課題課題2 2多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNADNA片斷片斷一、基礎(chǔ)知識(shí)一、基礎(chǔ)知識(shí)（一）（一）DNADNA分子的結(jié)構(gòu)分子的結(jié)構(gòu)C C、H H、O O、N N、P P1 1、組成元素、組成元素脫氧核苷酸脫氧核苷酸2 2、基本單位、基本單位3 3、脫氧核苷酸結(jié)構(gòu)、脫氧核苷酸結(jié)構(gòu)脫氧核脫氧核苷酸苷酸脫氧核苷脫氧核苷磷酸磷酸脫氧核糖脫氧核糖含氮含氮堿基堿基嘌呤嘌呤嘧啶嘧啶腺嘌呤（腺嘌呤（A A）鳥嘌呤（鳥嘌呤（G G）胞嘧啶（胞嘧啶（C C）胸腺嘧啶（胸腺嘧啶（T T） 一個(gè)核苷酸上的一個(gè)核苷酸上的磷酸基團(tuán)上的磷酸基團(tuán)上的“OH”O(jiān)H”和和另一個(gè)另一個(gè)核苷酸分子的第三位碳原子上的羥基核苷酸分子的第三位碳原子上的羥基之間失去一分子之間失去一分子水，形成水，形成磷酸二脂鍵，磷酸二脂鍵，即在即在相鄰的相鄰的兩個(gè)脫氧核苷酸的兩個(gè)脫氧核苷酸的33和和55碳原子碳原子之間形成磷酸二脂鍵。數(shù)量龐大的四種脫之間形成磷酸二脂鍵。數(shù)量龐大的四種脫氧核苷酸通過氧核苷酸通過33、55、磷酸二脂鍵彼此連接起來形、磷酸二脂鍵彼此連接起來形成脫氧核苷酸鏈。成脫氧核苷酸鏈。通常將通常將DNADNA的羥基的羥基“OH”O(jiān)H”末端稱為末端稱為33端，而磷酸基團(tuán)的末端稱為端，而磷酸基團(tuán)的末端稱為55端端4 4、多脫氧核苷酸鏈得形成、多脫氧核苷酸鏈得形成脫氧核苷酸結(jié)構(gòu)式脫氧核苷酸結(jié)構(gòu)式OOPOHO堿基堿基OOHOOPOHOOH堿基堿基533553多脫氧核苷酸鏈結(jié)構(gòu)簡圖多脫氧核苷酸鏈結(jié)構(gòu)簡圖5 5、DNADNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)分子的雙螺旋結(jié)構(gòu) DNA DNA分子是由兩條反向平行的（即一條鏈為分子是由兩條反向平行的（即一條鏈為3355，另一條鏈為，另一條鏈為5 5 33）脫氧核苷酸長鏈盤）脫氧核苷酸長鏈盤旋而成的規(guī)則雙螺旋結(jié)構(gòu)旋而成的規(guī)則雙螺旋結(jié)構(gòu) 脫氧核糖與磷酸交替連結(jié)，排列在外側(cè)，構(gòu)脫氧核糖與磷酸交替連結(jié)，排列在外側(cè)，構(gòu)成基本骨架；堿基排列在鏈的內(nèi)側(cè)成基本骨架；堿基排列在鏈的內(nèi)側(cè) 兩條鏈上的堿基通過氫鍵連結(jié)起來，形成堿兩條鏈上的堿基通過氫鍵連結(jié)起來，形成堿基對(duì)。堿基對(duì)的組成有特定的規(guī)律：即腺嘌呤一定基對(duì)。堿基對(duì)的組成有特定的規(guī)律：即腺嘌呤一定與胸腺嘧啶配對(duì)，鳥嘌呤一定同胞嘧啶配對(duì)與胸腺嘧啶配對(duì)，鳥嘌呤一定同胞嘧啶配對(duì)6 6、利用堿基互補(bǔ)配對(duì)規(guī)律的計(jì)算、利用堿基互補(bǔ)配對(duì)規(guī)律的計(jì)算 規(guī)律一：規(guī)律一：DNADNA雙鏈中的兩條互補(bǔ)鏈的堿基相等，雙鏈中的兩條互補(bǔ)鏈的堿基相等，任意兩個(gè)互補(bǔ)的堿基之和相等即任意兩個(gè)互補(bǔ)的堿基之和相等即A=TA=T，G=CG=C。任意兩個(gè)。任意兩個(gè)不互補(bǔ)的堿基之和恒等，占?jí)A基總數(shù)的不互補(bǔ)的堿基之和恒等，占?jí)A基總數(shù)的50%50%。即：。即：A+GA+GT+CT+CA+CA+CT+GT+G50%50%，（，（A+GA+G）/(T+C)/(T+C)(A+C)/(G+T)(A+C)/(G+T)(T+C)/(A+G)(T+C)/(A+G)1 1 規(guī)律二：在規(guī)律二：在DNADNA雙鏈中的一條單鏈雙鏈中的一條單鏈(A+G)/(T+C)(A+G)/(T+C)的的值與另一條互補(bǔ)鏈的值與另一條互補(bǔ)鏈的 (A+G) /(T+C)(A+G) /(T+C)的值互為倒數(shù)關(guān)的值互為倒數(shù)關(guān)系系 規(guī)律三：規(guī)律三：DNADNA雙鏈中，一條單鏈的雙鏈中，一條單鏈的(A+T)/(G+C)(A+T)/(G+C)的的值與另一條互補(bǔ)鏈的值與另一條互補(bǔ)鏈的(A+T)/(G+C)(A+T)/(G+C)的值是相等的，也與的值是相等的，也與整個(gè)整個(gè)DNADNA分子中的分子中的(A+T)/(G+C)(A+T)/(G+C)的值相等的值相等（二）（二）DNADNA分子的特性分子的特性1 1、穩(wěn)定性、穩(wěn)定性 在在DNADNA分子雙螺旋結(jié)構(gòu)的內(nèi)側(cè)，分子雙螺旋結(jié)構(gòu)的內(nèi)側(cè)，通過通過氫鍵氫鍵形形成的堿基對(duì)，使兩條脫氧核苷酸長鏈穩(wěn)固的并成的堿基對(duì)，使兩條脫氧核苷酸長鏈穩(wěn)固的并聯(lián)起來聯(lián)起來 例題：甲例題：甲DNADNA分子中，分子中，A A和和T T占占2525，G G和和C C占占75%75%，乙乙DNADNA分子中，分子中，G G和和C C占占2525， A A和和T T 占占75%75%，哪一個(gè)穩(wěn)，哪一個(gè)穩(wěn)定？定？ 答：甲答：甲DNADNA分子比乙分子比乙DNADNA分子穩(wěn)定。因?yàn)榉肿臃€(wěn)定。因?yàn)锳 A與與T T之間之間形成兩個(gè)氫鍵，形成兩個(gè)氫鍵，在在G G和和C C之間形成三個(gè)氫鍵，之間形成三個(gè)氫鍵，三個(gè)氫鍵三個(gè)氫鍵比兩個(gè)氫鍵穩(wěn)定，所以在比兩個(gè)氫鍵穩(wěn)定，所以在DNADNA分子中含有較多的分子中含有較多的G GC C堿基對(duì)比含有較多的堿基對(duì)比含有較多的A AT T堿基穩(wěn)定堿基穩(wěn)定2 2、多樣性、多樣性 構(gòu)成構(gòu)成DNADNA分子的堿基對(duì)的數(shù)量不同，堿基對(duì)的排分子的堿基對(duì)的數(shù)量不同，堿基對(duì)的排列順序千變?nèi)f化列順序千變?nèi)f化 例題：如果有例題：如果有40004000個(gè)堿基對(duì)，堿基對(duì)有多少種排個(gè)堿基對(duì)，堿基對(duì)有多少種排列方式？列方式？答：堿基對(duì)排列方式有答：堿基對(duì)排列方式有4 440004000種種3 3、特異性、特異性 不同的不同的DNADNA分子由于堿基對(duì)的排列順序存在差異，分子由于堿基對(duì)的排列順序存在差異，因此每一個(gè)因此每一個(gè)DNADNA分子的堿基對(duì)都有其特定的排列順序，分子的堿基對(duì)都有其特定的排列順序，這種特定的排列順序包含著特定的遺傳信息，每一種這種特定的排列順序包含著特定的遺傳信息，每一種生物生物(A+T)/(G+C)(A+T)/(G+C)的比值是特定的的比值是特定的（三）（三）DNADNA的復(fù)制的復(fù)制2 2、時(shí)期、時(shí)期有絲分裂間期減數(shù)第一次分裂前的間期有絲分裂間期減數(shù)第一次分裂前的間期3 3、場(chǎng)所、場(chǎng)所細(xì)胞核（主）、線粒體、葉綠體細(xì)胞核（主）、線粒體、葉綠體4 4、模板、模板DNADNA母鏈母鏈1 1、概念、概念由一個(gè)由一個(gè)DNADNA形成兩個(gè)完全相同的形成兩個(gè)完全相同的DNADNA的過程的過程5 5、原材料、原材料脫氧核苷酸脫氧核苷酸6 6、基本條件、基本條件酶、酶、ATPATP、原料、模板、原料、模板7 7、復(fù)制過程、復(fù)制過程 DNA DNA的解旋的解旋 親代親代DNADNA分子利用細(xì)胞提供的能量在解旋酶的分子利用細(xì)胞提供的能量在解旋酶的作用下氫鍵斷裂，部分雙螺旋鏈解旋為兩條平行作用下氫鍵斷裂，部分雙螺旋鏈解旋為兩條平行的雙鏈的雙鏈 RNA RNA引物的合成引物的合成 以單股以單股DNADNA為模板，在引物酶的作用下合成小段為模板，在引物酶的作用下合成小段的的RNARNA引物引物 DNA DNA的生成的生成 以單股的以單股的DNADNA為模板，在為模板，在DNADNA聚合酶的作用下，聚合酶的作用下，在在RNARNA引物的末端由引物的末端由55端端33端合成端合成DNADNA。切掉引物生成岡崎片斷切掉引物生成岡崎片斷 在核酸酶的作用下切掉引物。在在核酸酶的作用下切掉引物。在DNADNA聚合酶的作聚合酶的作用下將引物部位換上用下將引物部位換上DNADNA，此時(shí)的，此時(shí)的DNADNA片斷稱為岡崎片斷稱為岡崎片斷片斷 DNA DNA片斷的連接片斷的連接 在在DNADNA連接酶的作用下將岡崎片斷連接起來。形連接酶的作用下將岡崎片斷連接起來。形成一條完整的新的成一條完整的新的DNADNA鏈。新鏈與舊鏈構(gòu)成新的鏈。新鏈與舊鏈構(gòu)成新的DNADNA邊解旋邊復(fù)制邊解旋邊復(fù)制( (過程）過程）8 8、復(fù)制特點(diǎn)、復(fù)制特點(diǎn)半保留復(fù)制（結(jié)果）半保留復(fù)制（結(jié)果）9 9、遵循原則、遵循原則堿基互補(bǔ)配對(duì)原則堿基互補(bǔ)配對(duì)原則1010、精確復(fù)制的原因、精確復(fù)制的原因1111、復(fù)制的意義、復(fù)制的意義 DNA DNA分子通過復(fù)制使遺傳信息從親代傳給了后分子通過復(fù)制使遺傳信息從親代傳給了后代，從而保持了遺傳信息的連續(xù)性代，從而保持了遺傳信息的連續(xù)性規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)為復(fù)制提供了精確的模板規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)為復(fù)制提供了精確的模板堿基互補(bǔ)配對(duì)能力保證了復(fù)制準(zhǔn)確無誤的進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)能力保證了復(fù)制準(zhǔn)確無誤的進(jìn)行 一條雙鏈一條雙鏈DNADNA分子，復(fù)制分子，復(fù)制N N次，形成的子代次，形成的子代DNADNA分子中，含親代分子中，含親代DNADNA母鏈的有兩個(gè)母鏈的有兩個(gè)DNADNA分子，占子代分子，占子代DNADNA總數(shù)的總數(shù)的2/22/2N N；親代；親代DNADNA分子母鏈兩條，占子代分子母鏈兩條，占子代DNADNA中脫氧核苷酸鏈總數(shù)的中脫氧核苷酸鏈總數(shù)的2/2 2/2 N+1N+1= 1/2= 1/2N N 設(shè)一條設(shè)一條DNADNA分子中有胸腺嘧啶為分子中有胸腺嘧啶為m m個(gè)，則該個(gè)，則該DNADNA復(fù)制復(fù)制n n次后，形成子代次后，形成子代DNADNA分子需游離的胸腺嘧啶為分子需游離的胸腺嘧啶為T=(2T=(2N N-1)m-1)m1212、DNADNA復(fù)制過程中的等量關(guān)系復(fù)制過程中的等量關(guān)系（四）（四） PCR(PCR(多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）1 1、 DNADNA聚合酶聚合酶特性特性 不能從頭合成不能從頭合成DNADNA，只能從，只能從DNADNA的的33端開始延伸端開始延伸DNADNA鏈，因此，鏈，因此， DNADNA復(fù)制需要引物復(fù)制需要引物2 2、 DNADNA聚合酶聚合酶作用過程作用過程 當(dāng)引物與當(dāng)引物與DNADNA母鏈通過堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合后，母鏈通過堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合后， DNADNA聚合酶就能從引物的聚合酶就能從引物的33端開始延伸端開始延伸DNADNA鏈，鏈，DNADNA的合成方向總是從子鏈的的合成方向總是從子鏈的55端向端向33端延伸端延伸3 3、 PCRPCR原理原理 在在8080100100C C的溫度范圍內(nèi)，的溫度范圍內(nèi)， DNADNA的雙螺旋結(jié)的雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體，雙鏈分開，這個(gè)過程稱為變性構(gòu)將解體，雙鏈分開，這個(gè)過程稱為變性 當(dāng)溫度緩慢降低后，兩條彼此分離的當(dāng)溫度緩慢降低后，兩條彼此分離的DNADNA鏈又鏈又會(huì)重新結(jié)合成雙鏈會(huì)重新結(jié)合成雙鏈 PCR PCR利用了利用了DNADNA的熱變性原理，通過控制溫度的熱變性原理，通過控制溫度來控制雙鏈的解聚與結(jié)合，現(xiàn)在使用的來控制雙鏈的解聚與結(jié)合，現(xiàn)在使用的PCRPCR儀實(shí)質(zhì)上儀實(shí)質(zhì)上也是一臺(tái)能夠自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器也是一臺(tái)能夠自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器 高溫解決了打開雙鏈的問題，但是，又導(dǎo)致高溫解決了打開雙鏈的問題，但是，又導(dǎo)致DNADNA聚合酶失活的問題，耐高溫的聚合酶失活的問題，耐高溫的Taq DNATaq DNA聚合酶解聚合酶解決了高溫導(dǎo)致決了高溫導(dǎo)致DNADNA聚合酶失活的問題，促成了聚合酶失活的問題，促成了PCRPCR技技術(shù)的自動(dòng)化術(shù)的自動(dòng)化4 4、 Taq DNATaq DNA聚合酶的應(yīng)用聚合酶的應(yīng)用5 5、 緩沖液需要為緩沖液需要為PCRPCR反應(yīng)提供的物質(zhì)反應(yīng)提供的物質(zhì) DNA DNA模板，分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引模板，分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物，四種脫氧核苷酸，耐熱的物，四種脫氧核苷酸，耐熱的DNADNA聚合酶，同時(shí)通聚合酶，同時(shí)通過控制溫度使過控制溫度使DNADNA復(fù)制在體外反復(fù)進(jìn)行復(fù)制在體外反復(fù)進(jìn)行 PCR PCR技術(shù)是技術(shù)是8080年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴(kuò)增年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。技術(shù)。 它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、 快速、快速、 簡便、簡便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等突出重復(fù)性好、易自動(dòng)化等突出 6 6、 PCRPCR技術(shù)的特點(diǎn)技術(shù)的特點(diǎn)7 7、細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外DNADNA復(fù)制環(huán)境的區(qū)別復(fù)制環(huán)境的區(qū)別體內(nèi)體內(nèi)DNADNA的復(fù)制的復(fù)制體外的模擬體外的模擬模板（母鏈）模板（母鏈）細(xì)胞內(nèi)源細(xì)胞內(nèi)源外源加入外源加入引物引物引物合成酶引物合成酶外源加入外源加入底物底物dNTPdNTP細(xì)胞內(nèi)源細(xì)胞內(nèi)源外源加入外源加入聚合酶聚合酶細(xì)胞內(nèi)源細(xì)胞內(nèi)源外源加入外源加入反應(yīng)環(huán)境反應(yīng)環(huán)境細(xì)胞內(nèi)環(huán)境細(xì)胞內(nèi)環(huán)境緩沖液緩沖液 PCR PCR過程需要的引物不是過程需要的引物不是RNARNA，而是人工合，而是人工合成的成的DNADNA單鏈，其長度通常為單鏈，其長度通常為20203030個(gè)脫氧核苷酸個(gè)脫氧核苷酸8 8、細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和、細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和PCRPCR不同點(diǎn)不同點(diǎn) PCR PCR過程中過程中DNADNA的解旋不依靠解旋酶，而是通的解旋不依靠解旋酶，而是通過對(duì)反應(yīng)溫度的控制來實(shí)現(xiàn)的過對(duì)反應(yīng)溫度的控制來實(shí)現(xiàn)的（五）（五） PCRPCR的反應(yīng)過程的反應(yīng)過程1 1、PCRPCR的反應(yīng)步驟的反應(yīng)步驟 PCR PCR一般經(jīng)歷三十多次循環(huán)，一般經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為每次循環(huán)可以分為三個(gè)基本步驟三個(gè)基本步驟變性、復(fù)性和延伸變性、復(fù)性和延伸變性（模板變性（模板DNADNA解旋）解旋） 模板模板DNADNA經(jīng)加熱至經(jīng)加熱至90900 0C C以上。一定時(shí)間后，使模以上。一定時(shí)間后，使模板板DNADNA雙鏈或經(jīng)雙鏈或經(jīng)PCRPCR擴(kuò)增形成的雙鏈擴(kuò)增形成的雙鏈DNADNA解離，使成為解離，使成為單鏈，以便于它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備單鏈，以便于它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備2 2、循環(huán)過程、循環(huán)過程靶序列靶序列靶序列靶序列PCR PCR 循環(huán)第一步循環(huán)第一步 ：加熱變性：加熱變性復(fù)性（退火）復(fù)性（退火） 模板模板DNADNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降到經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降到50500 0C C左左右，引物與模板右，引物與模板DNADNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合靶序列靶序列靶序列靶序列引物引物 引物引物 5533555533553333PCR PCR 循環(huán)第二步循環(huán)第二步 ：引物與靶序列退火：引物與靶序列退火延伸延伸 DNA DNA模板引物結(jié)合物在模板引物結(jié)合物在TaqDNATaqDNA聚合酶的作用下聚合酶的作用下以脫氧核苷酸為原料，以母鏈為模板，按堿基互補(bǔ)配以脫氧核苷酸為原料，以母鏈為模板，按堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則與半保留復(fù)制的原理，合成一條新的對(duì)的原則與半保留復(fù)制的原理，合成一條新的DNADNA鏈鏈靶序列靶序列靶序列靶序列引物引物引物引物553 3555533553333Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶PCR PCR 循環(huán)第三步循環(huán)第三步 ：引物延伸：引物延伸靶序列靶序列 靶序列靶序列第第1 1個(gè)個(gè) PCR PCR 循環(huán)完成后循環(huán)完成后 ：得到兩個(gè)拷貝的靶序列：得到兩個(gè)拷貝的靶序列循環(huán)循環(huán)次數(shù)次數(shù)DNADNA數(shù)量數(shù)量1 12 22 24 43 38 820201,048,5761,048,57630301,073,741,8241,073,741,8243 3、3030次循環(huán)后靶序列擴(kuò)增的數(shù)量次循環(huán)后靶序列擴(kuò)增的數(shù)量4 4、PCR PCR 循環(huán)的結(jié)果循環(huán)的結(jié)果 DNA DNA聚合酶只能特異性地復(fù)制處于兩個(gè)引物聚合酶只能特異性地復(fù)制處于兩個(gè)引物之間的之間的DNADNA序列，使這段固定長度的序列呈指數(shù)擴(kuò)增序列，使這段固定長度的序列呈指數(shù)擴(kuò)增 從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應(yīng)，并且由引物為模板參與反應(yīng)，并且由引物延伸而成的延伸而成的DNADNA單鏈單鏈會(huì)與引物會(huì)與引物結(jié)合，進(jìn)行結(jié)合，進(jìn)行DNADNA的延伸的延伸二、二、 PCR PCR 的實(shí)驗(yàn)操作的實(shí)驗(yàn)操作1 1、PCRPCR儀儀（一）設(shè)備及用具（一）設(shè)備及用具實(shí)質(zhì)上一臺(tái)能夠?qū)嵸|(zhì)上一臺(tái)能夠自動(dòng)調(diào)控溫度自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器的儀器2 2、微量離心管、微量離心管一種一種薄壁塑料管薄壁塑料管，總?cè)莘e為，總?cè)莘e為0.5ml0.5ml3 3、微量移液器、微量移液器 用于用于定量轉(zhuǎn)移定量轉(zhuǎn)移PCRPCR配方中的配方中的液體，液體，其上的其上的一次性吸液槍頭用一次更換一次一次性吸液槍頭用一次更換一次PCRPCR儀儀微量離心管微量離心管微量移液器微量移液器1 1、準(zhǔn)備、準(zhǔn)備2 2、移液、移液（二）實(shí)驗(yàn)操作步驟（二）實(shí)驗(yàn)操作步驟 按照按照PCRPCR反應(yīng)體系的配方將所需用的試劑擺放反應(yīng)體系的配方將所需用的試劑擺放在實(shí)驗(yàn)桌上在實(shí)驗(yàn)桌上 用微量移液器按照用微量移液器按照PCRPCR反應(yīng)體系配方往微量反應(yīng)體系配方往微量離心管里面加入各種試劑離心管里面加入各種試劑過程：蓋嚴(yán)微量離心管口的蓋子，用手指輕輕彈過程：蓋嚴(yán)微量離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁擊管壁注意：注意：3 3、混合、混合 B B、手指輕輕彈擊微量離心管的管壁，目的是、手指輕輕彈擊微量離心管的管壁，目的是使反應(yīng)液混合均勻使反應(yīng)液混合均勻 A A、離心管口的蓋子一定蓋嚴(yán)，防止實(shí)驗(yàn)中脫、離心管口的蓋子一定蓋嚴(yán)，防止實(shí)驗(yàn)中脫落或液體外溢落或液體外溢將離心管放入將離心管放入PCRPCR儀上，設(shè)置好儀上，設(shè)置好PCRPCR儀的循環(huán)程序儀的循環(huán)程序過程：將微量離心管放在離心機(jī)上過程：將微量離心管放在離心機(jī)上, ,離心約離心約10s10s4 4、離心、離心5 5、反應(yīng)、反應(yīng)離心目的：使反應(yīng)液體集中在離心管底部，提高離心目的：使反應(yīng)液體集中在離心管底部，提高反應(yīng)效果反應(yīng)效果循環(huán)數(shù)循環(huán)數(shù)變性變性復(fù)性復(fù)性延伸延伸第一次第一次949410min10min3030次次4430s30s555530s30s72721min1min最后一次最后一次441min1min555530s30s72721min1min PCR PCR技術(shù)技術(shù)高度靈敏，高度靈敏，為了避免外源為了避免外源DNADNA等因素的等因素的污染而造成干擾實(shí)驗(yàn)，污染而造成干擾實(shí)驗(yàn)，PCRPCR操作時(shí)要注意做到：操作時(shí)要注意做到：6 6、注意事項(xiàng)、注意事項(xiàng) 隔離操作區(qū)，所用微量離心管、槍頭、緩沖隔離操作區(qū)，所用微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用必須進(jìn)行高壓滅菌；液以及蒸餾水等在使用必須進(jìn)行高壓滅菌； 分裝試劑，簡化操作程序，使用一次性槍頭分裝試劑，簡化操作程序，使用一次性槍頭（一）理論上（一）理論上DNADNA擴(kuò)增數(shù)目的計(jì)算擴(kuò)增數(shù)目的計(jì)算三、課題成果評(píng)價(jià)三、課題成果評(píng)價(jià)1 1 、一條、一條DNADNA，復(fù)制，復(fù)制n n次，次， DNADNA為為2 2 n n2 2 、 a a條條DNADNA，復(fù)制，復(fù)制n n次，次， DNADNA為為a x2 a x2 n n（二）實(shí)驗(yàn)中（二）實(shí)驗(yàn)中DNADNA含量的測(cè)定含量的測(cè)定1 1、原理、原理 可以通過計(jì)算可以通過計(jì)算DNADNA含量來評(píng)價(jià)擴(kuò)增的效果，含量來評(píng)價(jià)擴(kuò)增的效果，DNADNA在在260nm260nm的紫外線波段有一強(qiáng)烈的吸收峰，峰值的大的紫外線波段有一強(qiáng)烈的吸收峰，峰值的大小與小與DNADNA的含量有關(guān)的含量有關(guān)2 2 、過程、過程稀釋稀釋 2uLPCR 2uLPCR反應(yīng)液，加入反應(yīng)液，加入98uL98uL蒸餾水，即將樣品蒸餾水，即將樣品進(jìn)行進(jìn)行5050倍稀釋倍稀釋對(duì)照調(diào)零對(duì)照調(diào)零 以蒸餾水作為空白對(duì)照，在波長以蒸餾水作為空白對(duì)照，在波長260nm260nm處，將處，將紫外分光光度計(jì)的讀數(shù)調(diào)節(jié)至零紫外分光光度計(jì)的讀數(shù)調(diào)節(jié)至零 取取DNADNA稀釋液稀釋液100uL100uL至比色杯中，測(cè)定至比色杯中，測(cè)定260nm260nm處的處的光吸收值光吸收值計(jì)算計(jì)算計(jì)算計(jì)算DNADNA含量（含量（ g g）50 x(260nm50 x(260nm的讀數(shù)）的讀數(shù)） x x 稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù)5050：1 1 g g /ml /ml的的DNADNA在厚度為在厚度為1cm1cm比色杯中的吸光值為比色杯中的吸光值為0.020.02比色杯比色杯四、四、 課題延伸課題延伸 例如：例如：PCRPCR產(chǎn)物每輪循環(huán)增加一倍，產(chǎn)物每輪循環(huán)增加一倍，3030輪循環(huán)輪循環(huán)擴(kuò)增量達(dá)擴(kuò)增量達(dá)2 23030個(gè)拷貝（個(gè)拷貝（10109 9拷貝）拷貝） PCR PCR技術(shù)是技術(shù)是8080年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴(kuò)增年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。技術(shù)。 它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、 快速、快速、 簡便、簡便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等突出特點(diǎn)重復(fù)性好、易自動(dòng)化等突出特點(diǎn)五、實(shí)驗(yàn)小結(jié)五、實(shí)驗(yàn)小結(jié) PCRPCR儀加熱使（儀加熱使（ ）變性）變性, , 復(fù)性使引物與模板復(fù)性使引物與模板DNADNA（ ）, ,延伸需將反應(yīng)溫度升至中溫延伸需將反應(yīng)溫度升至中溫( ),( ),在在（ ）的作用下）的作用下, ,以（以（ ）為原）為原料料, ,以（以（ ）為復(fù)制的起點(diǎn)）為復(fù)制的起點(diǎn), ,合成新鏈。合成新鏈。 如此重復(fù)改如此重復(fù)改變反應(yīng)溫度變反應(yīng)溫度, ,經(jīng)（經(jīng)（ ）三個(gè)階段為一個(gè)）三個(gè)階段為一個(gè)循環(huán)循環(huán), ,每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍, ,一般樣品是經(jīng)過一般樣品是經(jīng)過3030次循環(huán)次循環(huán), ,最終使基因放大了數(shù)百萬最終使基因放大了數(shù)百萬倍倍; ; 將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳, ,經(jīng)溴化乙錠染色經(jīng)溴化乙錠染色, ,在紫外燈在紫外燈照射下肉眼能見到擴(kuò)增特異區(qū)段的照射下肉眼能見到擴(kuò)增特異區(qū)段的DNADNA帶。帶。模板模板互補(bǔ)互補(bǔ)TaqTaq聚合酶聚合酶四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸引物引物變性、復(fù)性和延伸變性、復(fù)性和延伸7272