士別三日，看HPLC填料中的表面多孔顆粒 從上世紀(jì)60年代發(fā)展起來的HPLC填料算起，表面多孔顆粒（superficially porous particle，以下簡(jiǎn)稱SPP）已有40多年的歷史了。但是在最近，這種擁有堅(jiān)固粒核和表面薄層多孔結(jié)構(gòu)的填料又重新獲得長(zhǎng)足發(fā)展-粒徑低于3m（sub-3 m，以下簡(jiǎn)稱亞-3m）的表面多孔顆粒相比起粒徑低于2m（sub-2 m，以下簡(jiǎn)稱亞-2m）的全多孔顆粒，具有更好的柱效，但是壓降只有后者的一半。這次“色譜柱觀察”專欄就是要跟蹤報(bào)道SPP相關(guān)產(chǎn)品（近來一般被稱作核殼core shell 、熔融核心 fused core 、多孔外殼porous shell填料）是如何在與之前超高壓液相（ultrahigh-pressure liquid chromatography，以下簡(jiǎn)稱UHPLC）相關(guān)產(chǎn)品的競(jìng)爭(zhēng)中士別三日，穎脫而出，并應(yīng)用于大、小分子分離的。 在傳統(tǒng)的液相色譜與高效液相色譜（high performance liquid chromatography，以下簡(jiǎn)稱HPLC）中，全多孔填料諸如硅膠、氧化鋁、離子交換樹脂被廣泛應(yīng)用。這些填料所以行之有效，關(guān)鍵在于它們有高的表面積、樣品容量、不錯(cuò)的保留時(shí)間，而且還能鍵合不同的有機(jī)官能團(tuán)。 在上世紀(jì)60年代早期，我們現(xiàn)在所認(rèn)識(shí)的HPLC在那時(shí)還沒出現(xiàn)。研究人員雖然從理論上預(yù)言液相色譜能變得更加高效，但是并沒有多少實(shí)際工作去證明這點(diǎn)。彼時(shí)，大部分的色譜工作者使用粒徑超過100m的多孔顆粒做填料，開口玻璃柱做色譜柱。這些填料主要是通過用不同孔徑的篩網(wǎng)過濾不規(guī)則顆粒分類得來的。色譜工作者利用液體自身的重力來使流動(dòng)相通過玻璃柱，在柱子出口收集目標(biāo)物，再把收集到的流出物進(jìn)行離線分析，比如紫外-可見光光譜分析。用今天的標(biāo)準(zhǔn)來看，這些色譜圖的峰型是非常難看的。即使通過加壓提高流動(dòng)相的速度，也只能得到更加寬的峰型，因?yàn)楸粶y(cè)物在這些多孔填料中的吸附、解吸太慢了。為此必須做些事去提高色譜分離的速度，比如降低填料上微孔的深度、縮短物質(zhì)的遷移路徑，又或者提高物質(zhì)的遷移速率。早期的SPPs Purnell,Golay和Knox三人的理論還有氣相色譜上的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)催生了Horvath教授的論文，其預(yù)言使用堅(jiān)硬物質(zhì)做核心，粒核外面再覆蓋一層薄薄的多孔固體作為固定相能提高物質(zhì)的遷移速率。Horvath與其同事最先發(fā)布這種叫多孔層珠（porous layer bead ，簡(jiǎn)稱PLB，可以看作其是有一層薄膜或表面多孔的顆粒，即SPP）的填料，并把它用于核苷酸的離子交換色譜分離。這種SPP填料以玻璃作為顆粒的核心，外面覆蓋著一層薄薄的聚苯乙烯-二乙烯苯聚合樹脂，樹脂上再鍵合陰離子交換官能團(tuán)。圖1展示了其與之前的大孔顆粒的不同。圖1a是早期使用的典型大多孔顆粒。當(dāng)物質(zhì)進(jìn)入柱子，其會(huì)擴(kuò)散到這些顆粒的孔中（流經(jīng)柱子的過程其實(shí)就是上百萬次反復(fù)吸附、解吸的過程），由于進(jìn)出粘滯流動(dòng)相時(shí)的擴(kuò)散速度慢，這需要耗去相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間，也就是說物質(zhì)需要很長(zhǎng)的時(shí)間才能被洗出。緩慢的物質(zhì)遷移速率是色譜圖中峰型變寬的原因。當(dāng)然，通過提高色譜柱的使用溫度可以降低流動(dòng)相的粘度，但是這只能帶來小許的改善而且在當(dāng)時(shí)也顯得不大方便使用。圖1b展示了SPP的原理。直徑40m 圖1 的球形玻璃珠被用作基體，球體的外面覆蓋了一層薄薄的離子交換樹脂、硅膠或者表面孔隙度控制在某個(gè)范圍的小珠（controlled surface porosity beads）。這外層一般有12m厚。當(dāng)物質(zhì)進(jìn)入色譜柱，擴(kuò)散到SPP顆粒填料中時(shí)，其擴(kuò)散路徑由此被限制在一個(gè)較窄的范圍內(nèi)。通過縮短填料中的孔隙深度，SPP填料縮短了物質(zhì)在粘滯流動(dòng)相中的擴(kuò)散路徑。這時(shí)擴(kuò)散只能在填料的表面薄層上進(jìn)行，物質(zhì)在兩相間的遷移速率就會(huì)大大提高。從這里我們可以看到，表面薄層越薄，物質(zhì)遷移速率越高，柱效就會(huì)越好。當(dāng)然，表面薄層變薄，容量因子（capacity factor，表現(xiàn)為柱子的柱保留 retention）與樣品容量(sample loading)就會(huì)變低。因此需要在薄層厚度與容量之間取得平衡點(diǎn)。 相比早期LC用到的大孔顆粒，SPPs填料能使得分離速度更快（只需2030min，而前者往往需要幾小時(shí)），分離效果更好（理論塔板高度為12mm），檢測(cè)靈敏度更高。用戶通過簡(jiǎn)單的機(jī)械振動(dòng)，就能把SPPs填料干法裝填到50cm與1m的不銹鋼柱子內(nèi)。許多化學(xué)基團(tuán)被嘗試鍵合到薄層上，用于不同的色譜分離，比如正相、反相、離子交換色譜。在70年代早期，許多色譜分離方法的成功開發(fā)正是得益于SPP柱子的應(yīng)用。 60年代末70年代初 SPPs填料的商業(yè)化，以及在線紫外檢測(cè)器的出現(xiàn)大大促進(jìn)了HPLC的發(fā)展。但是，稍后出現(xiàn)的微型全多孔硅膠顆粒在大小、裝填上取得的突破性進(jìn)展，柱效由此得到很大的提高，這也導(dǎo)致了早期的SPPs填料慢慢變得銷聲匿跡。圖1c展示的微型全多孔填料改善了物質(zhì)的遷移，從而使得柱效提高了至少一個(gè)數(shù)量級(jí)。除此以外，更小的多孔顆粒也預(yù)示著更大的表面積，這使得其能比SPPs填料容納更多的樣品量。這些填料也能用于制備色譜以及為取得更好的檢出限而采用的大進(jìn)樣模式。 在之后的幾十年中，雖然為了解決某些特殊的分離任務(wù)，有一些新的SPPs填料得以再現(xiàn)，但不得不承認(rèn)，70年代曾大行其道的SPPs填料已從80年代初開始讓位給了微型全多孔填料，其應(yīng)用也只限于一些驗(yàn)證過的舊方法或者保護(hù)柱中易于裝填的填料。 現(xiàn)代的SPPs 對(duì)比直徑40m的前輩，現(xiàn)在的SPPs填料明顯苗條多了-直徑5.0m，薄層厚度0.25m，孔徑300。顆粒的核心由玻璃珠變成堅(jiān)固的二氧化硅，在其上面覆蓋的是一層薄薄的納米顆粒。這種SPP色譜柱被推薦用于生物大分子，比如蛋白質(zhì)的快速分離。生物大分子的擴(kuò)散系數(shù)大約只有普通小分子的1/10。SPP填料上的薄層能使得這些擴(kuò)散緩慢的蛋白子分子 圖2只能在較窄的范圍內(nèi)滲透（堅(jiān)硬的核心阻止了其繼續(xù)往前擴(kuò)散）。對(duì)比同樣大小的全多孔顆粒，SPP具有較快的物質(zhì)遷移速率，同時(shí)能在不損失太多柱效的前提下使用較高的流速。在圖2a與圖2b中，展示了5m粒徑的全多孔填料與5m的SPP填料。對(duì)于前者，假設(shè)物質(zhì)分子擴(kuò)散到顆粒的中心位置，然后再返回，整個(gè)遷移路徑約為5m（進(jìn)出分別為2.5m）。由于生物大分子的遷移是十分緩慢的，這會(huì)導(dǎo)致峰型的變寬，這在需要提高流速的快速分離上就顯得更加明顯。 圖2b是同樣粒徑的SPP填料，由于蛋白質(zhì)分子只需在顆粒外面的薄層進(jìn)行擴(kuò)散，其整個(gè)遷移路徑只有0.5m（進(jìn)出分別為0.25m）。這距離只有前面全多孔顆粒的1/10，所以擴(kuò)散的時(shí)間大大縮短，峰型變得更尖銳。即使是在高流速下，峰寬仍然比全多孔顆粒的填料窄。 從圖3a、b的色譜圖比較可以看出兩者的區(qū)別。這里分別對(duì)一組蛋白質(zhì)：lysozyme與myoglobin在752.1mm色譜柱中進(jìn)行高流速色譜分離。圖3a用的是大孔徑（300 ）的全多孔硅膠填料，圖3b所用的是大孔徑（300 ）的SPPs填料。對(duì)于蛋白質(zhì)的分離，一般采用梯度分離。因?yàn)槿绻褂玫榷确蛛x，采用不同填料造成的柱效差異會(huì)更大。在梯度分離時(shí)，SPP填料的柱子由于具有更快的物質(zhì)遷移速率，所以峰型比全多孔 圖3 填料的柱子明顯尖銳。在SPP填料的柱柱溫：70，波長(zhǎng)：210nm:峰1: lysozyme, 峰2： myoglobin. 子分離中，我們能輕易觀察到蛋白質(zhì) lysozyme ，即峰1前面有一個(gè)不完全分離的雜質(zhì)峰。這里，我們把兩種不同填料的柱子對(duì)應(yīng)的譜圖在不同流速下做了平行比較。同時(shí)，當(dāng)流速提高，兩者的保留時(shí)間皆有縮短，梯度時(shí)間也不得不做相應(yīng)調(diào)整。 為了更好描述SPP填料的分離效率，圖4展示了八種蛋白質(zhì)在2.1mm直徑柱子中的快速梯度分離，這過程不過僅僅耗時(shí)0.75min。 圖4粒徑低于3m的SPP 之前我們已經(jīng)提及孔徑為300 的SPP填料適用于大分子的快速分離。而近來亞-2m（1.51.9m）填料的發(fā)展也使得小分子的快速分離得以實(shí)現(xiàn)?，F(xiàn)在，裝填了亞-2m填料的50mm短柱，其分離時(shí)間已少于1min，同時(shí)較長(zhǎng)的柱子（大于150mm）也已具有幾萬多的理論塔板數(shù)。然而由于采用粒徑小的填料會(huì)造成柱壓增大，有時(shí)須用上超高壓液相色譜UHPLC。 最近，SPPs再次得到人們的重視。新型的SPPs雨后春筍般出現(xiàn)，名稱花樣百出，有些叫什么熔核的，也有些叫什么核殼的。這些填料顆粒直徑為2.62.7m，外層的多孔層厚度為0.5m，孔徑90120 ，適合進(jìn)行小分子的分離。相對(duì)亞-2m的SPPs填料，此類較高粒徑的填料能提供較低的柱子壓降（比前者降低4060%），然而仍然擁有較短的擴(kuò)散路徑等其他小粒徑填料的優(yōu)點(diǎn)。通過特殊的合成工藝，我們能控制SPP的微粒粒徑在一個(gè)很窄的范圍內(nèi)，這范圍遠(yuǎn)比制作全多孔填料微粒時(shí)要窄。這樣，均勻的填料能更有效率地裝填到色譜柱中，這能使得范第姆特方程方程（）式中的參數(shù)A（渦流擴(kuò)散項(xiàng)）降低。除此以外，也有研究證明參數(shù)B也會(huì)因此降低。通過同時(shí)降低范第姆特方程方程式中的三個(gè)參數(shù)，這些用粒徑為2.62.7m的SPP裝填的柱子，其柱效能媲美之前亞-2m的SPP柱。在較低的壓 降下實(shí)現(xiàn)高柱效，這樣用戶們就能繼續(xù)使用他們?cè)?來的LC系統(tǒng)，而不必升級(jí)到UHPLC了。 圖5 另一方面，利用UHPLC系統(tǒng)也使得我們能通過使用更長(zhǎng)的SPP柱子，從而獲得更大的理論塔板數(shù)。圖6對(duì)比了分別使用SPPs填料與亞-2m全多孔填料進(jìn)行高柱效分離的情況。現(xiàn)在大部分的對(duì)比試驗(yàn)都傾向用較短的色譜柱進(jìn)行高通量應(yīng)用，耗時(shí)一般只有幾分鐘。而圖6所示的對(duì)比試驗(yàn)卻是用裝填上述兩種不同填料的長(zhǎng)柱進(jìn)行的，兩根柱子都有超過10萬的理論踏板數(shù)，尺寸皆為55cm2.1mm。可以說它們具有基本相同的塔板數(shù)和分離時(shí)間。對(duì)比后能發(fā)現(xiàn)，兩者最大的不同來自柱壓的差別。對(duì)于亞-2m的全多孔填料，柱壓已經(jīng)超過1000bar(15000psi)，然而粒徑2.7m的SPP填料，柱壓只有547bar(8200psi)。圖5 范第姆特方程方程已經(jīng)商業(yè)化的現(xiàn)代SPP柱子到目前為止，只有少數(shù)幾家公司能提供SPP柱子用于大分子和小分子的分析（見下表）。菲羅門公司除了提供2.6m粒徑的SPP填料，還推出了1.7m粒徑規(guī)格的填料，對(duì)比亞-2m的全多孔填料，該種填料在相同的壓降下，能得到更好的分離效率，這對(duì)之前容易因?yàn)橹庑?yīng)出現(xiàn)峰型變寬的UHPLC系統(tǒng)來說，的確是一個(gè)大的挑戰(zhàn)。由于SPPs能用于HPLC與UHPLC系統(tǒng)，所以可以預(yù)料在未來會(huì)有更多其他的公司推出此 類產(chǎn)品。另外，針對(duì)亞-3m的SPPs填料，越來越多的固定相也正在研發(fā)當(dāng)中，相信在不久的將來，其固定相的種類能與亞-2m或常規(guī)的HPLC全多孔填料相當(dāng)。 結(jié)論 SPP的概念在液相色譜中出現(xiàn)已有相當(dāng)時(shí)間，如今以全新面目粉墨登場(chǎng)后，儼然已經(jīng)成為亞-2m全多孔填料的強(qiáng)勁對(duì)手。最新的SPP產(chǎn)品不僅能為大分子也能為小分子提供快速分離，特別是進(jìn)行小分子分離時(shí)，其壓降比亞-2m的全多孔填料產(chǎn)品要低許多。雖然本文不在此做深入討論，但相對(duì)亞-2m全多孔填料，用于分離小分子的SPPs具有較厚的微粒薄層，這樣其樣品容量不會(huì)像早期的大粒徑SPPs填料那樣發(fā)生很大的下降。相對(duì)亞-2m全多孔填料，SPPs填料的可用表面積只下降了25%，然而由于SPPs顆粒的填充密度高，相同規(guī)格的柱子里，SPP擁有的固定相基團(tuán)數(shù)量基本與前者相當(dāng)?shù)?。因此，上述兩種不同類型柱子的樣品容量其實(shí)也是差不多的。無論是用于小分子分析的2.62.7m 粒徑的SPP柱子，還是用于大分子分析的5m粒徑的SPP柱子，其進(jìn)出口都采用2.0m孔徑的篩網(wǎng)密封。因此這些柱子就不會(huì)像亞-2m粒徑填料的柱子那樣容易發(fā)生堵塞。顯然易見地，隨著用戶越來越熟悉這項(xiàng)技術(shù)，這種填料將會(huì)有一個(gè)美好的前景。注：本文來自Ronald E. Majors的 “The Increasing Role of Superficially Porous Particles in HPLC”。如需轉(zhuǎn)載，請(qǐng)注明由本人aspoul翻譯，多謝合作，本人的聯(lián)系方式：aspoul。 （注：文件素材和資料部分來自網(wǎng)絡(luò)，供參考。請(qǐng)預(yù)覽后才下載，期待你的好評(píng)與關(guān)注。）