實(shí)驗(yàn)三：PCR擴(kuò)增檢測乙肝病毒,1,乙肝病毒（HBV）感染引起的乙型肝炎，我國發(fā)病率很高，HBV的檢測極其重要。HBVDNA存在就可以引起乙肝的傳染，乙肝病毒基因是乙肝病毒的核心成分，是病毒復(fù)制的發(fā)動機(jī)。,2,PCR技術(shù)可以檢測出極微量的病毒，是判斷其傳染性最直接、最可靠的證據(jù)。PCR技術(shù)已成為公認(rèn)的對病毒性肝炎的診斷、療效觀察及預(yù)防研究工作最理想的方法之一。,3,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握PCR技術(shù)擴(kuò)增的原理2.熟悉PCR擴(kuò)增檢測乙肝病毒的基本操作過程。,4,二、實(shí)驗(yàn)原理聚合酶鏈反應(yīng)(PolymeraseChainReaction)簡稱PCR,是在體外條件下利用DNA聚合酶、催化一對引物間的特異性DNA片段合成的基因體外擴(kuò)增技術(shù)，它包括三個(gè)基本過程：,5,1.變性：加熱使雙鏈DNA變?yōu)閱捂?.退火：急速降溫使引物和互補(bǔ)模板在局部形成雜交鏈3.延伸：耐熱DNA聚合酶按53方向催化以引物為起始點(diǎn)的延伸反應(yīng),6,模板DNA,高溫變性,低溫退火,引物,適溫延伸,經(jīng)過25-35次循環(huán)后，目的片段擴(kuò)增2n倍,兩條子代DNA,一次循環(huán),Tap酶,5,3,3,5,3,5,5,3,5,3,7,三、主要器材及試劑1.主要器材：,9700型PCR儀,電泳槽、電泳儀,8,紫外分析儀,臺式高速離心機(jī),9,2.主要試劑：,10,四、操作步驟1.標(biāo)本處理：取患者血清40l，加入DNA提取液40l，沸水浴10分鐘，10000轉(zhuǎn)離心5分鐘，取上清液4l做PCR反應(yīng)。,11,2.加樣：加入提取好的標(biāo)本4l，6000轉(zhuǎn)離心10秒。,12,三個(gè)擴(kuò)增步驟溫度及時(shí)間,循環(huán)次數(shù)：25次,3.PCR儀上擴(kuò)增：,13,PCR儀上擴(kuò)增,加入標(biāo)本,離心,6000轉(zhuǎn)離心10秒,14,4.電泳檢測：制備2%瓊脂糖凝膠,2%瓊脂糖的制備：,電泳槽的準(zhǔn)備：,稱取0.8g瓊脂糖,40mlTBE電泳緩沖液（PH8.0)煮沸溶解,加入,冷卻,60左右,加入溴乙啶EB20l,倒膠,15,加樣：取擴(kuò)增后的產(chǎn)物10ul點(diǎn)樣于凝膠孔,取樣,點(diǎn)樣,16,電泳：點(diǎn)樣端接“-”，穩(wěn)壓，50V，電泳30分鐘。五、結(jié)果觀察：紫外分析儀下觀察，出現(xiàn)橙黃色條帶則為HBV陽性,HBV陽性,HBV陰性,HBV陽性對照,HBV陰性對照,正極,負(fù)極,點(diǎn)樣孔,17,五、注意事項(xiàng)1.試劑盒內(nèi)陽性標(biāo)本及DNA提取液使用前需充分融化離心。2.反應(yīng)液的表面為固體封蓋劑，電泳取樣時(shí)從反應(yīng)管底部吸液。3.EB為強(qiáng)致癌物，操作過程應(yīng)注意防護(hù)。4.注意無菌操作，以免出現(xiàn)假陽性。,18,Thankyou!,19,