì)；獲得熱纖梭菌不同碳源的轉(zhuǎn)錄譜，以及一些纖維小體表達(dá) 調(diào)控相關(guān)的關(guān)鍵基因，并初步闡明其調(diào)控機(jī)理。4、建立 CBH 催化纖維素降解動(dòng)力學(xué)/動(dòng)態(tài)學(xué)模型，獲得不同 Dokerin 及Cohesin 的親和力數(shù)據(jù)，分析各功能酶組分的空間排列樣式，設(shè)計(jì)出數(shù)種微型腳架蛋白并重組制備；5、建立木質(zhì)纖維素生物降解過(guò) 程與發(fā)酵匹配的體系，初步揭示協(xié) 同作用機(jī)理；選育得到多株對(duì)纖維水解液中抑制因子具有高抗性的菌株，并解析其抗逆機(jī)制；選育得到多株能夠利用纖維水解液代謝合成重要平臺(tái)化合物的菌株，完成對(duì)菌株生長(zhǎng)和主產(chǎn)物抑制因子的研究。6、完成基于敏感性分析的底物抑制物濃度、底物酶解性能與發(fā)酵性能三者之間的定量關(guān)系研究；完成對(duì)纖維質(zhì)原料的本征參數(shù)以及對(duì)纖維素酶的吸附特性等與過(guò)程效率之間的關(guān)系進(jìn)行定量分析；完成工程冷模實(shí)驗(yàn)手段對(duì)過(guò)程的混合與傳遞特性的研究，提出過(guò)程放大基本準(zhǔn) 測(cè)；完成異質(zhì)性底物降解過(guò)程中反應(yīng)的不均一性；完成構(gòu)建木質(zhì)纖維素全組分的物性數(shù)據(jù)庫(kù)。發(fā)表論文 35-45 篇，專著 1-2 本。專利 5 項(xiàng)左右。研究?jī)?nèi)容 預(yù) 期目標(biāo)第三年1、基于木質(zhì)纖維素超分子結(jié)構(gòu)研究 纖維素酶催化過(guò)程的定量構(gòu)效關(guān)系， 結(jié)合酶分子催化動(dòng)力學(xué)過(guò)程分析，分析不同微 纖絲組成的超分子空間屏障及限速步驟，為定向進(jìn)化/理性改造奠定理論 基礎(chǔ)。2、利用表面分析技術(shù)、紅外光譜等技術(shù)手段，考察預(yù)處理對(duì)木質(zhì)纖維 素原料細(xì)胞壁組織結(jié)構(gòu)中纖維素、半纖維 素及木質(zhì)素等主要物質(zhì)之間的化學(xué)鍵類型及空間構(gòu)型等的影響。3、對(duì)獲得纖維素酶新基因進(jìn)行定向 進(jìn)化改造，將其在纖維素酶生產(chǎn) 菌株中進(jìn)行高效表達(dá)，分析基因工程菌所產(chǎn)纖維素酶對(duì)木質(zhì)纖維素降解能力的提高。3、通過(guò)對(duì)纖維素酶生產(chǎn)菌株合成代 謝途徑分子改造，優(yōu)化纖維素酶 各組分及非酶因子組成結(jié)構(gòu)，挖掘影響絲 狀真菌纖維素酶合成、修飾、分泌效率的調(diào)控蛋白或基因，探索絲狀真菌纖維素酶 的高效分泌機(jī)制，闡明各種蛋白質(zhì)組分協(xié) 同效應(yīng)的作用機(jī)制。4、通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)分析，結(jié)合生理生化驗(yàn)證，研究篩選得到的纖維 小體的組成及多樣性，解析關(guān)鍵蛋白的結(jié) 構(gòu)， 組裝人工纖維小體。5、建立產(chǎn)纖維小體梭菌與產(chǎn)氫 菌混合發(fā)酵體系，研究同步糖化產(chǎn)氫過(guò) 程的相互作用機(jī)制，解析產(chǎn)纖維小體梭菌 強(qiáng)化木質(zhì)纖維素降解過(guò)程。6、解析戊糖代謝機(jī)理和抗逆性代 謝，利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝流向技術(shù)分析菌株性狀改變的機(jī)制和代謝節(jié)點(diǎn)，并 進(jìn)行輔酶工程的初步研究；建立利用纖維水解全糖組分的系統(tǒng)或者體系，并注重體系的 協(xié)同效應(yīng)和高效轉(zhuǎn)化。7、繼續(xù)產(chǎn)酶發(fā)酵、酶水解和乙醇發(fā)酵體系的動(dòng)力學(xué)與過(guò)程特性研究，非均相 酶解與發(fā)酵過(guò)程的優(yōu)化控制，木 質(zhì)纖維素降解轉(zhuǎn)化過(guò)程放大的工程學(xué)基礎(chǔ)研究， 預(yù)處理體系與生物煉制聯(lián)產(chǎn)系統(tǒng)的綜合評(píng)價(jià)，預(yù)處理、同步糖化與發(fā)酵和產(chǎn) 物分離過(guò)程的節(jié)能和酶再生利用。1、闡明不同預(yù)處理對(duì)原料細(xì)胞壁生物結(jié)構(gòu)的影響規(guī)律，并建立相關(guān)的原料 結(jié)構(gòu)屏障解聚模型； 2、篩選獲得纖維素酶新基因 20-30 個(gè)，確定其酶學(xué)性質(zhì)，闡明 3-5 種重要酶的生物學(xué)功能；篩選出 2-3 中有效提高木 質(zhì)纖維素水解效率的協(xié)同因子，獲 得 1-2 個(gè)經(jīng)過(guò)理性改造/定向進(jìn)化后特性改善的 纖維素酶，發(fā)現(xiàn) 2-3 個(gè)影響絲狀真菌纖維素酶合成、修飾、分泌的新基因。3、闡明從環(huán)境分離到的高溫 厭氧纖維素降解細(xì)菌在利用不同底物時(shí)的纖維素酶表達(dá)差異，解析 1 到 2 個(gè)關(guān) 鍵蛋白或復(fù)合體的三維結(jié)構(gòu)；制備得到關(guān)鍵纖維小體亞基，構(gòu)建得到有活性的人工 纖維小體；4、獲得 1-2 株高產(chǎn)纖維小體的突變菌株，獲得高產(chǎn)纖維小體的最優(yōu)發(fā) 酵條件；人工構(gòu)建同步糖化產(chǎn)氫菌群， 實(shí)現(xiàn)蒸汽爆破玉米秸稈的同步糖化產(chǎn)氫， 氫氣得率達(dá)到 1.5mol 氫氣/mol 已糖以上。5、選育得到多株高效利用纖維 水解全糖組分的菌株，并解析其代謝 機(jī)制；解析不同發(fā)酵策略引起微生物胞內(nèi)輔酶水平變化的分子機(jī)制及其與生產(chǎn)效率之間的關(guān)系；建立多套纖維水解全糖組分轉(zhuǎn)化利用的系統(tǒng)，分析菌體生長(zhǎng)與產(chǎn) 物代謝合成的瓶頸。6、完成動(dòng)力學(xué)模型的理論分析以及同步糖化發(fā)酵過(guò)程的控制策略；完成針對(duì)特定預(yù)處理物料的高效酶組分組合的轉(zhuǎn)化產(chǎn)糖系統(tǒng)；完成高粘度多相流體系的混合與傳遞過(guò)程的數(shù)學(xué)模擬、生物 轉(zhuǎn)化與代謝過(guò)程中酶與細(xì)胞狀態(tài)的定量表征與調(diào)控；完成同步糖化與發(fā)酵過(guò)程中酶與細(xì)胞對(duì)酸堿性環(huán)境和有毒性物質(zhì)的適應(yīng)機(jī)理，并完成對(duì)其進(jìn)行定向馴化與改造；完成以工程手段降低預(yù)處理過(guò)程的蒸汽能耗、同步糖化與發(fā)酵過(guò)程的機(jī)械能耗和乙醇精餾過(guò)程能耗目標(biāo)發(fā)表 SCI 論文 35-45 篇；申請(qǐng)發(fā)明專利 5-8 項(xiàng) 。研究?jī)?nèi)容 預(yù) 期目標(biāo)第四年1、闡明纖維素降解過(guò)程中的分子 動(dòng)態(tài)行為與能量轉(zhuǎn)化規(guī)律，纖維素晶 態(tài)的能量分布和結(jié)構(gòu)特征對(duì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。分析不同預(yù)處理方式下影響原料酶解和發(fā)酵性能抑制物關(guān)鍵因子的成分、種 類，并確定其臨界含量。2、建立難培養(yǎng)微生物分離培養(yǎng)方法，從瘤胃、白蟻后腸中分離新型高效降解 纖維素的微生物，構(gòu)建新型高效 纖維素降解微生物基因組文庫(kù)，篩選新的 纖維素降解酶， 對(duì)已篩選到非酶新降解因子 進(jìn)行生物學(xué)功能分析。3、探討斜臥青霉纖維素酶合成、修飾、分泌過(guò)程中多個(gè)關(guān)鍵基因的相互影響。利用定向進(jìn)化、定點(diǎn)突變等技術(shù) 構(gòu)建各種突變株，考察其纖維素酶生產(chǎn)能力的差異。將具備協(xié)同作用的蛋白（酶）在絲狀真菌中進(jìn)行異源表達(dá)，考察重構(gòu)后復(fù)合酶系的水解效率，并通過(guò)調(diào)節(jié)不同蛋白 組分的比例，進(jìn)一步優(yōu)化復(fù)合酶系的水解效率。5、對(duì)纖維小體關(guān)鍵功能酶的性能 進(jìn)行優(yōu)化改造，改善底物譜、抗逆性及催化效率。研究梭菌混合發(fā)酵產(chǎn)乙醇體系，篩選及優(yōu)化混和培養(yǎng)菌株；研究人工菌群在糖轉(zhuǎn)化、中間代謝的代謝流相互作用，構(gòu)建人工菌群代謝網(wǎng)絡(luò)模型，解析混合菌群的關(guān)鍵代謝調(diào)控節(jié)點(diǎn)，研究人工菌群中糖代謝對(duì)纖維素降解的解抑制及其緩釋提高產(chǎn)氫菌產(chǎn)氫得率的機(jī)理和方法。6、考察菌株代謝流量及代謝網(wǎng) 絡(luò)動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，剖析選育過(guò)程中目的 產(chǎn)物發(fā)酵關(guān)鍵代謝網(wǎng)絡(luò)的變化與調(diào)控規(guī)律， 選育獲得生產(chǎn)性狀優(yōu)良的菌株；解決氧化還原不平衡問(wèn)題，優(yōu)化代謝途徑。7、開(kāi)展非均相酶解與發(fā)酵過(guò)程的 優(yōu)化控制，木質(zhì)纖維素降解轉(zhuǎn)化過(guò) 程放大的工程學(xué)基礎(chǔ)研究，預(yù)處理體系與生物 煉制聯(lián)產(chǎn)系統(tǒng)的綜合評(píng)價(jià)，預(yù)處理、同步糖化與發(fā)酵和產(chǎn)物分離過(guò)程的節(jié)能和酶再生利用，物料的全轉(zhuǎn)化與高值產(chǎn)品的多 樣化1、定義出木質(zhì)纖維素初級(jí)結(jié)構(gòu)，闡明不同纖維素晶態(tài)的能量分布以及該層次的結(jié)構(gòu)特征對(duì)高一級(jí)結(jié)構(gòu)的影響；歸納出預(yù)處理影響原料酶解效率的關(guān)鍵因子。2、從瘤胃、白蟻腸道、熱泉分離難培養(yǎng)纖維素高效降解微生物 2-3 個(gè)，建立 2-3 個(gè)纖維素高效降解微生物的基因組文庫(kù)， 篩選獲得纖維素酶新基因 20-30 個(gè)，鑒定出 1-2 個(gè)相關(guān)功能非酶新降解因子，并闡明其生物學(xué)功能。3、構(gòu)建絲狀真菌中調(diào)控纖維素 酶合成、修飾、分泌過(guò)程的代謝網(wǎng)絡(luò)圖。解析斜臥青霉纖維素酶合成的誘導(dǎo)或阻遏分子機(jī)制。從分子機(jī)理角度提出構(gòu)建絲狀真菌纖維素酶高產(chǎn)菌株的方法。構(gòu)建各種 纖維素酶分子可調(diào)控表達(dá)的突變株， 獲得纖維素和半纖維素水解復(fù)合酶活性進(jìn)一步提高的新重組復(fù)合酶系。4、獲得性能改良的纖維小體亞 基；獲得能夠與 C.thermocellum 共培養(yǎng) 進(jìn)行纖維素乙醇發(fā)酵的優(yōu)化菌株；構(gòu)建人工菌群代謝網(wǎng)絡(luò)模型，闡釋異菌間代 謝流相互作用規(guī)律； 5、解除關(guān)鍵抑制因子對(duì)菌體生 長(zhǎng)與產(chǎn)物代謝合成的抑制，提高菌體的生 產(chǎn)性能；建立基于輔酶調(diào)控的重要平臺(tái)化合物的生物合成策略。6、完成對(duì)溫度、酶用量、底物濃度等參數(shù)的調(diào)控對(duì)過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化控制，并在不同反應(yīng)器規(guī)模下對(duì)優(yōu)化控制策略進(jìn)行測(cè)試；完成復(fù)雜化學(xué)反應(yīng)與酶反應(yīng)體系的反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)動(dòng)力學(xué)模型，實(shí)現(xiàn)過(guò)程的 強(qiáng)化和放大過(guò)程的有效調(diào)控。完成對(duì)基于 Aspen plus 平臺(tái)上的生物煉制全轉(zhuǎn)化 過(guò)程模型化與優(yōu)化；完成新型分離材料和方法研究，開(kāi)發(fā)節(jié)能、連續(xù)式的新型分離技 術(shù)；建立完整的微型全過(guò)程集成平臺(tái)和測(cè)試實(shí)例。發(fā)表 SCI 論文 35-45 篇；申請(qǐng)發(fā)明專利 5-8 項(xiàng) 。研究?jī)?nèi)容 預(yù) 期目標(biāo)第五年1、構(gòu)建纖維素超分子結(jié)構(gòu)與木 質(zhì)纖維素原料生物解聚的定量構(gòu)效關(guān)系，并基于定向進(jìn)化、定點(diǎn)突變等新技術(shù) 提高酶組分的活力；并探討預(yù)處理過(guò)程中發(fā)酵抑制物的生成動(dòng)力學(xué)，建立針對(duì)不同 發(fā)酵菌種和產(chǎn)品的預(yù)處理抑制物去除方法；2、對(duì)不同預(yù)處理方式（包括組 合預(yù)處理方式）進(jìn)行經(jīng)濟(jì)成本分析，及其 綜合評(píng)價(jià)；3、研究分析纖維素酶持續(xù)性催化 結(jié)晶纖維素的動(dòng)態(tài)學(xué)，開(kāi)展纖維素 酶合成生物學(xué)研究，人工組合纖維素酶系的研究，對(duì)已篩選到新纖維素酶進(jìn)行多樣性和催化特性深入分析；探索研究哈氏嗜纖維菌參與木霉纖維素酶對(duì)結(jié)晶纖維素降解的協(xié)同作用。4、構(gòu)建絲狀真菌可生產(chǎn)新型復(fù)合 酶系的纖維素酶高產(chǎn)基因工程菌，并 優(yōu)化它們的纖維素酶生產(chǎn)工藝。構(gòu)建評(píng) 價(jià)新復(fù)合酶系對(duì)不同天然底物的水解效率。5、挖掘新的纖維素降解輔助因子，分析其在降解纖維素過(guò)程中的作用及對(duì)不同底物降解促進(jìn)機(jī)制；針對(duì)不同底物優(yōu)化最小人工纖維小體，并進(jìn)行大 規(guī)模制備。6、進(jìn)行 CBP 發(fā)酵產(chǎn)乙醇的工藝優(yōu)化；設(shè)計(jì)玉米秸稈同步糖化發(fā)酵制氫反應(yīng)器，進(jìn)行高效人工菌群的反應(yīng)器運(yùn)行實(shí)驗(yàn)，對(duì)反應(yīng)器參數(shù)調(diào)控及反應(yīng)器系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化；7、在已獲得優(yōu)良生產(chǎn)菌株的基 礎(chǔ)上，以纖維水解全糖組分為原料， 綜合利用氧化還原電位調(diào)節(jié)等發(fā)酵調(diào)控手段， 進(jìn)一步提高目的產(chǎn)物的收率和生產(chǎn)強(qiáng)度；在此基礎(chǔ)上，建立能直接利用纖維素水解液中全部糖類來(lái)發(fā)酵生產(chǎn)目的產(chǎn)品（乙醇、丁醇、丁二酸、PHA 、乳酸等）的生 產(chǎn) 體系。7、完成預(yù)處理體系與生物煉制 聯(lián)產(chǎn)系統(tǒng)的綜合評(píng)價(jià)，預(yù)處理、同步糖化與發(fā)酵和產(chǎn)物分離過(guò)程的節(jié)能和酶再生利用，物料的全轉(zhuǎn)化與高值產(chǎn)品的多樣化。1、建立不同預(yù)處理方式下的抑制物生成動(dòng)力學(xué)；提出 2-3 種新的高效、低能耗、少抑制物的預(yù)處理方案；2、建立含 80-100 個(gè)不同來(lái)源、不同催化特性的纖維素酶酶庫(kù)，獲得 3 株新的降解效率高的纖維素酶產(chǎn)生菌株， 獲得降解效率高的人工組合纖維素酶系；3、構(gòu)建出高產(chǎn)高效纖維素降解 酶系的基因工程菌 2-3 株，使酶解轉(zhuǎn)化率大于90%。噸乙醇用酶成本從 2000 元以上降到 800 元以下。4、闡明復(fù)雜纖維素降解體系中不同 組分的協(xié)同作用機(jī)制；獲得 2 到 3 種針對(duì)不同底物優(yōu)化的最小人工纖維小體，并 實(shí)現(xiàn)制備放大，使纖維素酶解轉(zhuǎn)化率大于90%；獲 得 C.thermocellum 的 CBP 纖維素乙醇發(fā)酵的最優(yōu)條件，噸乙醇 酶解成本降低 50。5、構(gòu)建出同步糖化發(fā)酵制氫反 應(yīng)器系統(tǒng)， 實(shí)現(xiàn)其快速啟動(dòng)及穩(wěn)定運(yùn)行 ,最終氫得率 2mol 氫氣/mol 已糖以上；6、獲得能直接利用纖維素水解液中全部糖類來(lái)發(fā)酵生產(chǎn)液體燃料和大宗化學(xué)品（乙醇、琥珀酸、乳酸、聚羥基丁酸等）的抗逆代謝工程菌株 3-5 株，并建立高效的生產(chǎn)體系，為生物煉制技 術(shù)產(chǎn)業(yè)化奠定基礎(chǔ)。7、建立木質(zhì)纖維素降解過(guò)程全流程生物煉制微型工廠(Mini-Plant) 評(píng) 價(jià)系統(tǒng)，對(duì)成本、能耗、廢棄物排放的潛在 污染影響等進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。8、完成新型酶或細(xì)胞載體研究，開(kāi)發(fā)基于統(tǒng)合生物工藝(CBP)的纖維素酶再生技術(shù)，實(shí)現(xiàn)纖維素酶的再生利用。實(shí)現(xiàn)纖維質(zhì)原料的全轉(zhuǎn)化和多種高值化學(xué)品的生物煉制新工藝。發(fā)表 SCI 論文 35-45 篇；申請(qǐng)發(fā)明專利 5-8 項(xiàng) 。一、研究?jī)?nèi)容圍繞三個(gè)關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題開(kāi)展研究工作（1）纖維素類生物質(zhì)是如何抗生物降解的：抗生物降解的多層次屏障包括纖維素的結(jié)晶結(jié)構(gòu)、纖維素與半纖維素和木素組合形成的異質(zhì)高聚物、復(fù)雜的細(xì)胞壁多層結(jié)構(gòu)等。從生物降解轉(zhuǎn)化的角度，來(lái)深入研究這一系列抗降解屏障的特性，尋求破解之道，是實(shí)現(xiàn)生物質(zhì)高效轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)。（2）微生物是如何攻擊植物的抗降解屏障的：在長(zhǎng)期自然進(jìn)化中，微生物形成了攻擊植物生物質(zhì)抗降解屏障的多酶組分系統(tǒng)代謝策略。深入研究微生物降解木質(zhì)纖維素的機(jī)理、多樣性以及酶系合成調(diào)控，特別是其攻擊纖維素結(jié)晶結(jié)構(gòu)的途徑，解析降解所需復(fù)雜酶系的組成和合成調(diào)控，是提高生物催化劑效率的前提。（3）破解抗性屏障和提高轉(zhuǎn)化效率的可能途徑；分子和系統(tǒng)生物學(xué)研究的快速發(fā)展為生物系統(tǒng)的定向設(shè)計(jì)與改造提供了可能。通過(guò)設(shè)計(jì)和改造微生物及其降解和轉(zhuǎn)化酶系，開(kāi)展過(guò)程導(dǎo)向的酶分子優(yōu)化改造，結(jié)合相關(guān)化工技術(shù)的研究，探討利用生物技術(shù)和物理、化學(xué)手段破解抗降解屏障的新途徑，有望集成和設(shè)計(jì)出新的環(huán)境友好、效益可行的生物煉制方案。