基因工程考點(diǎn)一基因工程的操作工具1限制性核酸內(nèi)切酶(簡稱限制酶)(1)來源：主要是從原核生物中分離純化出來的。(2)作用：識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列并切開特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵。(3)結(jié)果：產(chǎn)生黏性末端或平末端。2DNA連接酶種類Ecoli DNA連接酶T4DNA連接酶來源大腸桿菌T4噬菌體特點(diǎn)只縫合黏性末端縫合黏性末端和末端作用恢復(fù)被限制酶切開的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵3載體(1)作用：攜帶外源DNA片段進(jìn)入受體細(xì)胞。(2)種類：質(zhì)粒、噬菌體的衍生物、動(dòng)植物病毒等。(3)條件基礎(chǔ)自測(cè)1判斷下列敘述的正誤(1)切割質(zhì)粒的限制性核酸內(nèi)切酶均能特異性地識(shí)別6個(gè)核苷酸序列()(2)載體質(zhì)粒通常采用抗生素合成基因作為篩選標(biāo)記基因()(3)限制酶只能用于切割目的基因()(4)DNA連接酶能將兩堿基間通過氫鍵連接起來()(5)限制性核酸內(nèi)切酶、DNA連接酶和質(zhì)粒是基因工程中常用的三種工具酶()(6)Ecoli DNA連接酶既可連接平末端，又可連接黏性末端()(7)用于載體的質(zhì)粒DNA分子上至少含一個(gè)限制酶識(shí)別位點(diǎn)()(8)載體的作用是攜帶目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞中，使之穩(wěn)定存在并表達(dá)()2載體需具備的條件及其作用(連線)3據(jù)兩種限制酶的作用圖示填空(1)已知限制酶EcoR和Sma識(shí)別的堿基序列和酶切位點(diǎn)分別為GAATTC和CCCGGG，在圖中畫出兩種限制酶切割DNA后產(chǎn)生的末端。(2)寫出產(chǎn)生的末端的種類：產(chǎn)生的是黏性末端；產(chǎn)生的是平末端。(3)EcoR限制酶和Sma限制酶識(shí)別的堿基序列不同，切割位點(diǎn)不同(填“相同”或“不同”)，說明限制酶具有專一性。4學(xué)透教材、理清原因、規(guī)范答題用語專練(1)是_酶，是_酶，二者的作用部位都是_。(2)限制酶不切割自身DNA的原因：_。答案：(1)限制DNA連接磷酸二酯鍵(2)自身DNA不存在該酶的識(shí)別序列或識(shí)別序列已經(jīng)被修飾1.與DNA有關(guān)的酶的比較名稱作用部位作用底物作用結(jié)果限制酶磷酸二酯鍵DNA將DNA切成兩個(gè)片段DNA連接酶磷酸二酯鍵DNA片段將兩個(gè)DNA片段連接為一個(gè)DNA分子DNA聚合酶或熱穩(wěn)定DNA聚合酶磷酸二酯鍵脫氧核苷酸將單個(gè)脫氧核苷酸依次連接到單鏈末端DNA(水解)酶磷酸二酯鍵DNA將DNA片段水解為單個(gè)脫氧核苷酸解旋酶堿基對(duì)之間的氫鍵DNA將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈，形成兩條長鏈RNA聚合酶磷酸二酯鍵核糖核苷酸將單個(gè)核糖核苷酸依次連接到單鏈末端2限制酶的特點(diǎn)與使用(1)限制酶具有特異性，即一種限制酶只能識(shí)別特定的核苷酸序列，并在特定的位點(diǎn)上進(jìn)行切割；限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在該酶的識(shí)別序列或識(shí)別序列已經(jīng)被修飾。(2)在獲取目的基因和切割載體時(shí)通常用同一種限制酶，以獲得相同的黏性末端。但如果用兩種不同限制酶切割后形成的黏性末端相同，在DNA連接酶的作用下目的基因與載體也可以連接起來。(3)為了防止載體或目的基因的黏性末端自己連接即所謂“環(huán)化”，可用不同的限制酶分別處理含目的基因的DNA和載體，使目的基因兩側(cè)及載體上各自具有兩個(gè)不同的黏性末端。對(duì)點(diǎn)落實(shí)1(2016全國卷)圖(a)中的三個(gè)DNA片段上依次表示出了EcoR 、BamH 和Sau3A三種限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列與切割位點(diǎn)，圖(b)為某種表達(dá)載體的示意圖(載體上的EcoR、Sau3A的切點(diǎn)是唯一的)。GAATTCGGATCCGATCCTTAAGCCTAGGCTAG圖(a)根據(jù)基因工程的有關(guān)知識(shí)，回答下列問題：(1)經(jīng)BamH酶切后得到的目的基因可以與上述表達(dá)載體被_酶切后的產(chǎn)物連接，理由是_。(2)若某人利用圖(b)所示的表達(dá)載體獲得了甲、乙、丙三種含有目的基因的重組子，如圖(c)所示。這三種重組子中，不能在宿主細(xì)胞中表達(dá)目的基因產(chǎn)物的有_，不能表達(dá)的原因是_。 圖(b)圖(c)(3)DNA連接酶是將兩個(gè)DNA片段連接起來的酶，常見的有_和_，其中既能連接黏性末端又能連接平末端的是_。解析：(1)由題圖可知，BamH和Sau3A兩種限制性內(nèi)切酶的共同識(shí)別序列是，二者切割可以形成相同的黏性末端，因此經(jīng)BamH酶切得到的目的基因可以與圖(b)所示表達(dá)載體被Sau3A酶切后的產(chǎn)物連接。(2)在基因表達(dá)載體中，啟動(dòng)子應(yīng)位于目的基因的首端，終止子應(yīng)位于目的基因的尾端，這樣目的基因才能順利地轉(zhuǎn)錄，再完成翻譯過程，即順利表達(dá)。圖中甲所示的目的基因插入在啟動(dòng)子的上游，丙所示目的基因插入在終止子的下游，二者的目的基因均不能被轉(zhuǎn)錄，因此目的基因不能表達(dá)。(3)常見的DNA連接酶有Ecoli DNA連接酶和T4DNA連接酶，其中T4DNA連接酶既能連接黏性末端又能連接平末端。答案：(1)Sau3A兩種酶切割后產(chǎn)生的片段具有相同的黏性末端(2)甲和丙甲中目的基因插入在啟動(dòng)子的上游，丙中目的基因插入在終止子的下游，二者的目的基因均不能被轉(zhuǎn)錄(其他合理答案也可)(3)Ecoli DNA連接酶T4DNA連接酶T4DNA連接酶(其他合理答案也可)2(2016江蘇高考，有改動(dòng))下表是幾種限制酶識(shí)別序列及其切割位點(diǎn)，圖1、圖2中標(biāo)注了相關(guān)限制酶的酶切位點(diǎn)，其中切割位點(diǎn)相同的酶不重復(fù)標(biāo)注。請(qǐng)回答下列問題：限制酶BamHBclSau3AHind 識(shí)別序列及切割位點(diǎn) (1)用圖中質(zhì)粒和目的基因構(gòu)建重組質(zhì)粒，應(yīng)選用_兩種限制酶切割，酶切后的載體和目的基因片段，通過_酶作用后獲得重組質(zhì)粒。為了擴(kuò)增重組質(zhì)粒，需將其轉(zhuǎn)入處于_態(tài)的大腸桿菌。(2)為了篩選出轉(zhuǎn)入了重組質(zhì)粒的大腸桿菌，應(yīng)在篩選平板培養(yǎng)基中添加_，平板上長出的菌落，常用PCR鑒定，所用的引物組成為圖2中_。(3)若BamH酶切的DNA末端與Bcl酶切的DNA末端連接，連接部位的6個(gè)堿基對(duì)序列為_，對(duì)于該部位，這兩種酶_(填“都能”“都不能”或“只有一種能”)切開。(4)若用Sau3A切圖1質(zhì)粒最多可能獲得_種大小不同的DNA片段。解析：(1)基因工程中選擇合適的限制酶切割質(zhì)粒和目的基因時(shí)，應(yīng)保留目的基因和至少一個(gè)標(biāo)記基因結(jié)構(gòu)的完整性，即遵循“目的基因切兩側(cè)，標(biāo)記基因留一個(gè)”的基本原則，最好選擇切割產(chǎn)生不同末端的兩種限制酶同時(shí)切割質(zhì)粒和目的基因，以避免目的基因的反向插入帶來的不正常表達(dá)，因此據(jù)圖分析應(yīng)選擇的限制酶為Bcl和Hind，切割后質(zhì)粒上保留的四環(huán)素抗性基因作為標(biāo)記基因。酶切后的載體和目的基因通過DNA連接酶的作用形成重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒需要導(dǎo)入Ca2處理后的處于感受態(tài)的大腸桿菌(處于感受態(tài)的大腸桿菌細(xì)胞膜的通透性大大增加，便于重組質(zhì)粒進(jìn)入)。(2)由上述分析可知，為了篩選出導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌，應(yīng)先配制含四環(huán)素的選擇培養(yǎng)基，平板上長出的菌落為導(dǎo)入普通質(zhì)粒或重組質(zhì)粒的大腸桿菌菌落，進(jìn)一步鑒定出導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌，可利用PCR擴(kuò)增的方式，結(jié)合電泳技術(shù)來分析處理。DNA的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械?，在PCR過程中，當(dāng)引物與DNA母鏈通過堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合后，DNA聚合酶只能從引物的3端延伸DNA鏈，因此應(yīng)選擇引物甲和引物丙。(3)因?yàn)锽cl和BamH酶切產(chǎn)生的黏性末端相同，所以可以被DNA連接酶連接，連接部位的6個(gè)堿基對(duì)序列為，但是連接后形成的DNA中不再具有Bcl和BamH的識(shí)別序列，連接部位不能被這兩種酶切開。(4)由圖可知，能被限制酶Bcl和BamH切割的序列也能被Sau3A識(shí)別并切割，因此圖中質(zhì)粒上存在3個(gè)Sau3A的切割位點(diǎn)，若將3個(gè)切割位點(diǎn)之間的DNA片段分別編號(hào)為a、b和c，則完全酶切(3個(gè)切割位點(diǎn)均被切割)會(huì)產(chǎn)生3種大小的DNA片段，即為a、b和c；考慮只切1個(gè)切割位點(diǎn)，有3種情況，都產(chǎn)生1種大小的DNA片段，即大小均為abc；考慮切2個(gè)切割位點(diǎn)，則會(huì)產(chǎn)生ab、c、ac、b、bc、a幾種不同大小的DNA片段。綜上所述，若用Sau3A識(shí)別并切割圖中質(zhì)粒，最多可獲得7種大小的DNA片段，即為abc、ab、ac、bc、a、b、c。答案：(1)Bcl和Hind連接感受(2)四環(huán)素引物甲和引物丙(3)都不能(4)7 類題通法選擇限制酶的技巧(1)根據(jù)目的基因兩端的限制酶切點(diǎn)確定限制酶的種類應(yīng)選擇切點(diǎn)位于目的基因兩端的限制酶，如圖甲可選擇Pst。不能選擇切點(diǎn)位于目的基因內(nèi)部的限制酶，如圖甲不能選擇Sma。為避免目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，如圖甲也可選擇用Pst和EcoR兩種限制酶(但要確保質(zhì)粒上也有這兩種酶的切點(diǎn))。(2)根據(jù)質(zhì)粒的特點(diǎn)確定限制酶的種類所選限制酶要與切割目的基因的限制酶一致，以確保具有相同的黏性末端。質(zhì)粒作為載體必須具備標(biāo)記基因等，所以所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu)，如圖乙中限制酶Sma會(huì)破壞標(biāo)記基因。考點(diǎn)二基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1目的基因的獲取(1)目的基因：主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因，也可以是具有調(diào)控作用的因子。(2)獲取方法2基因表達(dá)載體的構(gòu)建(1)構(gòu)建基因表達(dá)載體的目的使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代。使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。(2)基因表達(dá)載體的組成：目的基因、啟動(dòng)子、終止子及標(biāo)記基因等。3目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞受體細(xì)胞類型方法植物細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法、花粉管通道法動(dòng)物細(xì)胞顯微注射技術(shù)(注射到受精卵內(nèi))微生物細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞法(Ca2處理法)4目的基因的檢測(cè)與鑒定檢測(cè)目的檢測(cè)方法判斷標(biāo)準(zhǔn)目的基因是否插入轉(zhuǎn)基因生物的DNADNA分子雜交技術(shù)是否出現(xiàn)雜交帶目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA分子雜交技術(shù)是否出現(xiàn)雜交帶目的基因是否翻譯出蛋白質(zhì)抗原抗體雜交技術(shù)是否出現(xiàn)雜交帶個(gè)體水平的檢測(cè)如抗蟲、抗病的接種實(shí)驗(yàn)是否表現(xiàn)出相應(yīng)的特性基礎(chǔ)自測(cè)1判斷下列敘述的正誤(1)表達(dá)載體的復(fù)制和胰島素基因的表達(dá)均啟動(dòng)于復(fù)制原點(diǎn)()(2)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉植株抗蟲效果的鑒定必須通過分子檢測(cè)()(3)PCR反應(yīng)中溫度的周期性改變是為了DNA聚合酶催化不同的反應(yīng)()(4)抗蟲基因即使成功地插入植物細(xì)胞染色體上也未必能正常表達(dá)() (5)用PCR方法擴(kuò)增目的基因時(shí)不必知道基因的全部序列()(6)PCR體系中一定要添加從受體細(xì)胞中提取的DNA聚合酶()(7)外源DNA必須位于重組質(zhì)粒的啟動(dòng)子和終止子之間才能進(jìn)行復(fù)制()(8)目的基因?qū)腚p子葉植物一般采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法()(9)為培育抗除草劑的作物新品種，導(dǎo)入抗除草劑基因時(shí)只能以受精卵為受體()(10)檢測(cè)目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞可用抗原抗體雜交技術(shù)()2基因表達(dá)載體的組成及各部分的作用(連線)3學(xué)透教材、理清原因、規(guī)范答題用語專練(1)從圖中可以看出，目的基因是_，使用的載體是_，將基因表達(dá)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞的方法是_。(2)請(qǐng)寫出兩種檢測(cè)目的基因是否表達(dá)的方法：_。答案：(1)Bt毒蛋白基因Ti質(zhì)粒農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法(2)抗原抗體雜交法、用棉葉飼喂棉鈴蟲1獲取目的基因的方法比較方法從基因文庫中獲取人工合成從基因組文庫中獲取從部分基因文庫中獲取，如cDNA文庫化學(xué)合成法逆轉(zhuǎn)錄法過程2PCR反應(yīng)的過程過程說明圖解變性溫度上升到90 左右，雙鏈DNA解聚為單鏈復(fù)性溫度下降到55 左右，兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合延伸溫度上升到72 左右，Taq酶從引物起始合成互補(bǔ)鏈，可使新鏈由5端向3端延伸3目的基因檢測(cè)與鑒定的方法對(duì)點(diǎn)落實(shí)1(2018海南高考)甜蛋白是一種高甜度的特殊蛋白質(zhì)。為了改善黃瓜的品質(zhì)，科學(xué)家采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將一種甜蛋白基因成功導(dǎo)入黃瓜細(xì)胞，得到了轉(zhuǎn)基因植株?；卮鹣铝袉栴}：(1)用農(nóng)桿菌感染時(shí)，應(yīng)優(yōu)先選用黃瓜_(填“受傷的”或“完好的”)葉片與含重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，選用這種葉片的理由是_。(2)若在轉(zhuǎn)基因黃瓜中檢測(cè)到這種甜蛋白，則表明該重組質(zhì)粒中_已轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中且能夠表達(dá)；用該轉(zhuǎn)基因黃瓜的某一植株與一株非轉(zhuǎn)基因植株雜交，發(fā)現(xiàn)子代中含甜蛋白個(gè)體數(shù)與不含甜蛋白個(gè)體數(shù)之比為11，則說明甜蛋白基因已經(jīng)整合到_(填“核基因組”“線粒體基因組”或“葉綠體基因組”)中。(3)假設(shè)某種轉(zhuǎn)基因作物因?yàn)槭艿讲《靖腥径鴾p產(chǎn)，若要以該轉(zhuǎn)基因作物為材料獲得脫毒苗，應(yīng)選用_作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)。(4)通常，基因工程操作主要有4個(gè)步驟，即目的基因獲取、重組表達(dá)載體的構(gòu)建、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞、目的基因的檢測(cè)與鑒定。因此，基因工程的含義可概括為_。解析：(1)用農(nóng)桿菌感染時(shí)，應(yīng)優(yōu)先選用黃瓜受傷的葉片與含重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，理由是葉片傷口處的細(xì)胞釋放出大量酚類物質(zhì)，可吸引農(nóng)桿菌移向這些細(xì)胞。(2)若在轉(zhuǎn)基因黃瓜中檢測(cè)到這種甜蛋白，則表明該重組質(zhì)粒中甜蛋白基因已轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中且能夠表達(dá)；用該轉(zhuǎn)基因黃瓜的某一植株與一株非轉(zhuǎn)基因植株雜交，發(fā)現(xiàn)子代中含甜蛋白個(gè)體數(shù)與不含甜蛋白個(gè)體數(shù)之比為11，則說明甜蛋白基因已經(jīng)整合到核基因組中。(3)假設(shè)某種轉(zhuǎn)基因作物因?yàn)槭艿讲《靖腥径鴾p產(chǎn)，若要以該轉(zhuǎn)基因作物為材料獲得脫毒苗，應(yīng)選用莖尖作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)。(4)通常，基因工程操作主要有4個(gè)步驟，即目的基因獲取、重組表達(dá)載體的構(gòu)建、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞、目的基因的檢測(cè)與鑒定。因此，基因工程的含義可概括為按照人們的愿望進(jìn)行設(shè)計(jì)，并通過體外重組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出符合人們需要的新生物類型。答案：(1)受傷的葉片傷口處的細(xì)胞釋放出大量酚類物質(zhì)，可吸引農(nóng)桿菌移向這些細(xì)胞(2)甜蛋白基因核基因組(3)莖尖(4)按照人們的愿望進(jìn)行設(shè)計(jì)，并通過體外重組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出符合人們需要的新生物類型2(2018江蘇高考有改動(dòng))為生產(chǎn)具有特定性能的淀粉酶，研究人員從某種海洋細(xì)菌中克隆了淀粉酶基因(1 656個(gè)堿基對(duì))，利用基因工程大量制備淀粉酶，實(shí)驗(yàn)流程見下圖。請(qǐng)回答下列問題：(1)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增淀粉酶基因前，需先獲得細(xì)菌的_。(2)為了便于擴(kuò)增的DNA片段與表達(dá)載體連接，需在引物的_端加上限制性酶切位點(diǎn)，且常在兩條引物上設(shè)計(jì)加入不同的限制性酶切位點(diǎn)，主要目的是_。(3)進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，反應(yīng)的溫度和時(shí)間需根據(jù)具體情況進(jìn)行設(shè)定，下列選項(xiàng)中_的設(shè)定與引物有關(guān)，_的設(shè)定與擴(kuò)增片段的長度有關(guān)。(填序號(hào))變性溫度退火(復(fù)性)溫度延伸溫度變性時(shí)間退火(復(fù)性)時(shí)間延伸時(shí)間(4)下圖表示篩選獲得的工程菌中編碼淀粉酶的mRNA 的部分堿基序列：圖中虛線框內(nèi)mRNA片段包含_個(gè)密碼子，如虛線框后的序列未知，預(yù)測(cè)虛線框后的第一個(gè)密碼子最多有_種。(5)獲得工程菌表達(dá)的淀粉酶后，為探究影響酶活性的因素，以濃度為1%的可溶性淀粉為底物測(cè)定酶活性，結(jié)果如下：緩沖液50 mmol/L Na2HPO4KH2PO450 mmol/L TrisHCl50 mmol/L GlyNaOHpH6.06.57.07.57.58.08.59.09.09.510.010.5酶相對(duì)活性(%)25.440.249.863.270.195.599.585.368.163.741.520.8根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，初步判斷該淀粉酶活性最高的條件為_。解析：(1)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增淀粉酶基因前，需先獲得細(xì)菌的基因組DNA作為模板，并依據(jù)淀粉酶基因兩端的部分核苷酸序列合成兩條引物。(2)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA時(shí)，只能從3端延伸DNA子鏈，為了便于擴(kuò)增的DNA片段與表達(dá)載體連接，需在引物的5端加上限制性酶切位點(diǎn)，并且要注意在兩條引物上設(shè)計(jì)加入不同的限制性酶切位點(diǎn)，這樣既能防止目的基因、載體的自身連接，又能確保目的基因與表達(dá)載體的定向連接。(3)PCR技術(shù)包括變性、退火(復(fù)性)和延伸三步，變性溫度決定PCR反應(yīng)中雙鏈DNA的解鏈，且時(shí)間很短；退火(復(fù)性)時(shí)引物結(jié)合到互補(bǔ)的DNA單鏈上，退火(復(fù)性)溫度由引物復(fù)性溫度決定，其溫度設(shè)定與引物的長度、堿基組成及濃度等有關(guān)；延伸時(shí)間與產(chǎn)物片段的長度有關(guān)，產(chǎn)物在1 kb以內(nèi)的延伸時(shí)間為1 min左右，34 kb的延伸時(shí)間為34 min。(4)圖中虛線框內(nèi)共含有24個(gè)堿基，mRNA上3個(gè)相鄰的堿基編碼1個(gè)氨基酸，故共包含8個(gè)密碼子。虛線框后的第1個(gè)密碼子的第1個(gè)堿基是U，第2和第3個(gè)堿基各有4種可能性，因此共有16種可能性。題干表明控制淀粉酶的基因有1 656個(gè)堿基對(duì)，說明圖中虛線框后的第1個(gè)密碼子肯定不是終止密碼子(3種終止密碼子為UAA、UAG、UGA)，故虛線框后第1個(gè)密碼子實(shí)際最多可能性有16313(種)。(5)分析表格中的數(shù)據(jù)，酶相對(duì)活性最高為99.5%，對(duì)應(yīng)的條件是pH為8.5，緩沖液為50 mmol/L TrisHCl。答案：(1)基因組DNA(2)5使DNA片段能定向插入表達(dá)載體，減少自連(3)(4)813(5)pH為8.5，緩沖液為50 mmol/L TrisHCl考點(diǎn)三基因工程的應(yīng)用與蛋白質(zhì)工程一、基因工程的應(yīng)用1植物基因工程：培育抗蟲轉(zhuǎn)基因植物、抗病轉(zhuǎn)基因植物和抗逆轉(zhuǎn)基因植物；利用轉(zhuǎn)基因改良植物的品質(zhì)；利用植物生產(chǎn)藥物等。2動(dòng)物基因工程：用于提高動(dòng)物生長速度；用于改善畜產(chǎn)品品質(zhì)；用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)藥物；用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物作器官移植的供體等。3基因工程藥物(1)來源：利用轉(zhuǎn)基因的“工程菌”來生產(chǎn)的藥物。(2)種類：細(xì)胞因子、抗體、疫苗、激素等。4基因治療(1)概念：把正常基因?qū)氩∪梭w內(nèi)，使該基因的表達(dá)產(chǎn)物發(fā)揮功能， 從而達(dá)到治療疾病的目的，這是治療遺傳病的最有效的手段。(2)類型：體外基因治療和體內(nèi)基因治療。二、蛋白質(zhì)工程(1)操作手段：基因修飾或基因合成。(2)結(jié)果：對(duì)現(xiàn)有蛋白質(zhì)進(jìn)行改造或制造出新的蛋白質(zhì)。(3)設(shè)計(jì)流程基礎(chǔ)自測(cè)1判斷下列敘述的正誤(1)將人的干擾素基因重組到質(zhì)粒后導(dǎo)入大腸桿菌，獲得能產(chǎn)生人干擾素的菌株()(2)利用乳腺生物反應(yīng)器能夠獲得一些重要的醫(yī)藥產(chǎn)品，如人的血清白蛋白，這是因?yàn)閷⑷说难灏椎鞍谆驅(qū)肓藙?dòng)物的乳腺細(xì)胞中()(3)由大腸桿菌工程菌獲得人的干擾素后可直接應(yīng)用()(4)蛋白質(zhì)工程的目的是改造或合成人類需要的蛋白質(zhì)()(5)蛋白質(zhì)工程可以合成自然界中不存在的蛋白質(zhì)()(6)蛋白質(zhì)工程是在分子水平上對(duì)蛋白質(zhì)分子直接進(jìn)行操作，定向改變分子的結(jié)構(gòu)()2填寫蛋白質(zhì)工程流程圖中字母代表的含義A轉(zhuǎn)錄，B.翻譯，C.分子設(shè)計(jì)，D.氨基酸序列，E.預(yù)期功能。1體外基因治療與體內(nèi)基因治療的區(qū)別方法比較體外基因治療體內(nèi)基因治療不同點(diǎn)途徑從患者體內(nèi)獲得某種細(xì)胞體外完成基因轉(zhuǎn)移篩選、細(xì)胞擴(kuò)增輸入體內(nèi)直接向患者體內(nèi)組織細(xì)胞中轉(zhuǎn)移基因特點(diǎn)操作復(fù)雜，但效果可靠方法較簡單，但效果難以控制相同點(diǎn)都是將外源基因?qū)氚屑?xì)胞，以糾正缺陷基因，目前兩種方法都處于臨床試驗(yàn)階段2基因治療與基因診斷的比較原理操作過程進(jìn)展基因治療基因表達(dá)利用正?；?qū)胗谢蛉毕莸募?xì)胞中，以表達(dá)出正常性狀來治療(疾病)臨床試驗(yàn)基因診斷堿基互補(bǔ)配對(duì)制作特定DNA探針與病人樣品DNA混合，分析雜交帶情況臨床應(yīng)用3.蛋白質(zhì)工程與基因工程的關(guān)系項(xiàng)目區(qū)別與聯(lián)系蛋白質(zhì)工程基因工程區(qū)別過程預(yù)期蛋白質(zhì)功能設(shè)計(jì)預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)推測(cè)應(yīng)有的氨基酸序列找到相對(duì)應(yīng)的脫氧核苷酸序列獲取目的基因構(gòu)建基因表達(dá)載體將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因的檢測(cè)與鑒定實(shí)質(zhì)定向改造或生產(chǎn)人類所需的蛋白質(zhì)定向改造生物的遺傳特性，以獲得人類所需的類型或生物產(chǎn)品結(jié)果可生產(chǎn)自然界沒有的蛋白質(zhì)只能生產(chǎn)自然界已有的蛋白質(zhì)聯(lián)系蛋白質(zhì)工程是在基因工程基礎(chǔ)上延伸出來的第二代基因工程基因工程中所利用的某些酶需要通過蛋白質(zhì)工程進(jìn)行修飾、改造對(duì)點(diǎn)落實(shí)1(2019大慶質(zhì)檢)鐮刀型細(xì)胞貧血癥是一種單基因遺傳病，患者的血紅蛋白分子肽鏈第6位氨基酸谷氨酸被纈氨酸代替，導(dǎo)致功能異常?；卮鹣铝袉栴}：(1)異常血紅蛋白的氨基酸序列改變的根本原因是編碼血紅蛋白基因的_序列發(fā)生改變。(2)將正常的血紅蛋白基因?qū)牖颊叩墓撬柙煅杉?xì)胞中，可以合成正常的血紅蛋白達(dá)到治療的目的。此操作_(填“屬于”或“不屬于”)蛋白質(zhì)工程，理由是該操作_。(3)用基因工程方法制備血紅蛋白時(shí)，可先提取早期紅細(xì)胞中的_，以其作為模板，在_酶的作用下反(逆)轉(zhuǎn)錄合成cDNA。cDNA與載體需在限制酶和_酶的作用下，構(gòu)建基因表達(dá)載體，導(dǎo)入受體菌后進(jìn)行表達(dá)。(4)檢測(cè)受體菌是否已合成血紅蛋白，可從受體菌中提取_，用相應(yīng)的抗體進(jìn)行_雜交，若出現(xiàn)雜交帶，則表明該受體菌已合成血紅蛋白。解析：(1)編碼血紅蛋白的基因中堿基對(duì)的替換導(dǎo)致編碼的氨基酸種類改變。(2)蛋白質(zhì)工程通過基因修飾或基因合成，實(shí)現(xiàn)對(duì)現(xiàn)有蛋白質(zhì)的改造或制造新蛋白質(zhì)，由于該操作中沒有對(duì)蛋白質(zhì)或基因進(jìn)行改造，因此不屬于蛋白質(zhì)工程。(3)因血紅蛋白基因只在早期紅細(xì)胞中表達(dá)，所以可從其中提取mRNA，以mRNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，反(逆)轉(zhuǎn)錄合成cDNA。構(gòu)建基因表達(dá)載體需要限制酶和DNA連接酶。(4)目的基因是否表達(dá)可以通過從受體菌中提取蛋白質(zhì)，進(jìn)行抗原抗體雜交實(shí)驗(yàn)加以判斷。答案：(1)堿基對(duì)(或脫氧核苷酸)(2)不屬于沒有對(duì)現(xiàn)有的蛋白質(zhì)進(jìn)行改造(或沒有對(duì)基因進(jìn)行修飾)(3)mRNA(或RNA)逆轉(zhuǎn)錄DNA連接(4)蛋白質(zhì)抗原抗體2(2015全國卷)已知生物體內(nèi)有一種蛋白質(zhì)(P)，該蛋白質(zhì)是一種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，由305個(gè)氨基酸組成。如果將P分子中158位的絲氨酸變成亮氨酸，240位的谷氨酰胺變成苯丙氨酸，改變后的蛋白質(zhì)(P1)不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性?；卮鹣铝袉栴}：(1)從上述資料可知，若要改變蛋白質(zhì)的功能，可以考慮對(duì)蛋白質(zhì)的_進(jìn)行改造。(2)以P基因序列為基礎(chǔ)，獲得P1基因的途徑有修飾_基因或合成_基因。所獲得的基因表達(dá)時(shí)是遵循中心法則的，中心法則的全部內(nèi)容包括_的復(fù)制，以及遺傳信息在不同分子之間的流動(dòng)，即：_。(3)蛋白質(zhì)工程也被稱為第二代基因工程，其基本途徑是從預(yù)期蛋白質(zhì)功能出發(fā)，通過_和_，進(jìn)而確定相對(duì)應(yīng)的脫氧核苷酸序列，據(jù)此獲得基因，再經(jīng)表達(dá)、純化獲得蛋白質(zhì)，之后還需要對(duì)蛋白質(zhì)的生物_進(jìn)行鑒定。解析：(1)從題中所述資料可知，將P分子中158位的絲氨酸變成亮氨酸，240位的谷氨酰胺變成苯丙氨酸后，該蛋白質(zhì)的功能發(fā)生了改變，此過程是通過對(duì)構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸的排列順序進(jìn)行改造，進(jìn)而改變了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，從而改變了蛋白質(zhì)的功能。(2)在蛋白質(zhì)工程中，目的基因可以以P基因序列為基礎(chǔ)，對(duì)生物體內(nèi)原有P基因進(jìn)行修飾，也可以通過人工合成法合成新的P1基因。中心法則的內(nèi)容如下圖所示：由圖可知，中心法則的全部內(nèi)容包括：DNA以自身為模板進(jìn)行的復(fù)制，DNA通過轉(zhuǎn)錄將遺傳信息傳遞給RNA，最后RNA通過翻譯將遺傳信息表達(dá)成蛋白質(zhì)；在某些病毒中RNA可自我復(fù)制(如煙草花葉病毒)，在某些病毒中能以RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成DNA(如HIV)，這是對(duì)中心法則的補(bǔ)充。(3)蛋白質(zhì)工程的基本途徑是預(yù)期蛋白質(zhì)功能設(shè)計(jì)預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)推測(cè)應(yīng)有的氨基酸序列合成DNA表達(dá)出蛋白質(zhì)，經(jīng)過該過程得到的蛋白質(zhì)，需要對(duì)其生物功能進(jìn)行鑒定，以保證其發(fā)揮正常作用。答案：(1)氨基酸序列(或結(jié)構(gòu))(其他合理答案也可)(2)PP1DNA和RNA(或遺傳物質(zhì))DNARNA、RNADNA、RNA蛋白質(zhì)(或轉(zhuǎn)錄、逆轉(zhuǎn)錄、翻譯)(3)設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)推測(cè)氨基酸序列功能考點(diǎn)四DNA的粗提取與鑒定1實(shí)驗(yàn)原理(1)提取原理DNA和蛋白質(zhì)等其他成分在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同。 DNA對(duì)酶、高溫和洗滌劑的耐受性。DNA不溶于酒精溶液。(2)鑒定原理： DNA二苯胺試劑藍(lán)色。2實(shí)驗(yàn)流程 基礎(chǔ)自測(cè)1判斷下列敘述的正誤(1)用兔的成熟紅細(xì)胞可提取DNA()(2)進(jìn)行DNA粗提取和鑒定實(shí)驗(yàn)時(shí)，加入洗滌劑后用力進(jìn)行快速、充分地研磨()(3)洗滌劑能瓦解細(xì)胞膜并增加DNA在NaCl溶液中的溶解度()(4)在溶有DNA的 NaCl溶液中，加入二苯胺試劑即呈藍(lán)色()(5)在DNA的粗提取與鑒定實(shí)驗(yàn)中，用菜花替代雞血作為實(shí)驗(yàn)材料，其實(shí)驗(yàn)操作步驟相同()(6)實(shí)驗(yàn)中兩次使用蒸餾水的目的不同()2學(xué)透教材、理清原因、規(guī)范答題用語專練(1)分析DNA在NaCl溶液中的溶解度曲線，思考如何通過控制NaCl溶液的濃度將DNA與蛋白質(zhì)等雜質(zhì)分離。提示：NaCl溶液濃度為2 mol/L時(shí)，DNA溶解，而部分蛋白質(zhì)發(fā)生鹽析生成沉淀，通過過濾可除去部分蛋白質(zhì)及不溶于NaCl溶液的雜質(zhì)。當(dāng)NaCl溶液稀釋至0.14 mol/L時(shí)，DNA析出，過濾可除去溶于NaCl溶液中的部分蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)。(2)下圖為“DNA粗提取和鑒定”實(shí)驗(yàn)的相關(guān)操作，請(qǐng)仔細(xì)觀察并分析操作的目的分別是什么？_；_；_；_。提示：是使雞血細(xì)胞吸水漲破釋放出核物質(zhì)是析出DNA，去除溶于酒精的雜質(zhì)是使DNA溶解在2 mol/L NaCl溶液中是稀釋NaCl溶液使其濃度接近0.14 mol/L，去除溶于低濃度NaCl溶液的雜質(zhì)1DNA與蛋白質(zhì)在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同溶解規(guī)律2 mol/L NaCl溶液0.14 mol/L NaCl溶液DNA溶解析出蛋白質(zhì)NaCl溶液物質(zhì)的量濃度從2 mol/L逐漸降低的過程中，溶解度逐漸增大部分發(fā)生鹽析沉淀溶解2DNA粗提取與鑒定實(shí)驗(yàn)中的“2、4、4”加蒸餾水2次加到雞血細(xì)胞液中，使血細(xì)胞吸收水破裂；加到含DNA的2 mol/L的NaCl溶液中，使NaCl溶液的物質(zhì)的量濃度下降到0.14 mol/L，使DNA析出用紗布過濾4次過濾血細(xì)胞破裂液，得到含細(xì)胞核物質(zhì)的濾液；過濾溶有DNA的2 mol/L的NaCl溶液；濾取0.14 mol/L的NaCl溶液中析出的DNA(黏稠物)；再次過濾溶有DNA的2 mol/L的NaCl溶液用NaCl溶液4次加2 mol/L的NaCl溶液，溶解提取的細(xì)胞核物質(zhì)；用0.14 mol/L的NaCl溶液使DNA析出；用2 mol/L的NaCl溶液，溶解濾取的DNA黏稠物；用2 mol/L的NaCl溶液，溶解絲狀物用于鑒定DNA3注意事項(xiàng)(1)本實(shí)驗(yàn)不能用哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞作實(shí)驗(yàn)材料，原因是哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞無細(xì)胞核(無DNA)?？蛇x用雞血細(xì)胞作材料。(2)加入洗滌劑后，動(dòng)作要輕緩、柔和，否則容易產(chǎn)生大量的泡沫。加入酒精和用玻璃棒攪拌時(shí)，動(dòng)作要輕緩，以免加劇DNA分子的斷裂，導(dǎo)致DNA分子不能形成絮狀沉淀。(3)二苯胺試劑要現(xiàn)配現(xiàn)用，否則會(huì)影響鑒定的效果。(4)提取植物細(xì)胞的DNA時(shí)，加入的洗滌劑能溶解細(xì)胞膜，有利于DNA的釋放；加入食鹽(主要成分是NaCl)的目的是溶解DNA。(5)在DNA進(jìn)一步提純時(shí)，選用冷卻的95%的酒精的作用是溶解雜質(zhì)和析出DNA。對(duì)點(diǎn)落實(shí)1(2019南通模擬)對(duì)利用雞血進(jìn)行“DNA的粗提取與鑒定”的實(shí)驗(yàn)，下列敘述正確的是()A用蒸餾水將NaCl溶液濃度調(diào)至0.14 mol/L，濾去析出物B可用木瓜蛋白酶純化過濾后研磨液中的DNAC由于DNA對(duì)高溫耐受性較差，故需向DNA濾液中加入冷酒精D將絲狀物溶解在2 mol/L NaCl溶液中，加入二苯胺試劑即呈藍(lán)色解析：選BDNA在濃度為0.14 mol/L NaCl溶液中的溶解度最低，因此用蒸餾水將NaCl溶液濃度調(diào)至0.14 mol/L時(shí)，DNA析出，應(yīng)該去除濾液；木瓜蛋白酶能分解蛋白質(zhì)，但不能分解DNA，因此可用木瓜蛋白酶純化過濾后研磨液中的DNA；由于DNA不溶于酒精，蛋白質(zhì)溶于酒精，因此可向DNA濾液中加入冷酒精以進(jìn)一步純化DNA；將絲狀物溶解在2 mol/L NaCl溶液中，加入二苯胺試劑后要經(jīng)過沸水浴才能呈現(xiàn)藍(lán)色。2圖1、2分別為“DNA的粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)中部分操作步驟示意圖，下列敘述錯(cuò)誤的是() A圖1、2中加入蒸餾水稀釋的目的相同 B圖1中完成過濾之后保留濾液C圖2中完成過濾之后棄去濾液D在圖1雞血細(xì)胞液中加入少許嫩肉粉有助于去除雜質(zhì)解析：選A圖1中加入蒸餾水的目的是使雞血細(xì)胞吸水漲破，圖2中加入蒸餾水的目的是稀釋NaCl溶液，使DNA析出；圖1中加入蒸餾水后，DNA存在于濾液中；圖2中加入蒸餾水后，NaCl溶液濃度降低，DNA析出，所以棄去濾液；嫩肉粉主要成分是蛋白酶，雞血細(xì)胞液中加入少許嫩肉粉可將蛋白質(zhì)水解成小分子肽或氨基酸，有利于除去蛋白質(zhì)。 課堂一刻鐘 1(2018北京高考)用Xho 和Sal 兩種限制性核酸內(nèi)切酶同一DNA片段，酶切位點(diǎn)及酶切產(chǎn)物分離結(jié)果如圖。以下敘述不正確的是()易錯(cuò)探因?qū)忣}不細(xì)解答本小題可因?qū)忣}不細(xì)致，誤認(rèn)為是Xho和Sal兩種限制酶同時(shí)作用于DNA片段，而不能得出正確答案。這要求學(xué)生在平時(shí)的練習(xí)中養(yǎng)成仔細(xì)審題的習(xí)慣，必要時(shí)可在關(guān)鍵部位進(jìn)行標(biāo)注。 A圖1中兩種酶識(shí)別的核苷酸序列不同B圖2中酶切產(chǎn)物可用于構(gòu)建重組DNAC泳道中是用Sal處理得到的酶切產(chǎn)物D圖中被酶切的DNA片段是單鏈DNA解析：選D通過圖1可知，兩種限制性核酸內(nèi)切酶切割DNA分子的不同部位，說明兩種限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別的核苷酸序列不同；圖2中的酶切產(chǎn)物是DNA分子片段，可用于構(gòu)建重組DNA；觀察圖1可知，該DNA片段有3個(gè)Sal酶切位點(diǎn)，故用Sal處理后，可形成4個(gè)DNA分子片段，電泳后出現(xiàn)4條電泳帶，與電泳條帶對(duì)應(yīng)；限制性核酸內(nèi)切酶作用的是雙鏈DNA片段，因此圖中被酶切的DNA片段應(yīng)是雙鏈DNA。2(2017北京高考)為了增加菊花花色類型，研究者從其他植物中克隆出花色基因C(圖1)，擬將其與質(zhì)粒(圖2)重組，再借助農(nóng)桿菌導(dǎo)入菊花中。下列操作與實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟环氖?)A用限制性核酸內(nèi)切酶EcoR和連接酶構(gòu)建重組質(zhì)粒B用含C基因的農(nóng)桿菌侵染菊花愈傷組織，將C基因?qū)爰?xì)胞C在培養(yǎng)基中添加卡那霉素，篩選被轉(zhuǎn)化的菊花細(xì)胞D用分子雜交方法檢測(cè)C基因是否整合到菊花染色體上解析：選C目的基因C和質(zhì)粒都有可被EcoR切割的酶切位點(diǎn)，另外需要DNA連接酶將切好的目的基因和質(zhì)粒連接起來；愈傷組織全能性較高，是理想的植物受體細(xì)胞，將目的基因?qū)胫参锸荏w細(xì)胞的方法通常為農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法；質(zhì)粒中含有潮霉素抗性基因，因此選擇培養(yǎng)基中應(yīng)該加入潮霉素；使用分子雜交方法可檢測(cè)目的基因是否整合到受體染色體上。3(2018江蘇高考)，下列敘述正確的是()A在甘蔗莖的組織樣液中加入雙縮脲試劑，溫水浴后液體由藍(lán)色變成磚紅色B在大豆種子勻漿液中加入斐林試劑，液體由藍(lán)色變成紫色C提取DNA時(shí)，在切碎的洋蔥中加入適量洗滌劑和食鹽，充分研磨，過濾并棄去濾液D將DNA粗提物溶解在2 mol/L NaCl溶液中，加入二苯胺試劑，沸水浴后液體由無色變成藍(lán)色解題關(guān)鍵歸納整合本題綜合了必修還原糖和蛋白質(zhì)的鑒定與選修D(zhuǎn)NA的提取與鑒定的相關(guān)實(shí)驗(yàn)的原理與步驟，意在考查考生的歸納整合和辨別能力。這也啟示我們?cè)趶?fù)習(xí)選修內(nèi)容時(shí)要注意與必修部分的知識(shí)相聯(lián)系，多進(jìn)行歸納整合。 解析：選D甘蔗莖的組織樣液中含有大量的蔗糖，蔗糖屬于非還原糖，與斐林試劑在5065 的水浴加熱條件下不會(huì)產(chǎn)生磚紅色沉淀；大豆種子的勻漿液中含有大量的蛋白質(zhì)，鑒定蛋白質(zhì)時(shí)應(yīng)使用雙縮脲試劑，雙縮脲試劑在常溫下能與蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，生成紫色的絡(luò)合物；提取DNA時(shí)，在切碎的洋蔥中加入適量的洗滌劑和食鹽，進(jìn)行充分地研磨，過濾后收集濾液；在沸水浴條件下，DNA與二苯胺試劑反應(yīng)呈現(xiàn)藍(lán)色。4(2014江蘇高考)下列，錯(cuò)誤的是()A酵母和菜花均可作為提取DNA的材料BDNA既溶于2 mol/L NaCl溶液也溶于蒸餾水C向雞血細(xì)胞液中加蒸餾水?dāng)嚢?，可見玻棒上有白色絮狀物DDNA溶液加入二苯胺試劑沸水浴加熱，冷卻后變藍(lán)易錯(cuò)探因知識(shí)不全本題考查對(duì)“DNA的粗提取和鑒定”實(shí)驗(yàn)的原理、實(shí)驗(yàn)材料的選擇、實(shí)驗(yàn)采用的試劑及試劑的作用等的記憶，需要考生識(shí)記的細(xì)節(jié)較多，考生在平時(shí)的學(xué)習(xí)過程中要注意積累。 解析：選C原則上含DNA的生物材料都可用來提取DNA，只是選用DNA含量高的生物組織，成功的可能性更大；DNA在2 mol/L NaCl溶液和蒸餾水中溶解度都較大；向雞血細(xì)胞液中加蒸餾水?dāng)嚢瑁u血細(xì)胞會(huì)吸水破裂，但在蒸餾水中不會(huì)析出DNA；DNA溶液加入二苯胺試劑后需沸水浴加熱，待冷卻后溶液變藍(lán)。5(2018全國卷)回答下列問題：(1)博耶(H.Boyer)和科恩(S.Cohen)將非洲爪蟾核糖體蛋白基因與質(zhì)粒重組后導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞中進(jìn)行了表達(dá)。該研究除證明了質(zhì)?？梢宰鳛檩d體外，還證明了_(答出兩點(diǎn)即可)。(2)體外重組的質(zhì)?？赏ㄟ^Ca2參與的_方法導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞；而體外重組的噬菌體DNA通常需與_組裝成完整噬菌體后，才能通過侵染的方法將重組的噬菌體DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞。在細(xì)菌、心肌細(xì)胞、葉肉細(xì)胞中，可作為重組噬菌體宿主細(xì)胞的是_。(3)真核生物基因(目的基因)在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)，表達(dá)出的蛋白質(zhì)可能會(huì)被降解。，在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)選用_的大腸桿菌作為受體細(xì)胞，在蛋白質(zhì)純化的過程中應(yīng)添加_的抑制劑。解題關(guān)鍵信息獲取解答本小題應(yīng)先根據(jù)“蛋白質(zhì)會(huì)被降解”的信息，再根據(jù)酶的專一性原理可推測(cè)大腸桿菌體內(nèi)含有分解該蛋白質(zhì)的酶，以此作為突破口即可成功解答本小題。 解析：(1)將非洲爪蟾核糖體蛋白基因與質(zhì)粒重組后導(dǎo)入大腸桿菌中，該過程利用的技術(shù)是轉(zhuǎn)基因技術(shù)。該研究除了證明質(zhì)粒可作為載體外，還證明了體外重組的質(zhì)?？梢赃M(jìn)入受體細(xì)胞，真核生物的基因可在原核細(xì)胞中表達(dá)等。(2)重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞可采用Ca2參與的轉(zhuǎn)化方法；體外重組噬菌體要通過將體外重組的噬菌體DNA和外殼蛋白(或噬菌體蛋白)進(jìn)行組裝獲得；因?yàn)槭删w是專門寄生在細(xì)菌中的病毒，所以宿主細(xì)胞應(yīng)選用細(xì)菌。(3)為防止蛋白質(zhì)被降解，在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)選用蛋白酶缺陷型的大腸桿菌作為受體細(xì)胞；在蛋白質(zhì)純化過程中，為防止目的蛋白質(zhì)被降解，需要添加蛋白酶的抑制劑。答案：(1)體外重組的質(zhì)?？梢赃M(jìn)入受體細(xì)胞；真核生物基因可在原核細(xì)胞中表達(dá)(2)轉(zhuǎn)化外殼蛋白(或答噬菌體蛋白)細(xì)菌(3)蛋白酶缺陷型蛋白酶6(2018全國卷)某種熒光蛋白(GFP)在紫外光或藍(lán)光激發(fā)下會(huì)發(fā)出綠色熒光，這一特性可用于檢測(cè)細(xì)胞中目的基因的表達(dá)。某科研團(tuán)隊(duì)甲)，并將其插入質(zhì)粒P0，構(gòu)建了真核表達(dá)載體P1，其部分結(jié)解題關(guān)鍵信息獲取本題結(jié)合新情景、新材料考查考生從題干及題圖中獲取信息的能力。在解答此類問題時(shí)應(yīng)注重信息獲取和結(jié)合已有的知識(shí)理解、應(yīng)用信息。 回答下列問題：(1)據(jù)圖推斷，該團(tuán)隊(duì)在將甲插入質(zhì)粒P0時(shí)，使用了兩種限制酶，這兩種酶是_。使用這兩種酶進(jìn)行酶切是為了保證_，也是為了保證_。(2)將P1轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)的牛皮膚細(xì)胞后，若在該細(xì)胞中觀察到了綠色熒光，則說明L1基因在牛的皮膚細(xì)胞中完成了_和_過程。(3)為了獲得含有甲的牛，該團(tuán)隊(duì)需要做的工作包括：將能夠產(chǎn)生綠色熒光細(xì)胞的_移入牛的_中、體外培養(yǎng)、胚胎移植等。(4)為了檢測(cè)甲是否存在于克隆牛的不同組織細(xì)胞中，某同學(xué)用PCR方法進(jìn)行鑒定，在鑒定時(shí)應(yīng)分別以該牛不同組織細(xì)胞中的_(填“mRNA”“總RNA”或“核DNA”)作為PCR模板。解析：(1)由題意可知，L1基因和GFP基因形成了L1GFP融合基因(簡稱為甲)，題圖中顯示了四個(gè)酶切位點(diǎn)，當(dāng)將L1GFP融合基因插入質(zhì)粒P0時(shí)，可用E1和E4限制酶進(jìn)行酶切，用這兩種酶進(jìn)行酶切不會(huì)破壞甲的完整性，同時(shí)能保證甲按照正確的方向與載體連接。(2)若在牛皮膚細(xì)胞中觀察到了綠色熒光，則說明L1GFP融合基因得到表達(dá)，即目的基因在受體細(xì)胞中通過轉(zhuǎn)錄和翻譯合成了熒光蛋白。(3)為了獲得含有甲的牛，可將含有目的基因的細(xì)胞的細(xì)胞核移入牛的去核卵母細(xì)胞中，然后進(jìn)行體外培養(yǎng)、胚胎移植等。(4)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因，可以檢測(cè)目的基因是否存在，PCR擴(kuò)增的模板是DNA。答案：(1)E1和E4甲的完整甲與載體正確連接(2)轉(zhuǎn)錄翻譯(3)細(xì)胞核去核卵母細(xì)胞(4)核DNA7(2017江蘇高考)金屬硫蛋白(MT)是一類廣泛存在的金屬結(jié)合蛋白，某研究小組計(jì)劃通過多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增獲得目的基因，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因工程菌，用于重金屬廢水的凈化處理。PCR擴(kuò)增過程示意圖如下，請(qǐng)回答下列問題：(1)從高表達(dá)MT蛋白的生物組織中提取mRNA，通過_獲得_用于PCR擴(kuò)增。(2)設(shè)計(jì)一對(duì)與MT基因兩端序列互補(bǔ)配對(duì)的引物(引物1和引物2)，為方便構(gòu)建重組質(zhì)粒，在引物中需要增加適當(dāng)?shù)腳位點(diǎn)。設(shè)計(jì)引物時(shí)需要避免引物之間形成_，而造成引物自連。(3)圖中步驟1代表_，步驟2代表退火(復(fù)性)，步驟3代表延伸，這三個(gè)步驟組成一輪循環(huán)。(4)PCR擴(kuò)增時(shí)，退火(復(fù)性)溫度的設(shè)定是成敗的關(guān)鍵。退火溫度過高會(huì)破壞_的堿基配對(duì)。退火(復(fù)性)溫度的設(shè)定與引物長度、堿基組成有關(guān)，長度相同但_的引物需要設(shè)定更高的退火(復(fù)性)溫度。(5)如果PCR反應(yīng)得不到任何擴(kuò)增產(chǎn)物，則可以采取的改進(jìn)措施有_填序號(hào)：升高退火(復(fù)性)溫度降低退火(復(fù)性)溫度重新設(shè)計(jì)引物。解題關(guān)鍵理解應(yīng)用本題主要考查PCR技術(shù)的相關(guān)知識(shí)，要求考生理解PCR的具體過程，以及引物的作用，學(xué)會(huì)分析引物或溫度改變對(duì)PCR結(jié)果的影響。解析：(1)PCR技術(shù)可在體外對(duì)DNA進(jìn)行擴(kuò)增，模板可以是mRNA經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA。(2)設(shè)計(jì)一對(duì)與MT基因兩端序列互補(bǔ)配對(duì)的引物(引物1和引物2)時(shí)，需在引物中增加適當(dāng)?shù)南拗菩院怂醿?nèi)切酶的識(shí)別序列，便于目的基因與質(zhì)粒的連接。為了避免引物自連，設(shè)計(jì)引物時(shí)需要避免引物之間形成堿基互補(bǔ)配對(duì)。(3)根據(jù)PCR的過程可知，圖中步驟1為變性，步驟2為退火(復(fù)性)，步驟3為延伸，這三個(gè)步驟構(gòu)成一個(gè)循環(huán)。(4)退火(復(fù)性)溫度的設(shè)定與引物長度、堿基組成有關(guān)，過高的退火(復(fù)性)溫度會(huì)破壞引物與模板的堿基配對(duì)。因G、C之間的氫鍵數(shù)多于A、T之間的氫鍵數(shù)，故GC含量高的引物需要設(shè)定更高的退火(復(fù)性)溫度。(5)如果PCR反應(yīng)得不到任何擴(kuò)增產(chǎn)物，可能的原因是退火(復(fù)性)溫度過高使擴(kuò)增效率降低，也可能是未按照目的基因兩端的核苷酸序列來設(shè)計(jì)引物，因此可以采取的措施是降低退火(復(fù)性)溫度、重新設(shè)計(jì)引物等。答案：(1)逆轉(zhuǎn)錄cDNA(2)限制性核酸內(nèi)切酶堿基互補(bǔ)配對(duì)(3)變性(4)引物與模板GC含量高(5)學(xué)情考情了然于胸一、明考情知能力找準(zhǔn)努力方向考查知識(shí)1.基因工程三種操作工具的特點(diǎn)及作用、基因工程的基本操作程序是常規(guī)考點(diǎn)，難度一般。2.獲取目的基因的方法、限制酶的選擇及基因表達(dá)載體的構(gòu)建是高頻考點(diǎn)，也是難點(diǎn)、易錯(cuò)點(diǎn)。3.DNA的粗提取與鑒定。考查能力1.識(shí)記能力：主要考查對(duì)基因工程操作工具的種類、作用和特點(diǎn)及基本操作程序等的記憶。2.讀圖能力：如限制酶的選擇及基因表達(dá)載體的構(gòu)建常以圖示為載體進(jìn)行考查。3.實(shí)驗(yàn)操作能力：DNA的粗提取的原理、方法、操作步驟等。4.綜合應(yīng)用能力：如第3、4、5題，考查考生綜合運(yùn)用基因工程的相關(guān)知識(shí)解決相關(guān)生物學(xué)問題的能力。二、記要點(diǎn)背術(shù)語匯總本節(jié)重點(diǎn)1DNA重組技術(shù)的基本工具(1)基因工程操作的基本工具有限制性核酸內(nèi)切酶、DNA連接酶和使目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體。(2)限制酶具有特異性，即一種限制酶只能識(shí)別DNA分子中某種特定的堿基序列，并在特定的位點(diǎn)上進(jìn)行切割。(3)Ecoli DNA連接酶只能連接黏性末端，而T4DNA連接酶既能連接黏性末端也能連接平末端。(4)質(zhì)粒是基因工程常用的