2020版版中國藥中國藥典典四四部部液相液相色色譜譜法法 修訂內容匯總修訂內容匯總中國藥典2020年版四部通則發(fā)布了高效液相色譜的的增修內容，具體情況如下：高效液相色譜法系采用高壓輸液泵將規(guī)定的流動相泵入裝有填充劑的色譜柱，對 供試品進行分離測定的色譜方法。注入的供試品，由流動相帶入色譜柱內，各組 分在柱內被分離，并進入檢測器檢測，由積分儀或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄和處理色譜 信號。對儀器的一般要求和色譜條件對儀器的一般要求和色譜條件高效液相色譜儀由高壓輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器、積分儀或數(shù)據(jù)處理系 統(tǒng)組成。色譜柱內徑一般為 3.94.6mm，填充劑粒徑為 310m。超高效液 相色譜儀是適應小粒徑（約 2m）填充劑的耐超高壓、小進樣量、低死體積、 高靈敏度檢測的高效液相色譜儀。1、色譜柱反相色譜柱、色譜柱反相色譜柱以鍵合非極性基團的載體為填充劑填充而成的色譜柱。常見的載體有硅膠、聚合物復合硅膠和聚合物等；常 用的填充劑有十八烷基硅烷鍵合硅膠、辛基硅烷鍵合硅膠和苯基硅烷鍵合硅膠等。正相色譜柱：用硅膠填充劑，或鍵合極性基團的硅膠填充而成的色譜柱。常見的填充劑有硅膠、氨基鍵合硅膠和氰基鍵合硅膠等。氨基鍵合硅膠和氰基鍵合硅膠也可用作反相色譜。離子交換色譜柱：用離子交換填充劑填充而成的色譜柱。有陽離子交換色譜柱和陰離子交換色譜柱。手性分離色譜柱：用手性填充劑填充而成的色譜柱。色譜柱的內徑與長度，填充劑的形狀、粒徑與粒徑分布、孔徑、表面積、鍵合基團的表面覆蓋度、載體表面 基團殘留量，填充的致密與均勻程度等均影響色譜柱的性能，應根據(jù)被分離物質的性質來選擇合適的色譜柱。 溫度會影響分離效果，品種正文中未指明色譜柱溫度時系指室溫，應注意室溫變化的影響。為改善分離效果 可適當提高色譜柱的溫度，但不宜超過 60。殘余硅羥基未封閉的硅膠色譜柱，流動相 pH 值一般應在 2 8 之間。烷基硅烷帶有立體側鏈保護、或殘余硅羥基已封閉的硅膠、聚合物復合硅膠或聚合物色譜柱可耐受 更廣泛 pH 值的流動相，適合于 pH 值小于 2 或大于 8 的流動相。2、檢測器、檢測器最常用的檢測器為紫外-可見分光檢測器，包括二極管陣列檢測器，其他常見的檢測器有熒光檢測器、蒸發(fā)光散射檢測器、電噴霧檢測器、示差折光檢測器、電化學檢測器和質譜檢測器等。紫外-可見分光檢測器、熒光檢測器、電化學檢測器為選擇性檢測器，其響應值不僅與被測物質的量有關，還 與其結構有關；蒸發(fā)光散射檢測器、電噴霧檢測器和示差折光檢測器為通用檢測器，對所有物質均有響應， 結構相似的物質在蒸發(fā)光散射檢測器的響應值幾乎僅與被測物質的量有關。紫外-可見分光檢測器、熒光檢測器、電化學檢測器和示差折光檢測器的響應值與被測物質的量在一定范圍內 呈線性關系;，但蒸發(fā)光散射檢測器的響應值與被測物質的量通常呈指數(shù)關系，一般需經對數(shù)轉換。; 電噴霧 檢測器的響應值與被測物質的量通常也呈指數(shù)關系，一般需經對數(shù)轉換或用二次函數(shù)計算，但在小質量范圍 內可基本呈線性。不同的檢測器，對流動相的要求不同。紫外-可見分光檢測器所用流動相應符合紫外-可見分光光度法（通則 0401）項下對溶劑的要求；采用低波長檢測時，還應考慮有機溶劑的截止使用波長，并選用色譜級有機溶劑。 蒸發(fā)光散射檢測器、電噴霧檢測器和質譜檢測器不得使用含不揮發(fā)性鹽成分的流動相。3、流動相、流動相反相色譜系統(tǒng)的流動相常用甲醇-水系統(tǒng)和乙腈-水系統(tǒng)，用紫外末端波長檢測時，宜選用乙腈-水系統(tǒng)。流動 相中應盡可能不用緩沖鹽，如需用時，應盡可能使用低濃度緩沖鹽。用十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱時，流 動相中有機溶劑一般應不低于 5，否則易導致柱效下降、色譜系統(tǒng)不穩(wěn)定。正相色譜系統(tǒng)的流動相常用兩 種或兩種以上的有機溶劑，如二氯甲烷和正己烷等。流動相注入液相色譜儀的方式（又稱洗脫方式）可分為兩種：一種是等度洗脫，另一種是梯度洗脫；用梯度 洗脫分離時，通常以表格的形式在品種項下規(guī)定，其中包括運行時間和流動相在不同時間的成分比例。品種 正文項下規(guī)定的條件，除填充劑種類、流動相組分、檢測器類型不得改變外，其余如色譜柱內徑與長度、填 充劑粒徑、流動相流速、流動相組分比例、柱溫、進樣量、檢測器靈敏度等，均可適當調整。若需使用小粒徑（約 2m）填充劑以提高分離度或縮短分析時間，輸液泵的性能、進樣體積、檢測池體積和 系統(tǒng)的死體積等必須與之匹配，如有必要時，色譜條件（參數(shù)）可適當調整。調整后，系統(tǒng)適用性應符合要 求，且色譜峰出峰順序不變。若減小進樣體積，應保證檢測限和峰面積的重復性；若增加進樣體積，應使分 離度和線性關系仍滿足要求。對于梯度洗脫，調整其色譜參數(shù)應比調整等度洗脫色譜參數(shù)時更加謹慎，因為 此調整可能會使某些峰位置變化，造成峰識別錯誤，或者與其他峰合并?？赏ㄟ^相關軟件計算表 1 中流速、進樣體積和 梯度洗脫程序的調整范圍，并根據(jù)色譜峰分離 情況進行微調。若調整超出表 1 中規(guī)定的范圍，調整的方法應 進行相應的方法學驗證。無論調整后的方法驗 證與否，當對其測定結果產生異議時，應以品 種項下規(guī)定的色譜條件的測定結果為準。在品 種項下一般不宜指定或推薦色譜柱的品牌，但 可規(guī)定色譜柱的填料（固定相）種類（如鍵合 相，是否改性、封端等）、粒徑、孔徑，色譜 柱的柱長或柱內徑；當耐用性試驗證明必須使 用特定牌號的色譜柱方能滿足分離要求時，可 在該品種正文項下注明。檢測器新增了電霧檢測器檢測器新增了電霧檢測器電霧式檢測器電霧式檢測器（CAD）是一種新型通用型液相色譜檢測器，與ELSD相比，CAD具有更高的檢測 靈敏度、更好的日內和日間重復性和更寬的線性范圍。很多ELSD無法檢測到的雜質，在CAD上具 有較好的響應。與ELSD相比，難揮發(fā)性化合物的CAD響應與分析物的理化性質無關，在進入 CAD的流動相組成不變的情況下，進樣量相同的不同化合物具有相同的CAD響應。換言之，CAD 可用已知化合物的線性曲線定量未知化合物。此外，CAD做化合物純度分析所得數(shù)據(jù)更接近樣品 的真實組成。與UV相比，CAD的響應不受化合物紫外吸收基團的影響，半揮發(fā)和難揮發(fā)的化合物都能在CAD上具有較好的響應，可以檢測UV無法檢測到的弱紫外吸收化合物。色譜參數(shù)的調整色譜參數(shù)的調整應評價色譜參數(shù)調整對分離和檢測的可能影響，必要時，調整的方法應進行相應的方法學驗證。調整后，系統(tǒng)適用性應符合要求，且色譜峰出峰順序不變。若減小進樣體積，應保證檢測限和峰面積的重復性；若增加進樣體積，應使分離度和線性關系仍滿足要求。調整梯度洗脫色譜參數(shù)時應比調整等度洗脫色譜參數(shù)時更加謹慎，因為此調整可能會使某些峰位置變化，造成峰識別錯誤，或者與其他峰合并。新增了測定法項下定性分析項新增了測定法項下定性分析項明確規(guī)定了常用的定性方法主要有但不限于以下幾種：明確規(guī)定了常用的定性方法主要有但不限于以下幾種：1、利用保留時間定性、利用保留時間定性保留時間保留時間（retention time）tR被定義為被分離組分從進樣到柱后出現(xiàn)該組份大響應值時的 時間，也即從進樣到出現(xiàn)某組分色譜峰的頂點時為止所經歷的時間，常以分（min）為時間 單位，用于反映被分離的組分在性質上的差異。通常以在相同的色譜條件下待測組分的保留 時間與對照品的保留時間是否一致作為待測成分定性的依據(jù)。在相同的色譜條件下，待測成分的保留時間與對照品的保留時間應無顯著性差異；兩個保留 時間不同的色譜峰歸屬于不同化合物，但兩個保留時間一致的色譜峰有時未必可歸屬為同一 化合物，在作未知物鑒別時應特別注意。若改變流動相組成或更換色譜柱的種類，待測成分的保留時間仍與對照品的保留時間一致， 可進一步證實待測成分與對照品為同一化合物。若需以扣除死時間的調整保留時間計算，應 在相應的品種項下予以證明。2、利用光譜相似度定性、利用光譜相似度定性化合物的全波長掃描紫外-可見光區(qū)光譜圖提供一些有價值的定性信息。待測成分的光譜與對照品的光譜的相似度可用于輔助定性分析。二極管陣列檢測器可得到更多的信息，包括色譜信號、時間、波長的三維色譜光譜圖，既可用于輔助定性分析，還可用于峰純度分析。3、利用質譜檢測器定性、利用質譜檢測器定性利用質譜檢測器提供的色譜峰分子質量和結構的信息進行定性分析，可獲得比僅利 用保留時間或增加光譜相似性進行定性分析更多的、更可靠信息，不僅可用于已知 物的定性分析，還可提供未知化合物的結構信息。溫馨提示：本PPT課件下載后，即可編輯修改，也可直接使用。（希望本課件對您有所幫助）