課題課題2 2 多聚酶鏈式反應擴增多聚酶鏈式反應擴增DNADNA片段片段 多聚酶鏈式反應多聚酶鏈式反應( (PCRPCR技術技術) )， 是一種在體外快速擴增特定基因或是一種在體外快速擴增特定基因或DNADNA序序列的方法，故又稱為列的方法，故又稱為DNADNA體外擴增技術體外擴增技術。 課題背景課題背景 PCRPCR技術能迅速擴增技術能迅速擴增DNADNA片段，原因是：片段，原因是： DNADNA分子具有分子具有結構。結構。 DNADNA復制時遵循復制時遵循原則。原則。 規(guī)則的雙螺旋規(guī)則的雙螺旋 堿基互補配對堿基互補配對 3 基礎知識基礎知識 1 1、DNADNA的基本單位：的基本單位： 脫氧核苷酸脫氧核苷酸 堿基堿基 脫氧 核糖 P 一、一、DNADNA的結構的結構 ATGC 2、化學結構：、化學結構： P P P P P P P P DNADNA分子是由兩條反向平行的脫氧核苷酸長鏈分子是由兩條反向平行的脫氧核苷酸長鏈（即一條鏈為（即一條鏈為3535，另一條鏈為，另一條鏈為5353）盤）盤旋而成的規(guī)則雙螺旋結構。旋而成的規(guī)則雙螺旋結構。 5 5 3 3 1 2 5 4 3 磷酸基團（在磷酸基團（在 5 的位置上）的位置上） 2 2、細胞內、細胞內DNADNA復制所需條件復制所需條件： 模板：模板： 原料：原料： 酶：酶： 能量：能量： 引物：引物： DNADNA的兩條鏈的兩條鏈 四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸 解旋酶、解旋酶、DNADNA聚合酶聚合酶 DNADNA ATPATP 二、二、DNA復制：復制： 1、復制方式：、復制方式： 3 3、細胞內、細胞內DNADNA復制特點復制特點： 邊解旋變復制邊解旋變復制 半保留復制半保留復制 DNA復制的方向復制的方向 引物引物 DNA母鏈母鏈 DNADNA的復制方向的復制方向總是從總是從子鏈的子鏈的5 5端向端向3 3端端延伸延伸 引物從模板鏈引物從模板鏈3 3端結合端結合 DNA起始端起始端 3 5 DNA聚合酶能不能從頭開始DNA復制？ DNADNA聚合酶聚合酶只能從引物只能從引物3 3 端延伸端延伸DNADNA鏈（合成鏈（合成子鏈）。因為子鏈）。因為DNADNA聚合酶聚合酶只能將新的核苷酸加只能將新的核苷酸加到已有的到已有的DNADNA雙鏈上，雙鏈上，所以所以DNADNA復制需要引物。復制需要引物。 3 5 從中選出適合的引物進行從中選出適合的引物進行PCR:PCR: (1)CCTAGA (1)CCTAGA (2)GTTCGC(2)GTTCGC (3)AAAGT (3)AAAGT (4)TTTCA(4)TTTCA 3 5 5 3 結論：結論：1 1、引物結合在母鏈的、引物結合在母鏈的33端。端。 2 2、復制不是從頭開始。、復制不是從頭開始。 3 3、DNADNA聚合酶從引物聚合酶從引物33端開始結合上去端開始結合上去 4 4、子鏈、子鏈DNADNA延伸的方向從延伸的方向從55到到33 1 1、 PCRPCR（多聚酶鏈式反應）技術：（多聚酶鏈式反應）技術：體外模擬體外模擬DNADNA復制復制的技術。的技術。 2 2、原理：、原理： 二、二、PCRPCR原理原理 利用了利用了DNADNA的熱變性的熱變性原理，通過控制溫度原理，通過控制溫度來控制雙鏈的解聚與結合。來控制雙鏈的解聚與結合。 DNADNA雙鏈雙鏈 單鏈單鏈 變性（加熱變性（加熱8080- -100100 ） 復性（復性（緩慢緩慢冷卻）冷卻） 重復重復3030次次 1 1 步驟：變性步驟：變性 復性復性 延伸延伸 三三 PCRPCR的反應過程的反應過程 90 90 以上以上 50 50 左右左右 72 72 左右左右 2 2 體外體外PCRPCR擴增擴增DNADNA的條件：的條件： 模板：模板： 原料：原料： 酶：酶： 2 2種引物：種引物： DNADNA的兩條鏈的兩條鏈 四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸 TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶 引物引物、引物、引物 在一定的緩沖液中進行在一定的緩沖液中進行 嚴格控制溫度嚴格控制溫度 模板DNA 3 3 5 5 三三 PCRPCR的反應過程的反應過程 5 50 引物引物1 1 引物引物2 2 5 5 3 3 5 3 3 95 三三 PCRPCR的反應過程的反應過程 5 引物引物1 1 引物引物2 2 5 5 3 3 5 3 3 72 Taq酶 Taq酶 子鏈子鏈 子鏈子鏈 第第1 1輪結束輪結束 第第2 2輪開始輪開始 三三 PCRPCR的反應過程的反應過程 PCR技術的操作過程 1 1、上一次循環(huán)的產物作為下一次循環(huán)模板上一次循環(huán)的產物作為下一次循環(huán)模板 2 2、DNADNA聚合酶只能特異性地復制聚合酶只能特異性地復制處于兩個引處于兩個引物之間的物之間的DNADNA序列，序列，使這段固定長度的序列使這段固定長度的序列呈呈指數擴增指數擴增。 PCRPCR的反應過程總結：的反應過程總結： （2 2n n） 細胞內細胞內DNA復制與體外復制與體外PCR的技術區(qū)別：的技術區(qū)別： 四四 PCRPCR反應的實驗操作及操作提示反應的實驗操作及操作提示 1 1、PCRPCR儀儀 2 2、微量離心管、微量離心管 一種一種薄壁塑料管薄壁塑料管，總容，總容積為積為0.5ml0.5ml 3 3、微量移液器、微量移液器 用于用于定量轉移定量轉移PCRPCR配方中的配方中的液體液體，其上其上的一次性吸液槍頭的一次性吸液槍頭用一次更換一次用一次更換一次 實質上一臺能夠實質上一臺能夠自動調控溫度自動調控溫度的儀器的儀器 14 PCR反應反應（無（無PCR儀時）儀時） 1 1、理論上、理論上DNADNA擴增數目的計算擴增數目的計算 五五 課題成果評價課題成果評價 一條一條DNADNA，復制，復制n n次，次， DNADNA為為2 2 n n 2 2、課題延伸：實驗中、課題延伸：實驗中DNADNA含量的測定含量的測定 可以通過測量可以通過測量DNADNA含量來評價擴增的效果，含量來評價擴增的效果，DNADNA在在260nm260nm的紫外線波段有一強烈的吸收峰，峰值的大的紫外線波段有一強烈的吸收峰，峰值的大小與小與DNADNA的含量有關的含量有關 光吸收光吸收 波長波長nmnm 260260 240240 220220 280280 0.10.1 0.20.2 第一輪第一輪 第二輪第二輪 第三輪第三輪