細胞融合實驗,liuzhe5,概念促融合劑與融合技術應用與意義,重點,一定義：Cellfusion,細胞融合：(Cellfusion)又稱體細胞雜交（somatichybridization）是指將不同來源的原生質體(除去細胞壁的細胞)相融合，將兩個或多個細胞合并成一個細胞的技術。,人心肌細胞,人肝臟細胞,種內雜交細胞,人細胞,鼠細胞,種間雜交細胞,在適當?shù)臈l件下，細胞融合在一起，產生具有原來兩個細胞基因信息的單個核細胞，稱為雜交細胞（hybridcell）。種內雜交細胞（intraspecifichybridcell）:同種細胞融合而成的細胞種間雜交細胞（interspecifichybridcell）:不同種的細胞融合而成的細胞,非對稱細胞融合（asymmetricfusion）：利用物理或化學方法使某親本細胞的核或細胞質失活后再進行融合。,細胞核或細胞質失活的有物理和化學方法：1.物理方法，如X射線、r射線等，它們能使細胞核失活；2.化學方法，核失活碘乙酰胺（IOA）、碘乙酸(Iodoacetate)；質失活羅丹明（R6G，它是一種親脂染料，能夠抑制線粒體的氧化磷酸化過程而達到失活作用。,動物克隆,上海第二醫(yī)科大學陳瑩博士,2003年，她將一5歲男孩的包皮細胞與一只已去除細胞核的新西蘭兔卵母細胞融合，獲得了人類早期胚胎。,二細胞融合的原理,熒光標記的小鼠細胞和人細胞融合實驗,將小鼠的抗體與發(fā)綠色熒光的熒光素(fluorescin)結合,人的抗體與發(fā)紅色熒光的羅丹明(rhodamine)結合；,顯微鏡下的細胞融合過程,細胞融合的過程,細胞互相靠近,細胞膜融合,細胞橋形成,細胞質融合,細胞核融合,細胞融合主要經過了兩原生質體或細胞互相靠近、細胞橋形成、胞質滲透、細胞核融合主要步驟。細胞橋的形成是細胞融合最關鍵的一步，融合過程中兩個細胞膜從彼此接觸到破裂形成細胞橋。,細胞融合過程中兩個細胞膜的變化,形成細胞橋的具體變化,細胞融合分為兩種：1.自發(fā)細胞融合2.人工誘導細胞融合,（1）自發(fā)細胞融合,自發(fā)細胞融合（spontaneouscellfusion）是在未施加任何誘導條件的情況下所發(fā)生的細胞融合現(xiàn)象。,自發(fā)細胞融合現(xiàn)象在自然界中并不多見，常見的主要有以下幾種情況：1.精子和卵子受精2.肌管的形成3.胚胎著床4.巨細胞的形成5.破骨細胞的形成6.腫瘤細胞融合,（2）誘導細胞融合,人工誘導細胞融合是在人為條件下發(fā)生的細胞融合現(xiàn)象,常用的誘導方法有三種：1.生物法（病毒誘導法等）2.化學法（PEG誘導法、Ca2+誘導法、溶血卵磷脂誘導法等）3.物理法（電誘導法等）,1.病毒誘導法,常用的病毒：仙臺病毒（Sendalvirus),又稱日本血凝病毒（HemagglutinatingvirusofJapan,HVJ）屬于副粘液病毒科，RNA病毒，圓球形1962年，日本仙臺東北大學學者岡田發(fā)現(xiàn)仙臺病毒可誘導細胞融合。,病毒促使細胞融合兩個原生質體或細胞在病毒黏結作用下彼此靠近，使兩個細胞膜、胞質間互相滲透-細胞核互相融合，進入正常的細胞分裂途徑，雜種子細胞。,2化學法（聚乙二醇）,PEG:聚乙二醇（polyethyleneglycol,PEG）分子式：HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH性狀：白色蠟狀固體，具有強烈的凝集、沉淀蛋白質的作用分子量1000-6000u，可作誘融劑。,20世紀70年代，華裔科學家高國南發(fā)現(xiàn)聚乙二醇能誘導細胞融合,分子量小的PEG，融合效應差，又有毒性，分子量過大，則粘性太大，不易操作。pH偏堿時融合效應最高。用作細胞融合劑的聚乙二醇一般選用分子量為4000者，常用濃度為50，pH8.0pH8.2,聚乙二醇,普遍認為聚乙二醇分子能改變各類細胞的膜結構，使兩細胞接觸點處質膜的脂類分子發(fā)生疏散和重組，由于兩細胞接口處雙分子層質膜的相互親和以及彼此的表面張力作用，從而使細胞發(fā)生融合,基本原理,聚乙二醇(PEG)是一種多聚化合物，商品名卡波蠟(Carbowax)。,聚乙二醇（PEG）介導的細胞融合,原理：PEG帶有大量的負電荷,和原生質體表面的負電荷在鈣離子的連接下，形成靜電鍵，促使異源的原生質體間的粘著和結合，在高pH,高鈣離子的溶液的作用下，將鈣離子和與質膜結合的PEG分子洗脫，導致電荷平衡失調并重新分配，使兩種原生質體上的正負電荷連接起來，進而形成具有共同質膜的融合體。,融合過程中應注意事先要做好兩種原生質體的識別標記，如色素、缺陷型、抗性標記等。原生質體的密度應在105個mL左右，兩種原生質體按1：1等量混合。常用PEG的分子量通常為40006000，加熱熔化與Eagle溶液配成50(WV)濃度(小分子質量的PEG配成55濃度)。加入PEG后，24培育1020min注意時間宜短不宜長，過長，使原生質體周圍包裹一層膜形成凝集體，會降低融合率)，緩緩加入高pH、高鈣離子溶液15min后用沖洗液清洗，離心收集原生質體。,3.物理法一電融合誘導法,1981年，Scheurich和Zimmermann發(fā)明了電誘導細胞融合。,電融合槽,在直流電脈沖的誘導下，原生質體質膜表面的電荷和氧化還原電位發(fā)生改變，使異種原生質體黏合并發(fā)生質膜瞬間破裂，進而質膜開始連接，直到閉和成完整的膜形成融合體。,細胞電融合,原理：懸于大小不同的兩平行電極間的低導電率溶液中的細胞，在1100MHz和1001000V/cm的交流電場中，會向小電極移動，并極化成偶極子，而沿電場方向發(fā)生雙向電泳，此時再加上適當強度和持續(xù)時間的高壓電脈沖，即可使相鄰細胞膜的接觸區(qū)產生可逆電降解，從而觸發(fā)細胞融合。,+,-,+,-,+,-,+,-,-,+,偶極子,電誘導法原理,+,-,-,+,雙向電泳：在交流電場的作用下（1MHz，150V/cm）細胞膜上正負電荷分離，產生偶極，兩個極化的細胞會發(fā)生相互的緊密接觸。,原生質體電融合過程,1）在高頻電流電場下的相互接觸。2）脈沖刺激后30s3)50秒后4）1.5分鐘后5）6分鐘后6）15分鐘后，原生質體融合完成。,注意事項,1）對介質要求高，一般用高純度的蒸餾水并選用適當?shù)姆请娊橘|溶液，如甘露醇等配制等滲性介質。2）注意控制高頻交流電壓和直流脈沖電壓的強度和時間，以防止細胞連接成串或發(fā)生可逆性降解。,優(yōu)點：,融合率高，達7080，甚至100可在顯微鏡下定向誘導細胞融合可直接挑選雜種細胞重復性強、對原生質體傷害??；裝置精巧、方便簡單；免去PEG誘導后的洗滌過程、誘導過程可控制性強等。,融合指數(shù)（fusionindex）:反映細胞融合的效率有兩種計算方法：1.FI=（對照組細胞數(shù)-試驗組細胞數(shù)）/試驗組細胞數(shù)2.FI=多核細胞中的細胞核數(shù)/所有細胞中的細胞核數(shù),不同細胞融合的條件及其主要應用,來源前處理融合的方法主要應用動物細胞不需仙臺病毒,PEG，電融合生產單克隆抗體植物細胞脫壁PEG,電融合創(chuàng)造植物新品種微生物細胞脫壁PEG,高產優(yōu)質新菌種,A,A,B,B,A,A,B,B,B,A,A,B,同核體,同核體,異核體（雜交細胞）,未融合,未融合,加入融合劑,融合細胞的類型,同核體：由同一親本細胞融合而來異核體：（heterokaryon）有不同親本細胞融合而來異核體其細胞膜融合在一起，而融合的細胞含有兩個不同的細胞核。,動物細胞融合影響因素,動物細胞融合中，除促融劑外，其他如細胞性質、溫度、pH、離子強度及離子種類等均全影響細胞融合效率。親本細胞表面性質影響較大細胞種類不同，融合效果也不同，如腹水癌及株化細胞較易融合，而淋巴細胞或血球細胞幾乎不融合。細胞融合時需要適宜溫度和運動狀態(tài)。如仙臺病毒誘導-腹水癌細胞融合時，于37振搖時易于融合，且融合效率與病毒量呈正比。但在34振搖則融合率下降。在37時不振搖則-不融合。,細胞融合過程中，通常耗氧量較大，缺氧時經常不融合?？諝庵泻趿看笥?0時有一定融合率，但有些細胞在無氧條件也可融合。有些細胞融合時需要Ca2+，否則不融合，細胞蛋白質亦發(fā)生變化。實驗表明Sr2+、Ba2+、Mg2+、Mn2+等離子可代替Ca2+，但有效濃度較Ca2+大的多。融合時最適合的離子強度一般為0.1mol/L。最適合的pH為7.4-7.8之間，在此范圍之外，融合率均較低。,比較常用的雜種細胞篩選方法,1遺傳互補篩選法：2營養(yǎng)互補篩選：3溫度敏感篩選法,1）遺傳互補篩選法：利用每一親本貢獻一個功能正常等位基因，糾正另一親本的缺陷，令雜種細胞表現(xiàn)正常。親本A：HGPRT-/TK+親本B：HGPRT+/TK-雜交細胞：HGPRT+/TK+在HAT培養(yǎng)基中雜交細胞存活，A、B死亡,2）營養(yǎng)互補篩選系統(tǒng)：細胞在缺乏一種或幾種營養(yǎng)成分時，不能生長繁殖即營養(yǎng)缺陷型細胞。利用兩種親本細胞營養(yǎng)互補作用原理可以篩選雜種細胞。親本A：色氨酸缺陷型親本B：蘇氨酸缺陷型雜種細胞可以在不含色氨酸和蘇氨酸的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，而親本細胞均會死亡。,3）溫度敏感突變型雜種細胞的篩選：一般的培養(yǎng)細胞能在32度到40度的范圍內生長，但溫度敏感突變型的細胞能在高溫或低溫下生長。由此篩選雜種細胞。親本一：低溫敏感突變型，可在低溫下生長，在高溫下死亡。親本二：高溫敏感突變型，可在高溫下生長，在低溫下死亡。雜種細胞能在高溫和低溫下生長。,細胞融合的應用,1.用于基因定位2.用于生產樹突狀細胞抗腫瘤疫苗2.用于動物育種3.用于細胞治療4.用于生產單克隆抗體5.用于研究核質關系和腫瘤發(fā)生機制,細胞融合應用,一.單克隆抗體1975年英國科學家Milstein和Kohler將產生抗體的淋巴細胞同腫瘤細胞融合，成功建立了單克隆抗體技術，而獲得1984年諾貝爾醫(yī)學和生理學獎。,TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1984"forthediscoveryoftheprincipleforproductionofmonoclonalantibodies",GeorgesJ.F.KoehlerFederalRepublicofGermanyBaselInstituteforImmunologyBasel,Switzerlandb.1946d.1995,CarMilsteinArgentinaandUnitedKingdomMRCLaboratoryofMolecularBiologyCambridge,UnitedKingdomb.1927(inBahiaBlanca,Argentina)d.2002,科萊爾,米爾斯坦,單克隆抗體的概念,單:單個細胞克隆:無性繁殖抗體:化學性質單一、特異性強,親本細胞的準備,細胞融合,雜交瘤細胞的篩選,可分泌特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞的篩選,雜交瘤細胞的克隆化培養(yǎng),單克隆抗體的生產和純化,生產過程,單克隆抗體的大量制備過程,一細胞融合前準備(一)動物免疫與免疫脾細胞懸液的制備在腹腔免疫12次后的24周，于融合前34天加強免疫一次，這樣可以使抗原最近激活的B淋巴細胞定位于脾臟，也使記憶細胞處在激活與分裂狀態(tài)。許多資料結果表明，脾細胞與骨髓瘤細胞融合，形成雜交瘤的最佳時間，是在抗體形成高峰之前，而不是在抗體形成高峰期。可溶性抗原的免疫量常為10-100ug，經皮下或腹腔注射免疫1-2次（間隔2-3周），3周后50-500ug抗原加強免疫，加強免疫一定要靜脈注射或腹腔內注射，確?？乖竭_脾臟。細胞抗原常用2107用細胞腹腔注射，不需佐劑。一般取最后一次加強免疫3天以后的脾臟，制備成細胞懸液。,淋巴細胞：經過免疫處理的淋巴細胞，多用大鼠或小鼠。免疫方法：體內法或體外法。體內法：對細胞或微生物抗原可直接注射如小鼠體內，可溶性蛋白抗原可與等量的福氏完全佐劑混合乳化后，注入到動物體內。34天后，在無菌條件下可以取出脾或淋巴結制成懸液，存活率在95以上的可以用于融合。體外法：直接提取大、小鼠淋巴細胞，調整為107個/ml，加適當濃度抗原，34天后，收集被刺激的淋巴細胞。,小牛血清的選擇供血的新生小牛必須是健康牛的產仔，并在產后24小時內抽血，此期間不得吸取母乳。以無菌操作自頸動脈放血，并在無菌條件下分離血清及濾菌，全過程在36小時內完成。經濾菌的血清置20保存。血清使用前需做細菌、支原體培養(yǎng)及內毒素測定，在確實無污染的情況下方可使用。每批小牛血清測定總蛋白含量并分別配成10、20、25于基礎培養(yǎng)基和HAT培養(yǎng)基中，對骨髓瘤細胞和雜交瘤細胞進行培養(yǎng)，觀察小牛血清對瘤細胞和融合細胞的細胞毒性。輕微溶血的血清，而無細胞毒性者仍可應用。在用血清做細菌培養(yǎng)時，應置于細胞培養(yǎng)瓶內進行，培養(yǎng)期間隨時可放于倒置顯微鏡下觀察，可避免由于肉眼觀察的疏忽。,B淋巴細胞的準備,紅細胞,將紅細胞注入小鼠皮下或腹腔,取出脾臟,B淋巴細胞,親本細胞的準備,(二)骨髓瘤細胞的獲得與培養(yǎng),骨髓瘤細胞系應和免疫動物屬于同一品系，這樣雜交融合率高，也便于接種雜交瘤細胞在同一晶系小鼠腹腔內產生大量McAB。骨髓瘤細胞的培養(yǎng)可利用一般的動物細胞培養(yǎng)液。小牛血清的濃度一般在1020，細胞的最大密度不得超106個ml，一般擴大培養(yǎng)以1：10稀釋傳代，每3-5天傳代一次。細胞的倍增時間為16-20h。,親本細胞的準備,骨髓瘤細胞的準備,骨髓瘤細胞：是癌變的漿細胞，可以分泌免疫球蛋白，所以必須選擇不分泌免疫球蛋白的缺陷型骨髓瘤細胞，多用BALB/C小鼠的骨髓瘤細胞。,細胞融合,加入PEG作融合劑,B淋巴細胞,骨髓瘤細胞,雜交瘤細胞,1,2,3,4,二細胞融合,融合條件除了融合劑以外，還包括溫度、培養(yǎng)基和培養(yǎng)板等。我們首先分析用PEG作融合劑時的條件選擇。由于作用時間不一樣對細胞的毒性也不一樣。用于融合的分子量一般在10004000，一般作用濃度在3550之間，PEG作用12分鐘，以PH8.08.2時融合率最高。,小白鼠脾臟細胞B與癌細胞N以PEG進行融合，操作在10min內完成(如下圖)，隨即把細胞平均分配在96槽細胞培養(yǎng)盤中,細胞融合：1.脾細胞的準備；拉頸處死小鼠；無菌操作取出脾臟；清洗、研磨。2.制備脾細胞懸液:收集細胞；離心洗滌；細胞計數(shù)。3.準備骨髓瘤細胞:收集細胞；離心洗滌；活細胞計數(shù)；調整細胞濃度，骨髓瘤細胞與小鼠脾胞按一定比例混合。4.細胞融合劑的選擇：病毒，PEG。5.細胞融合：在聚乙二醇作用下各種淋巴細胞可與骨髓瘤細胞發(fā)生融合，形成雜交瘤細胞。,將免疫脾細胞和小鼠骨髓細胞以2：1或10：1的比例混勻于50ml錐形離心管內。1200rpm離心710分鐘，盡量吸凈上清液，用手指輕擊管壁，使管底沉淀的細胞鋪展成薄層。在室溫條件下邊輕輕振搖離心管邊在60秒鐘內逐滴加入50%的PEG0.5ml，隨后靜置90秒。再于5分鐘內邊振搖邊逐滴加入510ml不含血清的培液或鹽水緩沖液，以終止PEG的作用，再靜置10分鐘。,融合細胞的早期觀察及其異常結果分析：1融合后的細胞早期觀察與管理；2無分泌特異性抗體雜交瘤原因分析；3轉種與擴大培養(yǎng)過程中雜交瘤細胞生長；4不出現(xiàn)雜交瘤的原因分折。,三雜交瘤細胞的篩選,融合,將細胞轉移到HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng),HAT,1,2,3,4,HAT培養(yǎng)基篩選雜交瘤細胞,細胞團塊分散后，加HAT溶液，稀釋至骨髓瘤細胞不超過2105ml，即可加入有飼養(yǎng)細胞的96孔塑料培養(yǎng)板內每孔0.1ml，如是24孔板，每孔0.5ml；總量分別為0.2ml和1ml。用HAT選擇性培養(yǎng)時每隔23天半量換液，7天后可以選擇出雜交瘤細胞。,HAT選擇系統(tǒng),HAT是含一定濃度次黃嘌呤（H）、氨基喋呤（A）及胸腺嘧啶核苷（T）的一種選擇性培養(yǎng)基，其中三種成分與細胞DNA合成有關。DNA合成途徑有兩種。,雜交瘤技術中，常選用次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶缺陷（HPRT-）骨髓瘤細胞或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）骨髓瘤細胞為親本之一。HPRT-細胞的嘌呤只能由全合成途徑產生；TK-細胞的嘧啶只能由全合成途徑合成。含氨基喋呤培養(yǎng)基抑制了細胞內嘌呤和嘧啶的全合成途徑。,淋巴細胞具有合成DNA的兩條途徑。雜種細胞通過互補作用獲得HRPT或TK基因，可應用培養(yǎng)基中次黃嘌呤及胸腺嘧啶核苷，通過補救合成途徑合成DNA。在HAT培養(yǎng)基中，HPRT-或TK-親本細胞死亡，淋巴細胞亦逐漸死亡，只有雜種細胞存活。,四可分泌特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞的篩選,HAT,將培養(yǎng)皿孔內的上清液取出，檢測抗體。常用的方法有：放射免疫測定、酶聯(lián)免疫吸附試驗和免疫熒光測定。,融合,五雜交瘤細胞的克隆化培養(yǎng),123456,融合,HAT,雜交瘤細胞的克隆化培養(yǎng),利用單個細胞培養(yǎng)技術選育出遺傳穩(wěn)定的分泌特異抗體的細胞系。在培養(yǎng)過程中，一般要加能釋放某些生長因子促進雜交瘤生長的飼養(yǎng)細胞，如小鼠的腹腔巨噬細胞、脾細胞或胸腺細胞等。方法有有限稀釋法、軟瓊脂培養(yǎng)法、顯微操作法、應用熒光激活分選儀等。,克隆化的目的1）是細胞建株的必經過程，以得到遺傳特征相同的細胞；2）就雜交瘤而言，可從中篩選出穩(wěn)定而同源的雜種細胞系，淘汰遺傳不穩(wěn)定的雜交瘤細跑。3）減少非分泌型無關細胞生長過快。注意事項：待克隆細胞生長處于對數(shù)增長期；小牛血清的質量和濃度；細胞計數(shù)要準確；及時觀察細胞生長情況。,飼養(yǎng)細胞的種類和作用對于培養(yǎng)小鼠細胞來說，主要有下列各種細胞可供作為其飼養(yǎng)細胞：胸腺細胞,用量為106/0.2ml正常的脾細胞；傳代培養(yǎng)中的大鼠胚胎成纖維細胞；腹腔細胞其用量為2104/0.2ml，腹腔細胞是使用得最普遍的飼養(yǎng)細胞。胚胎成纖維細胞因在細胞培養(yǎng)條件下有分裂增殖的能力，故只適應于軟瓊脂平板法培養(yǎng)中，該細胞鋪于平板的底層。,飼養(yǎng)細胞的作用提高培養(yǎng)細胞的密度，使待克隆細胞容易生存與繁殖。腹腔細胞能清除培養(yǎng)中的死亡細胞，從而促進單個細胞克隆的生長。飼養(yǎng)細胞能釋放諸如細胞生長因子類物質，起到促進細胞分裂、增殖的作用。,1.有限稀釋法,稀釋,1）有限稀釋法有限稀釋法原理是從理論上將細胞稀釋到10個/ml，然后裝成每小孔(96孔板)0.1ml，使每孔理論上含有單個細胞，經過培養(yǎng)后即可獲得單個細胞形成集落。有限稀釋法舉例：1.取1.0ml5104ml細胞+4ml培養(yǎng)基稀釋，得1104/ml.2.取0.5ml1104ml細胞液+4.5ml培養(yǎng)基稀釋，得1103/ml.3.取1.0ml1103ml細胞液+4.5ml培養(yǎng)基稀釋，得1102/ml.,2.軟瓊脂培養(yǎng)法,在加入飼養(yǎng)細胞的無菌平皿內鋪上一層0.5的瓊脂，待凝固后再鋪上一層混有雜交瘤細胞的0.25的軟瓊脂。待細胞長成集落后，用毛細管吸出移種于含飼養(yǎng)細胞的96孔板內。,2）軟瓊脂培養(yǎng)法：本法對于某些抗原，可以把克隆化培養(yǎng)與特異性篩選測定結合起來進行，所以它的特點是效率較高，速度較快。但缺點是克隆率不高。基本原理是利用單個細胞在軟瓊脂培養(yǎng)基上的局限化生長，待細胞集落長到肉眼可見后，用巴氏吸管從瓊脂上挑出來(一般810天后)，再移到液體培養(yǎng)基中，進行生長繁殖，并檢測培養(yǎng)上清液的活性。也可以用溶血空斑技術或圍繞集落形成免疫沉淀的方法來直接測它的活性。,3.顯微鏡操作法,3）顯微鏡操作法在倒置(或解剖)顯微鏡下，借助于毛細吸管將單個細胞個別吸出，分別放入已加飼養(yǎng)細胞的96孔培養(yǎng)孔內，根據(jù)原理不同，又分為普通法和玫瑰花結兩種方法。普通顯微鏡操作法：于6cm平皿中，假如約103個細胞；CO2培養(yǎng)基箱中靜置1小時左右無菌條件；在倒置顯微鏡下去平皿蓋用直角轉頭滴管，吸出單個細胞移至預先加有飼養(yǎng)細胞的96孔板內直至96孔均分裝有細胞，加蓋；于CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)觀察與更換培養(yǎng)方法同有限稀釋法。玫瑰花結原理：分泌抗體細胞在其表面含有抗原受體，在定的條件下常可與特異性抗原致敏的羊紅細胞形成玫瑰花結。如果從免疫動物的脾細胞中除去能形成特異性玫瑰花結的細胞則失去對特異性抗原的反應性。,4.熒光激活分離法,熒光激活細胞分離器法(FluoresemuactivatedCellSortu，F(xiàn)ACS)用本儀器分離單細胞的原理是將懸液中的細胞引入一種液流的中央，使其一個接一個地通過聚焦的高能激光束，根據(jù)熒光和光放射的性質快速分析和分離細胞。,5）蓋片分離法1.用釘錘于潔凈的橡膠上砸干凈蓋片；2.選擇碎塊、大小形態(tài)適用的選出；3.加培養(yǎng)液及進行細胞培養(yǎng)；4.倒置鏡下選細胞，挑出單細胞玻片；5.進行單個細胞培養(yǎng)。,大量生產單克隆抗體：,(1)體外使用旋轉培養(yǎng)管大量培養(yǎng)雜交瘤細胞，從上清中獲取單克隆抗體；（2）體nei雜交瘤細胞制備腹水或血清1)實體瘤法：對數(shù)生長期的雜交瘤細胞接種于小鼠背部皮下，每處注射0.2ml.腫瘤達到一定大小后則可采血，從血清獲得單克隆抗體。,2）腹水的制備：,腹腔注射1x106雜交瘤細胞，按種細胞7-10天后可產生腹水。也可用注射器抽取腹水，可反復收集數(shù)次。腹水中單克隆抗體含量可達5-20mg/ml，可以將腹水中細胞凍存起來，復蘇后轉種小鼠腹腔則產生腹水快、量多。,避免夭折的方法可采用：換液動作輕柔、換液量不超過1/2；避免反復取出CO2培養(yǎng)箱，不宜經常換液；不輕易更換新批號小牛血清。及時判斷陽性孔也是一項重要的工作，可起減少工作量和保證重點雜交細胞雙重作用，待集落生長到96孔板孔1/3左右，24孔板1/5左右，就要及時測定各孔上清中是否會有特異性抗體，一旦發(fā)現(xiàn)抗體陽性孔，就應立即擴大培養(yǎng)，再凍存和克隆化，以免被其他細胞生長所壓抑或意外丟失。無分泌特異性抗體雜交瘤原因分析：融合后經HAT選擇有細胞克隆出現(xiàn)，但不能篩選出產生特異抗體的雜交瘤，常見原因是：抗體檢測法不夠敏感；HAT選擇失??；染色體丟失和克隆競爭；動物免疫不成功。,雜交瘤細胞產生單克隆抗體示意圖,單克隆抗體的應用,主要用于疾病的診斷、治療和預防。與常規(guī)抗體相比，具有特異性強、靈敏度高的優(yōu)點。如；各種癌癥、肝炎病毒、SARS病毒、細菌及血吸蟲等數(shù)百種疾病的診斷；在疾病治療方面，單克隆抗體猶如人體衛(wèi)士，能識別“自己”與“異己”，一旦發(fā)現(xiàn)致病因素便與之結合將其殺死。若在單抗上帶上抗癌藥物制成“生物導彈”，將藥物定向帶到癌細胞所在部位，既消滅了癌細胞又不會傷害健康細胞,美國科學家采用細胞融合技術將番茄和馬鈴薯的細胞融合在一起，培育出稱之為“番茄薯”或“薯番茄”的新型植物。植株地上部結番茄，地下部生長根莖，產量高，品質好。,動物細胞融合與單克隆抗體思考與探究,1.植物體細胞雜交技術與動物細胞融合技術有什么不同？提示：植物體細胞雜交技術與動物細胞融合技術基本相同，不同的是植物體細胞融合前需去掉細胞壁，然后再融合；動物細胞融合是兩個體細胞直接融合。,2.制備單克隆抗體時，為什么要選用B淋巴細胞和骨髓瘤細胞融合形成雜交瘤細胞？,提示：哺乳動物感染抗原后，其體內會形成相應的B淋巴細胞，B淋巴細胞能分泌相應的抗體凝聚或殺死這些抗原。動物在免疫反應的過程中，每一種B淋巴細胞能分泌一種特異性抗體，要想獲得大量的特異性抗體，必須使能分泌該單一抗體的B淋巴細胞大量增殖。B淋巴細胞具有產生單一抗體的能力，但不能在體外增殖骨髓瘤細胞是一種癌細胞，它能在體外培養(yǎng)條件下無限增殖，但不能產生抗體。因此，把一種B淋巴細胞與骨髓瘤細胞進行細胞融合，產生雜交瘤細胞，它會兼有兩個親本細胞的特性在體外培養(yǎng)條件下能不斷增殖，同時能產生出某種特異性的抗體。,3已成功的動物細胞融合實例還有哪些？生物種類細胞來源成功年代酵母菌雞原生質體血紅細胞1975年人胡蘿卜腹水癌細胞原生質體1976年人小鼠纖維肉瘤細胞畸胎瘤細胞1978年,4.為什么不用兩個而用多個細胞進行細胞融合？,就目前常用的細胞融合方法來看，不管是用物理的、化學的方法，還是生物的方法，其融合率都不可能是100%。僅用兩個細胞融合，其效率太低，不一定能得到融合細胞。更重要的是，即使兩個細胞已發(fā)生融合，但并不一定是研究者期望得到的細胞類型。目前動物細胞融合技術最有價值的應用就是單克隆抗體的制備。我們以制備單克隆抗體為例來說明這一問題。我們知道，體內產生的特異性抗體種類可多達百萬種以上，但是每一個B淋巴細胞只分泌一種特異性抗體，如果僅取一個脾細胞（含B淋巴細胞）和一個瘤細胞雜交，我們不能確定該脾細胞分泌的抗體是否正是我們所需要的；若用大量的脾細胞和瘤細胞進行融合，就可以從融合細胞中篩選出能分泌所需抗體的雜交瘤細胞。,5.雜交瘤細胞的抗體檢測及克隆化培養(yǎng)？,融合后的細胞經選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)后，能存活的細胞就是雜交瘤細胞。但這些雜交瘤細胞并非都是能分泌所需抗體的細胞，通常用“有限稀釋法”來選擇。將雜交瘤細胞稀釋，用多孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)，使每孔細胞不超過一個，通過培養(yǎng)讓其增殖。然后檢測各孔上清液中細胞分泌的抗體（常用酶聯(lián)免疫吸附試驗法），那些上清液可與特定抗原結合的培養(yǎng)孔為陽性孔。陽性孔中的細胞還不能保證是來自單個細胞，挑選陽性孔的細胞繼續(xù)進行有限稀釋，一般需進行34次，直至確信每個孔中增殖的細胞為單克隆細胞。該過程即為雜交瘤細胞的克隆化培養(yǎng)。,這樣的人畜細胞融合會造成什么后果？4位專家分析指出：首先，某些目前未知的兔子疾病將傳染給人類，就像艾滋病病毒可能是從非洲猩猩而來。盡管中山醫(yī)科大學把胚胎用于治療性克隆研究，但萬一被居心叵測者植人人類子宮，就可能產生一個人兔雜交種?！斑@完全是對人類尊嚴的褻讀?！?精子和卵子受精,肌管,破骨細胞是由好幾個細胞融合,巨細胞,骨巨細胞瘤,骨巨細胞瘤綠色箭頭所指為正在融合的間質細胞,附錄：蟾蜍血紅細胞雞血紅細胞,實驗步驟1.試劑：(1)Alsver液：葡萄糖2.05g，檸檬酸鈉0.8g，氯化鈉0.42g，加重蒸水至100mL即可。(2)GKN液：氯化鈉8g，氯化鉀0.4g，磷酸氫二鈉1.77g，磷酸二氫鈉0.69g，葡萄糖2g，酚紅0.01g，溶于1000mL重蒸水中。(3)Ringer溶液：二氯化鈉0.25g，氯化鉀0.42g，氯化鈉6.5g(恒溫動物9g)溶于1000mL蒸餾水中。(4)50PEG混合液：稱取少許PEG(Mw4000)放人刻度離心管內，在沸水浴中加熱，的等體積的GKN液，混勻。,實驗步驟,1.細胞懸液的制備：(1)蟾蜍血紅細胞懸液制備：注射器吸1mLAlsver液后，從蟾蜍主動脈弓取血1mL，再加入2mLAlsver液放入刻度離心管內，按照3：1(VV)加入6mLAlsver液混勻，放入4冰箱內可保存3-4天。(2)雞血紅細胞懸液的制備：用注射器吸入1mLAlsver液后從雞翼下靜脈取血2mL，注入刻度離心管內，按照3：1(VV)加入6mLAlsver液混勻。2.取細胞懸液1mL，移入10mL離心管，加4mL0.85生理鹽水。1500rmin離心5min。3.棄上清液，加0.85生理鹽水至5mL，混勻后1500rmin離心5min。重復再離心洗滌1次。4.收集最后1次離心沉淀的血細胞，加適量的GKN液或Ringer溶液，按壓積紅細胞體積配成10的紅細胞懸液。5.取懸液1mL到1個試管中，加入0.50.8mL預熱的50PEG混勻，置于30水浴2min；再加入Ringer或Hanks液5ml以終止PEG的作用;取血細胞懸液1滴滴于載玻片上，再加入0.2%次甲基藍溶液1滴,蓋上蓋玻片。6.顯微鏡(高倍)觀察2個或3個靠近細胞融合過程。7.進行多個視野的測定，統(tǒng)計平均融合,