成才之路生物,路漫漫其修遠(yuǎn)兮吾將上下而求索,人教版選修1,DNA和蛋白質(zhì)技術(shù),專(zhuān)題五,課題3血紅蛋白的提取與分離,專(zhuān)題五,1.掌握提取生物大分子的基本過(guò)程和方法。(重點(diǎn))2理解凝膠色譜法、電泳法等分離生物大分子的基本原理。(重、難點(diǎn))3嘗試對(duì)血液中的血紅蛋白進(jìn)行提取和分離。,一、凝膠色譜法1概念：也稱(chēng)做_，是根據(jù)_分離蛋白質(zhì)的有效方法。2原理當(dāng)_不同的蛋白質(zhì)通過(guò)凝膠時(shí)，相對(duì)分子質(zhì)量_的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程_，移動(dòng)速度_，而相對(duì)分子質(zhì)量_的蛋白質(zhì)無(wú)法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在_移動(dòng)，路程_，移動(dòng)速度_，從而使_不同的蛋白質(zhì)分子得以分離。,分配色譜法,相對(duì)分子質(zhì)量大小,相對(duì)分子質(zhì)量,較小,較大,較慢,較大,凝膠外部,短,快,相對(duì)分子質(zhì)量,二、緩沖溶液1作用：在一定范圍內(nèi)，抵制_的_對(duì)溶液pH的影響，維持pH_。2配制：由_種緩沖劑溶解于_中配制而成，通過(guò)調(diào)節(jié)緩沖劑的_就可以得到不同pH范圍內(nèi)使用的緩沖液。,外界,酸和堿,相對(duì)穩(wěn)定,12,水,使用比例,三、電泳1概念：指_在電場(chǎng)的作用下發(fā)生的_的過(guò)程。2原理：在一定的_下，_、_等生物大分子的可解離基團(tuán)會(huì)帶上_或_，在_的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷_的電極移動(dòng)。,帶電粒子,遷移,pH,多肽,核酸,正電,負(fù)電,電場(chǎng),相反,3作用：電泳利用了待分離樣品中各種分子_的差異及分子本身的_、_的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的_，從而實(shí)現(xiàn)樣品中_的分離。4方法：常用的電泳方法有_和_。測(cè)定蛋白質(zhì)分子量時(shí)通常使用_。,帶電性質(zhì),大小,形狀,遷移速度,各種分子,瓊脂糖凝膠電泳,聚丙烯酰胺凝胺電泳,SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳,四、實(shí)驗(yàn)操作蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：_、_、_和_。1樣品處理(1)紅細(xì)胞的洗滌：目的是_。采用_離心，吸取血漿后加_洗滌，直至上清液中沒(méi)有_，表明紅細(xì)胞已洗滌干凈。(2)血紅蛋白的釋放：在_和_的作用下，紅細(xì)胞破裂，釋放出血紅蛋白。,樣品處理,粗分離,純化,純度鑒定,去除雜蛋白,低速短時(shí)間,生理鹽水,黃色,蒸餾水,甲苯,(3)分離血紅蛋白溶液：把混合液離心后，將試管中的液體用濾紙過(guò)濾，除去_，于分液漏斗中靜置片刻后，分離出下層的_。(4)透析：透析袋能使小分子自由進(jìn)出，而將大分子物質(zhì)保留在袋內(nèi)。,脂溶性沉淀層,紅色透明液體,2凝膠色譜操作(1)凝膠色譜柱的制作：準(zhǔn)備材料加工橡皮塞安裝色譜柱。(2)凝膠色譜柱的裝填。(3)樣品的加入和洗脫。其基本過(guò)程是調(diào)節(jié)緩沖液面加入蛋白質(zhì)樣品調(diào)節(jié)緩沖液面洗脫收集分裝蛋白質(zhì)。至此，血紅蛋白即可得到粗分離。3純度鑒定：在鑒定的方法中，使用最多的是_。,SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳,五、操作提示1紅細(xì)胞的洗滌：_、_與_十分重要。洗滌次數(shù)過(guò)少，無(wú)法除去_；離心速度_和時(shí)間_會(huì)使_等一同沉淀，達(dá)不到分離效果。2色譜柱填料的處理：商品凝膠使用前需直接放在_中膨脹，可以將加入其中的濕凝膠用_，加速膨脹。3凝膠色譜柱的裝填：在裝填凝膠柱時(shí)，不能有_存在。因其能攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的_，降低分離效果。4蛋白質(zhì)的分離：如果_，說(shuō)明色譜柱制作成功。,洗滌次數(shù),離心速度,離心時(shí)間,血漿蛋白,過(guò)高,過(guò)長(zhǎng),白細(xì)胞,洗脫液,沸水浴加熱,氣泡,洗脫次序,紅色區(qū)帶均勻一致地移動(dòng),紅細(xì)胞破碎后混合液中含有什么成分？紅細(xì)胞破碎混合液中不僅含有血紅蛋白，而且還含有細(xì)胞破碎物、脂質(zhì)、甲苯等。,教材P70“旁欄思考題”凝膠實(shí)際上是一些微小的多孔球體，小球體內(nèi)部有許多貫穿的通道。相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)分子不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，只能分布在顆粒之間，通過(guò)的路程較短，移動(dòng)速度較快；相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)分子比較容易進(jìn)入凝膠內(nèi)的通道，通過(guò)的路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較慢。因此，樣品中相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)先流出，相對(duì)分子質(zhì)量中等的分子后流出，相對(duì)分子質(zhì)量最小的分子最后流出，從而使各種相對(duì)分子質(zhì)量不同的分子得以分離。,如果凝膠裝填得不夠緊密、均勻，就會(huì)在色譜柱內(nèi)形成無(wú)效的空隙，使本該進(jìn)入凝膠內(nèi)部的樣品分子從這些空隙中通過(guò)，攪亂洗脫液的流動(dòng)次序，從而影響分離的效果。,(一)依據(jù)蛋白質(zhì)的特性的差異蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)(如形狀、大小、電荷性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)、親和力等)千差萬(wàn)別，由此可提取和分離各種蛋白質(zhì)。,血紅蛋白提取和分離的方法,(二)蛋白質(zhì)的分離方法：凝膠色譜法1概念：凝膠色譜法也稱(chēng)做分配色譜法，是根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量大小分離蛋白質(zhì)的有效方法。2原理：大多數(shù)凝膠由糖類(lèi)化合物構(gòu)成的小球體，內(nèi)部有許多貫穿的通道，當(dāng)不同的蛋白質(zhì)通過(guò)凝膠時(shí)，相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程較長(zhǎng)移動(dòng)速度較慢；而相對(duì)分子量較大的蛋白質(zhì)無(wú)法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動(dòng)，路程較短，移動(dòng)速度較快。,(三)緩沖溶液1作用：在一定范圍內(nèi)，緩沖溶液能夠抵制外界的酸和堿對(duì)溶液pH的影響，維持pH基本不變。2配制：通常由12種緩沖劑溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的使用比例就可以制得在不同pH范圍內(nèi)使用的緩沖液。,(四)電泳1概念：帶電粒子在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過(guò)程。2原理：許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解離的基團(tuán)，在一定pH下，這些基團(tuán)會(huì)帶上正電或負(fù)電。在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng)。電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小、形狀的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。,電泳利用了除哪些性質(zhì)外使樣品中各種分子分離()A帶電性質(zhì)差異B分子的大小C分子的形狀D分子的變性溫度解析電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)作用下發(fā)生遷移的過(guò)程，帶電性質(zhì)不同、分子的大小和形狀不同都會(huì)影響帶電粒子在電場(chǎng)中的遷移速度。答案D,導(dǎo)學(xué)號(hào)06350412,利用凝膠色譜法，什么樣的蛋白質(zhì)先洗脫出來(lái)()A相對(duì)分子質(zhì)量大的B溶解度高的C相對(duì)分子質(zhì)量小的D所帶電荷多的答案A解析凝膠色譜法是根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的有效方法。相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)能進(jìn)入凝膠內(nèi)部通道，路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較慢；相對(duì)分子質(zhì)量大的蛋白質(zhì)，路程較短，移動(dòng)速度較快，首先洗脫出來(lái)。,導(dǎo)學(xué)號(hào)06350413,蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。,提取和分離血紅蛋白的實(shí)驗(yàn)操作,(二)凝膠色譜操作的主要步驟,3純度鑒定SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳判斷純化的蛋白質(zhì)是否達(dá)到要求，需要進(jìn)行蛋白質(zhì)純度的鑒定。鑒定的方法中，使用最多的是SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。,4結(jié)果分析與評(píng)價(jià),蛋白質(zhì)提取和分離分為哪幾步()A樣品處理、凝膠色譜操作、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳B樣品處理、凝膠色譜操作、純化C樣品處理、粗分離、純化、純度鑒定D樣品處理、純化、粗分離、純度鑒定解析蛋白質(zhì)的提取和分離分為樣品處理、粗分離、純化、純度鑒定四步。A中凝膠色譜操作及SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳為實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中的技術(shù)。答案C,導(dǎo)學(xué)號(hào)06350414,相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)在凝膠中的行進(jìn)過(guò)程，可表示為下圖中哪一個(gè)()答案B,導(dǎo)學(xué)號(hào)06350415,解析本題考查對(duì)凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)原理的理解，蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量越大，越容易通過(guò)凝膠間隙而先被洗脫，蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量越小則易進(jìn)入凝膠內(nèi)部而后被洗脫。,一、蛋白質(zhì)分子在凝膠中的運(yùn)動(dòng)情況分析特別提示：凝膠色譜的原理是相對(duì)分子質(zhì)量小的蛋白質(zhì)進(jìn)入凝膠孔道，路程長(zhǎng)，移動(dòng)速度慢；而相對(duì)分子質(zhì)量大的蛋白質(zhì)在凝膠外部移動(dòng)，路程短，移動(dòng)快，這種現(xiàn)象又稱(chēng)分子篩效應(yīng)。,二、樣品處理、分離與純化的目的不同,答案較慢較快pH帶電性質(zhì)凝膠色譜法,