2019-2020年高中生物 5.3血紅蛋白的提取和分離同步訓(xùn)練（含解析）新人教版選修1目標導(dǎo)航1.了解色譜法、電泳法等分離生物大分子的基本原理。2.理解緩沖液的組成和作用機理。3.體驗提取生物大分子的基本過程和方法。一、分離蛋白質(zhì)的基本方法原理1蛋白質(zhì)的分離方法凝膠色譜法凝膠色譜法也稱做_，是根據(jù)_的大小分離_的有效方法。相對分子質(zhì)量直徑大小運動方式運動速度運動路程洗脫次序大_凝膠顆?？障吨睆?，被排阻在_垂直向下移動_較短先從凝膠柱洗脫出來小_凝膠顆粒空隙直徑，可以進入顆粒內(nèi)部垂直向下移動，無規(guī)則擴散進入凝膠顆粒_較長后從凝膠柱洗脫出來2.緩沖液的作用和組成(1)作用在一定范圍內(nèi)，緩沖溶液能夠抵制外界_和_對溶液_的影響，維持pH基本不變。純水的pH因加入少量的強酸或強堿而發(fā)生很大變化。然而，1滴濃鹽酸加入到1 L CH3COOHCH3COONa混合溶液或NaH2PO4Na2HPO4混合溶液中，H的增加不到百分之一(從1.00107 mol/L增到1.01107 mol/L)，pH沒有明顯變化。(2)組成緩沖溶液通常由_種緩沖劑溶解于水中配制而成，調(diào)節(jié)緩沖劑的_就可以制得_的緩沖液，其類型主要有3種：弱酸及其對應(yīng)鹽，如CH3COOHCH3COONa，H2CO3NaHCO3。多元弱酸的酸式鹽及其對應(yīng)的次級鹽，如NaHCO3Na2CO3，NaH2PO4Na2HPO4。 弱堿及其對應(yīng)鹽，如NH3H2ONH4Cl。3電泳(1)概念電泳是指_在_的作用下發(fā)生_的過程。許多重要的生物大分子，如_、_等都具有可解離的基團，在一定的pH下，這些基團會帶上_或_。在電場的作用下，這些帶電分子會向著_的電極移動。(2)原理在同一電場下，由于各種分子_性質(zhì)的差異及分子本身_、_的不同，使帶電分子產(chǎn)生_，從而實現(xiàn)樣品中各種分子的分離。(3)常用方法_電泳：由于瓊脂糖本身不帶電荷，所以，各種分子在電場中的遷移速率因各種分子帶電性質(zhì)的差異、分子大小和形狀不同而不同，從而得以分離。_電泳加入SDS作用：使蛋白質(zhì)發(fā)生完全變性，解聚成單條肽鏈；與各種蛋白質(zhì)結(jié)合形成蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物，SDS所帶負電荷的量遠遠超過了蛋白質(zhì)原有的電荷量，因而掩蓋了不同蛋白質(zhì)間的電荷差別，使電泳遷移率完全取決于分子的大小。二、粗提取血紅蛋白1紅細胞的洗滌(1)目的：_，以利于后續(xù)步驟的分離純化。(2)過程：為防止血液凝固，需在采血器中加入抗凝血劑檸檬酸鈉 ：500 r/min，離心2 min，這樣做的目的是防止紅細胞與白細胞一同沉淀，達不到分離效果 ：用膠頭吸管吸去上層黃色血漿 ：向盛有暗紅色紅細胞液體的燒杯中加入五倍體積的生理鹽水，緩緩攪拌10 min ：直至上清液中沒有黃色，表明紅細胞已經(jīng)洗滌干凈，否則需重復(fù)洗滌(3)操作提示：洗滌次數(shù)、離心速度與離心時間十分重要，洗滌次數(shù)少，無法除去血漿蛋白，離心速度過高和時間過長會使白細胞等一同沉淀，達不到分離效果。2血紅蛋白的_(1)方法：將洗滌好的紅細胞倒入燒杯中，加_到原血液的體積，再加40%體積的_，置于磁力攪拌器上充分攪拌10 min。(2)目的：使紅細胞吸水_，血紅蛋白釋放出來。(3)原理：滲透作用。3分離血紅蛋白溶液(1)方法將攪拌好的混合液轉(zhuǎn)移到_中，以2 000 r/min的速度_10 min。將離心管中的液體部分用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀層。將濾液置于分液漏斗中，靜止片刻后，分出下層的紅色透明液體，即為血紅蛋白溶液。(2)目的：使_與大部分雜質(zhì)分離開，便于后續(xù)純化。(3)離心后試管中的溶液分為4層，最上面的一層是甲苯層，第二層是脂溶性物質(zhì)沉淀層，第三層是血紅蛋白水溶液層，最下層是雜質(zhì)沉淀層。4粗分離透析(1)原理：_能使小分子自由進出，而將大分子保留在袋內(nèi)。(2)過程：取1 mL的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300 mL的物質(zhì)的量濃度為20 mmol/L的磷酸緩沖液中(pH為7.0)，透析12 h。(3)目的除去樣品中相對分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)。用于更換樣品的緩沖液。三、純化蛋白質(zhì)1凝膠色譜柱的制作(1)取長40 cm，內(nèi)徑為1.6 cm的_，兩端需用砂紙磨平。(2)柱底部制作：打孔挖出_安裝移液管頭部覆蓋尼龍網(wǎng)，再用100目尼龍紗將_上部包好。(3)柱頂部制作：打孔安裝玻璃管。(4)將上述三部分按相應(yīng)位置組裝成一個整體。2凝膠色譜柱的裝填(1)計算：根據(jù)色譜柱的內(nèi)體積計算所需凝膠量(2)凝膠_：凝膠用蒸餾水充分溶脹后，配成凝膠懸液(3)_：將色譜柱垂直固定在支架上(4)_：將凝膠懸液一次性裝填入色譜柱內(nèi)(5)_：用20 mmol/L的磷酸緩沖液(pH7.0)洗滌平衡凝膠12 h，使凝膠裝填緊密3樣品的加入和洗脫(1)調(diào)整緩沖液面：打開色譜柱下端的流出口，調(diào)整緩沖液與凝膠面_ (2)_透析樣品：關(guān)閉下端出口，用吸管小心將1 mL樣品加到色譜柱頂端 (3)樣品滲入凝膠床：加樣后打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi) (4)再調(diào)整_：關(guān)閉出口，小心加入20 mmol/L的磷酸緩沖液到適當高度 (5)_：打開下端出口，用磷酸緩沖液洗脫 (6)收集：待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時，用試管收集流出液，每5 mL收集一管，連續(xù)收集四、實驗操作提示1紅細胞的洗滌：_。2凝膠的預(yù)處理：_。3色譜柱的裝填：_。4色譜柱成功的標志：_。五、蛋白質(zhì)純度鑒定及實驗結(jié)果分析與評價1純度鑒定_判斷純化的蛋白質(zhì)是否達到要求，需要進行蛋白質(zhì)純度的鑒定。鑒定的方法中，使用最多的是SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。2結(jié)果分析與評價項目分析血液樣品的處理分層_樣品處理完成凝膠色譜柱的裝填放一個與凝膠柱垂直的日光燈直接檢查；加入大分子有色物質(zhì)如藍色葡聚糖或紅色葡聚糖，若色帶均勻、狹窄、平整裝填成功血紅蛋白的分離血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨洗脫液緩慢流出分離成功知識點一分離蛋白質(zhì)的基本方法原理1利用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)時，蛋白質(zhì)洗脫出來的順序是()相對分子質(zhì)量最大的相對分子質(zhì)量最小的相對分子質(zhì)量適中的A B C D2凝膠色譜法是分離蛋白質(zhì)分子的一種常用方法，但并非所有的蛋白質(zhì)都可以用此方法進行分離，能分離的蛋白質(zhì)分子之間必須()A具有相同的相對分子質(zhì)量B相對分子質(zhì)量不同，但都是相對分子質(zhì)量較大的分子C相對分子質(zhì)量不同，但都是相對分子質(zhì)量較小的分子D具有不同的相對分子質(zhì)量知識點二分離蛋白質(zhì)的實驗操作3對在凝膠柱上加入樣品和洗脫的操作，不正確的是()A加樣前要使柱內(nèi)凝膠面上的緩沖液下降到與凝膠面平齊B讓吸管管口沿管壁環(huán)繞移動，貼壁加樣至色譜柱頂端，不要破壞凝膠面C打開下端出口，待樣品完全進入凝膠層后，直接連接緩沖液洗脫瓶開始洗脫D待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時，每5 mL收集一管，連續(xù)收集流出液4在蛋白質(zhì)的提取和分離中，關(guān)于對樣品處理過程的分析無誤的是()A洗滌紅細胞的目的是去除血漿中的葡萄糖、無機鹽B洗滌時離心速度過小，時間過短，白細胞等會沉淀，達不到分離的效果C洗滌過程選用0.1%的生理鹽水D透析的目的是去除樣品中相對分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)一、選擇題1電泳是指帶電粒子在電場的作用下向著與其所帶電荷_方向的電極移動()A相同 B相反 C相對 D相向2在血紅蛋白分離過程中，使用緩沖液的作用是()A維持溶液濃度不變B維持溶液酸堿度不變C催化蛋白質(zhì)分離過程順利完成D無實際意義3下列有關(guān)提取和分離血紅蛋白的敘述，錯誤的是()A樣品的處理就是通過一系列操作收集到血紅蛋白溶液B通過透析可以去除樣品中分子質(zhì)量較大的雜質(zhì)，此為樣品的粗提取C可通過凝膠色譜法將相對分子質(zhì)量大的雜質(zhì)蛋白除去，即樣品的純化D可通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定血紅蛋白的純度4凝膠色譜分離法分離蛋白質(zhì)時，凝膠的種類較多，但其作用的共同點是()A改變蛋白質(zhì)分子通過凝膠時的路徑B吸附一部分蛋白質(zhì)，從而影響蛋白質(zhì)分子的移動速度C將酶或細胞固定在凝膠中D與蛋白質(zhì)分子進行化學(xué)反應(yīng)，從而影響其移動速度5下列各項中，除哪項外均為電泳使樣品中各分子分離的原因()A分子帶電性質(zhì)的差異 B分子的大小C分子的形狀 D分子的變性溫度6下列關(guān)于樣品的加入和洗脫的敘述，正確的是()A先加入1 mL透析后的樣品B加樣前要使緩沖液緩慢下降全部流出C如果紅色區(qū)帶均勻一致地移動，說明色譜柱制作成功D洗脫時可以用緩沖液也可以用清水7凝膠柱制作的順序一般是()橡皮打孔挖凹穴裝玻璃管蓋尼龍網(wǎng)蓋尼龍紗將橡皮塞插入玻璃管接尼龍管、裝螺旋夾柱頂插入安裝玻璃管的橡皮塞A BC D8凝膠色譜柱制作成功的標志是()A凝膠裝填緊密、均勻B凝膠色譜柱中有氣泡C洗脫中，紅色區(qū)帶均勻一致移動D洗脫中，紅色區(qū)帶偏向左邊移動二、簡答題9凝膠色譜技術(shù)是六十年代初發(fā)展起來的一種快速而又簡單的分離技術(shù)，由于設(shè)備簡單、操作方便，不需要有機溶劑，對高分子物質(zhì)有很高的分離效果，目前已經(jīng)被生物化學(xué)、分子生物學(xué)、生物工程學(xué)、分子免疫學(xué)以及醫(yī)學(xué)等有關(guān)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，不但應(yīng)用于科學(xué)實驗研究，而且已經(jīng)大規(guī)模地用于工業(yè)生產(chǎn)。據(jù)圖回答問題：(1)a、b均為蛋白質(zhì)分子，其中先從層析柱中洗脫出來的是_，原因是_。(2)自己制作凝膠色譜柱時，在色譜柱底部d位置相當于多孔板的結(jié)構(gòu)可由_替代。(3)裝填凝膠色譜柱時，色譜柱內(nèi)不能有氣泡存在，原因是_。(4)若選用Sephadex G100，則“G”表示_，100表示_。10紅細胞含有大量血紅蛋白，紅細胞的機能主要是由血紅蛋白完成，血紅蛋白的主要功能是攜帶O2或CO2，我們可以選用豬、牛、羊或其他脊椎動物的血液進行實驗，來提取和分離血紅蛋白，請回答下列有關(guān)問題：(1)血紅蛋白提取和分離的過程可分為四步：_、_、_和_。(2)實驗前取新鮮的血液，要切記在采血容器中預(yù)先加入檸檬酸鈉，取血回來，馬上進行離心，收集血紅蛋白溶液。加入檸檬酸鈉的目的是_。以上所述的過程即是樣品處理，它包括_、_、收集血紅蛋白溶液。(3)洗滌紅細胞的目的是_。(4)你如何知道紅細胞已洗滌干凈？_。(5)分離紅細胞時的離心速度及離心時間分別是_。(6)若離心速度過高和時間過長結(jié)果會怎樣？_。(7)將收集的血紅蛋白溶液放在透析袋中進行透析，即樣品的粗分離。透析的目的是_；透析的原理是_。(8)然后通過凝膠色譜法將樣品進一步純化，最后經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳進行純度鑒定。樣品純化的目的是_。第18課時血紅蛋白的提取和分離知識清單一、1.分配色譜法相對分子質(zhì)量蛋白質(zhì)大于外面較快小于較慢2(1)酸堿pH(2)12使用比例在不同pH范圍內(nèi)使用3(1)帶電粒子電場遷移多肽核酸正電負電與其所帶電荷相反(2)帶電大小形狀不同的遷移速度(3)瓊脂糖凝膠聚丙烯酰胺凝膠二、1.(1)去除雜蛋白(2)離心血漿洗滌2釋放(1)蒸餾水甲苯(2)漲破3(1)離心管離心(2)血紅蛋白4(1)透析袋三、1.(1)玻璃管(2)凹穴橡皮塞2(2)溶脹(3)固定(4)裝填(5)洗滌平衡3(1)平齊(2)滴加(4)緩沖液面(5)洗脫四、1.洗滌次數(shù)不能過少；低速、短時離心2沸水浴法不但節(jié)約時間，而且可以除去凝膠中可能帶有的微生物和氣泡3裝填盡量緊密，降低顆粒間隙；無氣泡；洗脫液不能斷流4紅色區(qū)帶均勻一致地移動五、1.SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳2.明顯對點訓(xùn)練1C分子很大，完全不能進入凝膠內(nèi)的任何孔隙的蛋白質(zhì)洗脫出來的時間最短；分子大小適中，能進入凝膠內(nèi)孔隙中孔徑大小相應(yīng)部分的蛋白質(zhì)，洗脫出來的時間次之；分子很小，能進入分子篩全部孔隙內(nèi)的蛋白質(zhì)，洗脫出來的時間最長。聯(lián)想凝膠色譜法是根據(jù)相對分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的有效方法，相對分子質(zhì)量很小，能進入分子篩的全部孔隙，運動速度最慢，路程最長；相對分子質(zhì)量較大的，不能進入凝膠顆粒內(nèi)，運動速度最快，路程最短。所以，蛋白質(zhì)可以按不同順序洗脫出來。規(guī)律鏈接凝膠色譜中分子彼此間較易分開的原因在凝膠色譜中會有三種情況：一是分子很小，能進入分子篩的全部內(nèi)孔隙；二是分子很大，完全不能進入凝膠的任何內(nèi)孔隙；三是分子大小適中，能進入凝膠的內(nèi)孔隙中孔徑大小相應(yīng)的部分。三類分子彼此間較易分開。2C若在每種凝膠分離范圍之外的分子，在不改變凝膠種類的情況下是很難分離的。對于分子大小不同，但同屬于凝膠分離范圍內(nèi)的各種分子，在凝膠床中的分布情況是不同的，分子較大的只能進入孔徑較大的那一部分凝膠。3C打開下端出口，待樣品完全進入凝膠層后，關(guān)閉下端出口，在用同樣的方法小心加入適量的20 mmol/L的磷酸緩沖液，然后連接緩沖液洗脫瓶開始洗脫。規(guī)律鏈接血紅蛋白提取與分離過程中的注意事項1紅細胞的洗滌(1)離心速度與離心時間十分重要，離心轉(zhuǎn)速要低，時間要短，否則白細胞等會一同沉淀，達不到分離的效果。(2)重復(fù)洗滌三次，如上清液仍有黃色，可增加洗滌次數(shù)，否則無法清除血漿蛋白。2血紅蛋白的釋放(1)蒸餾水的作用：使紅細胞的細胞膜和核膜破裂。(2)甲苯的作用：溶解細胞膜。3色譜柱填料的處理為了加速干凝膠的膨脹，可將加入洗脫液的濕凝膠用沸水浴加熱，通常只需12 h。這種方法不僅節(jié)約時間，還可除去凝膠中可能帶有的微生物，排出膠粒內(nèi)的空氣。4凝膠色譜柱的裝填在色譜柱中裝填凝膠的時候要盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。(1)在裝填凝膠柱時，不得有氣泡存在。因為氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。(2)在凝膠色譜操作過程中，不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。一旦發(fā)生上述兩種情況，凝膠色譜柱需要重新裝填。5蛋白質(zhì)的分離滴加樣品時，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動加樣，不要破壞凝膠面。根據(jù)紅色區(qū)帶的移動狀況判斷收集流出液的時間。4D洗滌紅細胞的目的是去除血漿中除血紅蛋白以外的雜蛋白；洗滌時離心速度過大，時間過長，白細胞等會沉淀，達不到分離的效果；洗滌過程選用0.9%的生理鹽水。達標測試1B在一定pH作用下，生物大分子中有某些可解離的基團，這些基團會帶上正電荷或負電荷，在電場作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動。2B分離蛋白質(zhì)時加入緩沖液，其原因是緩沖液在一定范圍內(nèi)能抵制外界酸和堿對反應(yīng)溶液pH的影響，保持pH基本不變。3B血紅蛋白的提取和分離一般分為四步：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。其中樣品處理又包括紅細胞的洗滌、血紅蛋白釋放、分離血紅蛋白溶液等步驟，其目的是獲得血紅蛋白溶液；粗分離即透析，其目的是除去樣品中相對分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)，故B項描述錯誤。4A凝膠的種類較多，但每種凝膠內(nèi)部都有孔隙。相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時，相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)分子可以進入凝膠內(nèi)部，通過的路程較長，洗脫時從凝膠柱中出來的較晚，相反相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)分子則可以較早的洗脫出來，從而達到分離蛋白質(zhì)的目的。5D電泳是指帶電粒子在電場作用下發(fā)生遷移的過程，樣品分子的帶電性質(zhì)不同、分子的大小和形狀不同都會影響帶電粒子在電場中的遷移速度，與分子的變性溫度無關(guān)，故選D項。6C加樣前，打開色譜柱下端的流出口，使柱內(nèi)凝膠面上的緩沖液緩慢下降到與凝膠面齊平，關(guān)閉出口之后，用吸管小心地將1 mL透析后的樣品加到色譜柱的頂端。7B凝膠柱制作的一般流程是：選擇玻璃管選擇合適的橡皮塞打孔挖凹穴蓋尼龍網(wǎng)蓋尼龍紗將橡皮塞插到玻璃管接尼龍管裝螺旋夾柱頂插入安裝玻璃管的橡皮塞。8C洗脫過程中，如果紅色區(qū)帶均勻一致地移動，說明色譜柱制作成功。9(1)aa相對分子質(zhì)量大，無法進入凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動，路程較短，移動速度較快(2)尼龍網(wǎng)和尼龍紗(3)氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果(4)凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍凝膠得水值解析用凝膠色譜法分離各種大分子物質(zhì)時，大分子物質(zhì)先洗脫出來，然后是小分子物質(zhì)。大分子物質(zhì)由于直徑較大，不易進入凝膠顆粒的微孔，而只能分布于顆粒之間，所以向下移動的速度較快。小分子物質(zhì)除了可在凝膠顆粒間隙中擴散外，還可以進入凝膠顆粒的微孔中，在向下移動的過程中，從一個凝膠內(nèi)擴散到顆粒間隙后再進入另一凝膠顆粒，如此不斷地進入和擴散，小分子物質(zhì)的下移速度落后于大分子物質(zhì)，從而落后于大分子物質(zhì)洗脫出來。在色譜柱中填凝膠的時候要盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。一是在裝填凝膠柱時，不得有氣泡存在，因為氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。二是凝膠色譜操作過程中，不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。一旦發(fā)生上述兩種情況，凝膠色譜柱需要重新裝填。10(1)樣品處理粗分離純化純度鑒定(2)防止血液凝固紅細胞的洗滌血紅蛋白的釋放(3)去除血漿蛋白(4)離心后的上清液沒有黃色(5)低速500 r/min；短時間如2 min(6)離心速度過高和時間過長會使白細胞等一同沉淀，得不到純凈的紅細胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度(7)去除分子量較小的雜質(zhì)透析袋能使小分子自由進出，而大分子則保留在袋內(nèi)(8)通過凝膠色譜法將相對分子質(zhì)量大的雜質(zhì)蛋白除去