項(xiàng)目名稱： 基于誘導(dǎo)多能干細(xì)胞技術(shù)的若干重大疾病模型與機(jī)理研究首席科學(xué)家： 金穎 上海交通大學(xué)起止年限： 2010 年 1 月-2014 年 8 月依托部門： 上海市科委一、研究內(nèi)容我們擬在本項(xiàng)目中開展一下研究內(nèi)容：1. 優(yōu)化和完善建立人 iPS 細(xì)胞的技術(shù)體系：本研究擬對(duì)現(xiàn)有的 iPS 細(xì)胞誘導(dǎo)技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，構(gòu)建新的非整合性細(xì)胞重編程因子表達(dá)載體，同時(shí)構(gòu)建將細(xì)胞重編程因子輸入體細(xì)胞的蛋白質(zhì)直接運(yùn)輸系統(tǒng)及采用化合物及小分子進(jìn)行輸送的非病毒系統(tǒng)，篩選能夠替代細(xì)胞重編程因子的小分子，建立并優(yōu)化出高效、安全的 iPS 細(xì)胞誘導(dǎo)技術(shù)。同時(shí)，我 們還將對(duì)用于誘導(dǎo) iPS 細(xì)胞的體細(xì)胞種類進(jìn)行研究，篩選出比成纖維細(xì)胞更有效、更快速地被誘導(dǎo)成為 iPS 細(xì)胞、并且易于收集的體細(xì)胞。此外，我們將對(duì)新方法建立的 iPS 細(xì)胞系進(jìn)行安全性檢驗(yàn)。2. 建立若干種重大疾病特異的 iPS 細(xì)胞系：為了有保證后續(xù)研究疾病發(fā)病機(jī)制和篩選新的疾病治療靶點(diǎn)，我們將首先建立嚴(yán)重危害人民健康的重大疾病的 iPS 細(xì)胞系，重點(diǎn)選擇我們項(xiàng)目組有一定研究基礎(chǔ)的疾病，并優(yōu)先考慮具有遺傳起因的家族病例，包括神經(jīng)系統(tǒng) （阿爾茨海默病、帕金森病和小兒脊髓性肌肉萎縮癥等)重大疾病、若干其它已知單基因或多基因改變的遺傳性疾?。? 地中海 貧血、骨髓衰竭綜合征、Y 染色體微缺失和肥厚性心肌?。┖湍壳吧胁恢阑蚋淖兊闹卮髠魅拘约膊。ò滩。．?dāng)課題 1 建立新的方法后，我們將利用新的技術(shù)建立更多疾病患者特異的 iPS 細(xì)胞系。3. 利用疾病特異的 iPS 細(xì)胞系研究重大疾病的發(fā)生機(jī)制：重點(diǎn)選擇神經(jīng)系統(tǒng)疾病 （阿爾茨海默病、帕金森病和小兒脊髓性肌肉萎縮癥等)和肥厚性心肌病患者特異的 iPS 細(xì)胞系，以正常人 iPS 細(xì)胞為對(duì)照，將疾病特異性 iPS 細(xì)胞向相應(yīng)疾病中的功能細(xì)胞定向誘導(dǎo)，比較正常人和患者來源的細(xì)胞在分化過程中以及在受到環(huán)境危害（如氧化應(yīng)激）或過度刺激（overexcitation）情況下的形態(tài)和功能，建立研究相關(guān)疾病的模型。采用 microarray 或深度測序技術(shù)研究 mRNA 表達(dá)譜，采用 ChIP-chip(seq)和 MeDIP-chip(seq)技術(shù)研究表觀遺傳學(xué)譜，分析正常細(xì)胞和疾病細(xì)胞之間細(xì)胞編程的差異，結(jié)合蛋白組學(xué)和質(zhì)譜分析，有效地將全基因組表達(dá)改變與疾病的表型變化鏈接起來，為揭示疾病的發(fā)生機(jī)制和發(fā)現(xiàn)新的藥物靶點(diǎn)提供依據(jù)。4. 建立基于疾病細(xì)胞模型的藥物評(píng)價(jià)和篩選體系：利用以上研究建立的某些特定疾?。ǚ屎裥孕募〔『团两鹕。┑募?xì)胞模型對(duì)于現(xiàn)有藥物的療效和劑量做出個(gè)體化的評(píng)估并篩選能使細(xì)胞表型逆轉(zhuǎn)的新藥。同時(shí)結(jié)合疾病的發(fā)生機(jī)制研究結(jié)果獲得新的治療靶點(diǎn)，篩選出針對(duì)新靶點(diǎn)的激活劑或抑制劑，實(shí)現(xiàn)對(duì)若干重大疾病的有效控制。二、預(yù)期目標(biāo)（一）總體目標(biāo)：從解決重大疾病治療和改善我國人民健康水平的需求出發(fā)，針對(duì)當(dāng)前國際iPS 細(xì)胞研究的關(guān)鍵問題，優(yōu)化建立人 iPS 細(xì)胞的技 術(shù)體系，實(shí)現(xiàn)安全有效地建立疾病特異的 iPS 細(xì)胞系；在此基礎(chǔ)上建立嚴(yán)重危害人民健康和我們項(xiàng)目組有一定研究基礎(chǔ)的若干重大疾病的 iPS 細(xì)胞系；掌握疾病特異性 iPS 細(xì)胞向相應(yīng)疾病中的功能細(xì)胞定向誘導(dǎo)的技術(shù)方法，以此作為模型研究這些疾病的發(fā)病機(jī)制；利用以上疾病模型，對(duì)現(xiàn)有藥 物做出個(gè)體化的評(píng)估，并發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)和篩選新的藥物， 為這些重大性疾病的基礎(chǔ)和臨床研究開辟新的研究方法和技術(shù)平臺(tái)。通過本項(xiàng)目的實(shí)施使我國在干細(xì)胞研究領(lǐng)域達(dá)到或領(lǐng)先國際水平。同時(shí)，以本項(xiàng)目為紐帶，促 進(jìn)多學(xué)科、多院校的銜接和交流，尤其是基礎(chǔ)研究與臨床實(shí)踐的密切結(jié)合，培養(yǎng)出一批優(yōu)秀的干 細(xì)胞研究人才。（二）五年預(yù)期目標(biāo)1. 優(yōu)化和完善建立人 iPS 細(xì)胞的技術(shù)體系：包括 1）通過非病毒或非基因組整合載體將重編程因子導(dǎo)入體細(xì)胞； 2）發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞產(chǎn)生的小分子化合物或新的細(xì)胞調(diào)控因子；3）篩選出可以被更有效、更快速地誘導(dǎo)成為 iPS 細(xì)胞、并且易于獲得的體細(xì)胞種類， 為建立患者特異的 iPS 細(xì)胞系提供平臺(tái)。2. 建立包括神經(jīng)系統(tǒng)疾病 （阿爾茨海默病、帕金森病和小兒脊髓性肌肉萎縮癥等) 、若干其它已知 單基因或多基因改變的遺傳性疾病（ 地中海貧血、骨髓衰竭綜合征、Y 染色體微缺失和 肥厚性心肌?。┖湍壳吧胁恢阑蚋淖兊闹卮髠魅拘约膊。ò滩。┑燃膊』颊咛禺惖?iPS 細(xì)胞系。3. 誘導(dǎo)正常人和患者特異的 iPS 細(xì)胞向有特定功能的細(xì)胞分化，應(yīng)用分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物物理等多種手段 發(fā)現(xiàn)疾病細(xì)胞表型，建立可供研究的阿爾茨海默病、帕金森病、小兒脊髓性肌肉萎縮癥和肥厚性心肌病的疾病細(xì)胞模型。4. 利用以上研究中建立的疾病模型，重點(diǎn)選擇肥厚性心肌病和帕金森病，篩選能逆轉(zhuǎn)疾病表型的新藥。同時(shí)，基于疾病 發(fā)生機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)的可望獲得重大疾病治療的新靶點(diǎn)，篩選針對(duì)這些新靶點(diǎn)的化合物，為改善疾病的癥狀開辟新的途徑。5. 取得具有國際影響的原創(chuàng)性成果，在國際重要學(xué)術(shù)刊物上發(fā)表高水平論文 30篇以上。其中，在影響因子大于 5 的刊物發(fā)表 15 篇以上。培養(yǎng)一批從事干 細(xì)胞研究的基礎(chǔ)研究與臨床應(yīng)用結(jié)合的優(yōu)秀人才。三、研究方案1. 我們將在現(xiàn)有的建立 iPS 細(xì)胞的手段的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步優(yōu)化和完善該技術(shù)體系。具體包括嘗試 通過非基因組整合病毒載體、非病毒載體、蛋白直接導(dǎo)入、小分子化合物、新的 誘導(dǎo)因子等方法 誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞產(chǎn)生 iPS 細(xì)胞系；同時(shí)，試驗(yàn)其它細(xì)胞類型，尋找比成纖維細(xì)胞更容易收集和更加容易誘導(dǎo)的細(xì)胞類型來建立 iPS 細(xì)胞。通過這一研究實(shí)現(xiàn)更加安全有效地建立 iPS 細(xì)胞系的計(jì)劃。2. 利用已經(jīng)成熟建立 iPS 細(xì)胞系的技術(shù)，即逆轉(zhuǎn)錄或慢病毒載體過表達(dá)四種轉(zhuǎn)錄因子（Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc）， 建立疾病特異的 iPS 細(xì)胞系。我們將優(yōu)先選擇嚴(yán)重影響我國人民健康、有遺傳起因、本 項(xiàng)目組有一定研究基礎(chǔ)的重大疾病建立 iPS 細(xì)胞系。3. 在此基礎(chǔ)上，通過生長因子誘導(dǎo)、與其它 細(xì)胞共培養(yǎng)或形成類胚體的途徑誘導(dǎo)正常人和患者 iPS 細(xì)胞向有特定功能的方向分化。比較正常和疾病 iPS 細(xì)胞在正常或各種刺激條件下生長、分化、凋亡、附著、運(yùn)動(dòng) 及細(xì)胞特有功能的不同，建立研究重大疾病的細(xì)胞模型。4. 利用這些疾病細(xì)胞模型，運(yùn)用各種組學(xué)技術(shù) ，如采用 microarray 或深度測序技術(shù)研究 mRNA 表達(dá)譜，采用 ChIP-chip(seq)和 MeDIP-chip(seq)技術(shù) 研究表觀遺傳 學(xué)譜，分析正常 細(xì)胞和疾病細(xì)胞之間細(xì)胞編程的差異， 結(jié)合蛋白組 學(xué)和質(zhì)譜分析、影像學(xué)和電生理的功能分析，有效地將全基因組表達(dá)改 變與疾病的表型變化鏈接起來。另外，根據(jù)每一種重大疾病中涉及到的基因產(chǎn)物不同，通過不同的生物化學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和物理學(xué)等手段進(jìn)一步研究疾病發(fā)生分子機(jī)制。5. 以上分子機(jī)制的研究有可能發(fā)現(xiàn)對(duì)疾病治療的新的靶點(diǎn)，針對(duì)這些靶點(diǎn)可以設(shè)計(jì)新的藥物。另外，利用建立的疾病細(xì)胞模型可以直接檢驗(yàn)新藥， 篩選對(duì)特異靶點(diǎn)或 細(xì)胞表型有影響的藥物或手段，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)重大疾病的有效控制甚至個(gè)體化治療。四、年度計(jì)劃年度 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo)第一年1. 構(gòu)建表達(dá) 4 種重編程因子（Oct4、Sox2、Klf4 和 c-Myc）的非基因組整合載體，及重編程因子在體細(xì)胞的表達(dá)。參考Yamanaka 最近發(fā)表的小鼠 iPS細(xì)胞誘導(dǎo)方法，建立質(zhì)粒介導(dǎo)的人 iPS 細(xì)胞誘導(dǎo)技術(shù)；2. 體外表達(dá)可穿透細(xì)胞膜的重編程因子重組蛋白載體的構(gòu)建和融合蛋白的表達(dá)和純化;3. 經(jīng)患者所在醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)通過和患者知情同意之后，收集建立疾病患者特異的 iPS 細(xì)胞系的實(shí)驗(yàn)材料；4. 建立患者樣本來源的體細(xì)胞系；5. 建立正常人 iPS 細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為膽堿能神經(jīng)元, 多巴胺神經(jīng)元，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和心肌細(xì)胞的技術(shù)平臺(tái)。1. 完成編碼 4 種重編程因子的非基因組整合載體構(gòu)建和在體細(xì)胞的表達(dá)；2. 完成 4 種重編程因子在體外的表達(dá)和純化；3. 建立獲取患者樣本的合符倫理的途徑；4. 建立患者體細(xì)胞細(xì)胞系；5. 實(shí)現(xiàn)將 iPS 細(xì)胞穩(wěn)定的分化為膽堿能神經(jīng)元，多巴胺神經(jīng)元，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和心肌細(xì)胞的技術(shù)平臺(tái)。年度 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo)第二年1. 應(yīng)用現(xiàn)有的方法建立神經(jīng)系統(tǒng)重大疾病和肥厚性心肌病患者特異的 iPS 細(xì)胞系；2. 比較不同來源體細(xì)胞重編程的效率；3. 應(yīng)用第一年構(gòu)建的載體誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程，建立 iPS 細(xì)胞系；4. 探索體外表達(dá)的融合蛋白進(jìn)入細(xì)胞的最佳條件；5. 對(duì)建立的 iPS 細(xì)胞系進(jìn)行常規(guī)鑒定；6. 明確病人特異的 iPS 細(xì)胞向功能特異的神經(jīng)元分化能力與正常人 iPS 細(xì)胞的異同，并檢測體外培養(yǎng)細(xì)胞的存活能力及生理功能；1. 獲得部分疾病患者特異的 iPS 細(xì)胞系；2. 發(fā)現(xiàn)重編程效率高的體細(xì)胞；3. 建立非基因組整合的 iPS 細(xì)胞系；4. 建立體外表達(dá)的融合蛋白進(jìn)入細(xì)胞的最佳條件；5. 為課題 3 提供 iPS 細(xì)胞系；6. 建立 iPS 細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為膽堿能神經(jīng)元, 多巴胺神經(jīng)元，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的技術(shù)平臺(tái)，建立AD，PD，SMA 的發(fā)病模型；第三年1. 研究 iPS 細(xì)胞的小分子誘導(dǎo)技術(shù)。首先，篩選能夠誘導(dǎo)Oct4、Sox2、Klf4 和 c-Myc 等 4個(gè)內(nèi)源基因表達(dá)的小分子，然后用這些小分子分別替代 4 種因子誘導(dǎo)產(chǎn)生 iPS 細(xì)胞。2. 研究應(yīng)用體外表達(dá)和純化的融合蛋白誘導(dǎo) iPS 細(xì)胞；1. 發(fā)現(xiàn)新的能分別誘導(dǎo) 4 種重編程因子的小分子，檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的小分子在誘導(dǎo) iPS 細(xì)胞中的作用；2. 鑒定體外表達(dá)的重編程因子在在誘導(dǎo) iPS 細(xì)胞中的作用；3. 獲得 -地中海貧血、骨髓衰竭綜合征、Y 染色體微缺失等 遺傳 性年度 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo)3. 將已知單基因或多基因改變的遺傳性疾?。?-地中海貧血、骨髓衰竭綜合征和 Y 染色體微缺失）及艾滋病的體細(xì)胞誘導(dǎo)為 iPS 細(xì)胞；4. 比較正常 iPS 細(xì)胞和肥厚性心肌病患者 iPS 細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的差異；5. 了解不同遺傳背景的肥厚性心肌病 iPs 來源心肌細(xì)胞功能和 電生理學(xué)相關(guān)離子通道障礙的致病位點(diǎn)，選擇相應(yīng)臨床藥物進(jìn)行疾病控制，并確認(rèn)此種細(xì)胞模型獲得的藥物線索和臨床實(shí)踐的相關(guān)性。疾病及艾滋病患者特異的 iPS 細(xì)胞；4. 利用肥厚性心肌病患者來源 iPs細(xì)胞獲得心肌細(xì)胞實(shí)施臨床藥物篩選的研究；5. 利用 iPS 模型探索帕金森病的發(fā)病機(jī)制，借助組學(xué)技術(shù)篩選關(guān)鍵差異蛋白或信號(hào)通路變化。第四年1. 篩選對(duì) iPS 細(xì)胞的誘導(dǎo)有加速/增強(qiáng)作用的小分子加速劑/增強(qiáng)劑；2. 繼續(xù)優(yōu)化誘導(dǎo) iPS 細(xì)胞技術(shù)，包括非基因組整合載體和體外表達(dá)蛋白技術(shù)；1. 發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用對(duì) PS 細(xì)胞的 誘導(dǎo)有加速/增強(qiáng)作用的小分子加速劑/增強(qiáng)劑；2. 實(shí)現(xiàn)高效安全地建立人的 iPS 細(xì)胞系；3. 鑒定區(qū)分正常人和患者的關(guān)鍵性表觀遺傳標(biāo)志；年度 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo)3. 采用采用單細(xì)胞表達(dá)譜及 ChIP-chip(seq)和 MeDIP-chip(seq)技術(shù)研究正常人和患者的 iPS 細(xì)胞遺傳和表觀遺傳學(xué)譜；4. 在疾病特異 iPS 細(xì)胞分化過程中，收集不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞，分別進(jìn)行 mRNA 表達(dá)譜和 microRNA表達(dá)譜研究；5. 發(fā)現(xiàn)并鑒定 1-2 種在疾病發(fā)生過程中變化非常明顯且與 AD 發(fā)病密切相關(guān)的關(guān)鍵基因和microRNA，同 時(shí)嘗試找到相應(yīng)microRNA 的靶基因；4. 發(fā)現(xiàn)并鑒定在疾病患者 iPS 細(xì)胞分化過程中的 1-2 個(gè)關(guān)鍵基因和microRNA，并 對(duì)其功能做初步研究；5. 發(fā)表 3-5 篇 SCI 收錄的高水平論文；第五年1. 對(duì)新方法建立的 iPS 細(xì)胞系的安全性進(jìn)行研究和鑒定；2. 應(yīng)用課題 1 中建立的新的優(yōu)化方法建立重大疾病患者特異的 iPS細(xì)胞系；3. 利用 iPS 模型探索帕金森病合肥厚性心肌病的發(fā)病機(jī)制，借助組學(xué)技術(shù)篩選關(guān)鍵差異蛋白或信號(hào)通路變化；1. 為建立疾病患者特異的 iPS 細(xì)胞提供最佳的方案；2. 明確新方法建立的 iPS 細(xì)胞的安全性；3. 發(fā)現(xiàn)疾病治療的新靶點(diǎn)；4. 確認(rèn)快速藥物篩選和臨床指導(dǎo)的新治療策略；5. 在國家高水平的學(xué)術(shù)雜志上發(fā)表高質(zhì)量的學(xué)術(shù)論文，申請(qǐng)專利。年度 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo)4. 利用建立的模型進(jìn)行藥物評(píng)價(jià)和篩選；5. 論文的撰寫和發(fā)表。