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.,1.2 基因工程的基本操作程序,.,,基因工程培育抗蟲棉的簡要過程：,蘇云金芽孢桿菌,抗蟲基因,棉花植株(有抗蟲特性),.,,基因工程基本操作的四個步驟,,,1、目的基因的獲取,2、基因表達載體的構(gòu)建,3、目的基因?qū)胧荏w細胞,4、目的基因的檢測與鑒定,有了目的基因，我們才能賦予一種生物以另一種生物的遺傳特性。,使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并可進行遺傳、表達和發(fā)揮作用,載體進入受體細胞穩(wěn)定表達，才能實現(xiàn)一種生物的基因在另一種生物中的轉(zhuǎn)化。,才能確定目的基因是否真正在受體細胞中穩(wěn)定遺傳和正確表達。,,,.,,一、目的基因的獲取,.,原核細胞的基因結(jié)構(gòu),,,,,,,,,非編碼區(qū),,非編碼區(qū),編碼區(qū),編碼區(qū)上游,編碼區(qū)下游,與RNA聚合酶結(jié)合位點,啟動子,終止子,,①不編碼蛋白質(zhì)。,：編碼蛋白質(zhì) ,連續(xù)不間斷,編碼區(qū),非編碼區(qū),,,②調(diào)控遺傳信息表達,上 游的RNA聚合酶結(jié)合位點:,基因結(jié)構(gòu),.,,,,,,,,,,,,,,編碼區(qū),與RNA聚合酶 結(jié)合位點,,,內(nèi)含子,外顯子,能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子,不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)含子,啟動子,終止子,編碼區(qū)上游,編碼區(qū)下游,內(nèi)含子：,外顯子：,真核細胞的基因結(jié)構(gòu),.,真核細胞的 基因結(jié)構(gòu),,編碼區(qū),非編碼區(qū),,外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列 內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列,：有調(diào)控作用的核苷酸序列， 包括位于編碼區(qū)上游的RNA 聚合酶結(jié)合位點等。,非編碼序列：,包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子,.,原核細胞與真核細胞的基因結(jié)構(gòu)比較,連續(xù),不連續(xù),編碼區(qū),非編碼,轉(zhuǎn)錄,翻譯,轉(zhuǎn)錄,翻譯,.,,1. 從基因文庫中獲取目的基因,1. 基因文庫的概念:,將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導入到受體菌的群體中，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因。,2. 基因文庫的種類:,基因組文庫：含有一種生物的全部基因,部分基因文庫：只包含了一種生物的部分基因， 如：cDNA文庫,,.,,基因組文庫與部分基因文庫的關(guān)系,.,基因組DNA文庫與cDNA文庫,,某生物體內(nèi)全部DNA,許多DNA片段,受體菌群體,與運載體連接導入,,基因組文庫,cDNA,受體菌群體,與運載體連接導入,,cDNA文庫,,某種生物某個時期的mRNA,.,基因文庫的構(gòu)建方法,① 基因組文庫的構(gòu)建,提取某種生物的全部DNA,用適當?shù)南拗泼该盖?一定大小的DNA片段,將DNA片段與載體連接,重組載體,,,基因組文庫,,導入受體菌中儲存,.,② cDNA文庫的構(gòu)建-----反轉(zhuǎn)錄法：,提取某種生物的某器官或特定發(fā)育時期的mRNA,單鏈DNA,雙鏈cDNA片段,重組載體,與載體連接,,,,,cDNA文庫,反（逆）轉(zhuǎn)錄酶,DNA聚合酶,,,,,,,,,,,,,,導入受體菌中儲存,.,思考？,真核生物的基因用反轉(zhuǎn)錄法得到的 cDNA與原基因相同嗎？,.,真核細胞的cDNA的獲取,,,編碼區(qū),非編碼區(qū),非編碼區(qū),,,,,,DNA聚合酶,剪接有關(guān)的酶,RNA聚合酶,mRNA前體,mRNA,單鏈DNA,cDNA,逆轉(zhuǎn)錄酶,轉(zhuǎn)錄,剪接,逆轉(zhuǎn)錄,復制,啟動子,終止子,基因,不含非編碼序列。即不含非編碼區(qū)和內(nèi)含子,,,,.,基因組DNA文庫與cDNA文庫的比較,小,大,無,有,無,有,某種生物的部分基因,某種生物的全部基因,可以,部分基因可以,.,如何從基因文庫中得到所需要的基因？,依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。,如：根據(jù)基因的核苷酸序列 基因的功能基因在染色體上的位置 基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA 基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì) 等特性。,.,1、構(gòu)建基因組DNA文庫時，首先應(yīng)分離細胞的 A、染色體DNA?? B、線粒體DNA C、總mRNA?? D、tRNA,2、目的基因可從基因文庫中獲得，下列有關(guān)基因文庫的描述正確的是 A、某生物的全套基因就是一個基因文庫 B、將含有某種生物不同的許多DNA片段，導入某個生物 體內(nèi)，則這個生物就是一個基因文庫 C、含有一種生物所有基因的基因文庫叫做基因組文庫 D、含有一種生物的一部分基因的基因文庫叫cDNA文庫,A,C,.,,2.利用PCR技術(shù)擴增目的基因,多聚酶鏈式反應(yīng),體外,特定DNA片段,.,PCR技術(shù)的操作過程,a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_____斷裂，形成_______,b、退火（復性55℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部________。,c、延伸（70℃-75℃）：在Taq聚合酶的作用下，合成與模板互補的________。,氫鍵,單鏈DNA,雙鏈,DNA鏈,d.重復a.b.c步驟：每重復一次，目的基因增加___倍,一,.,模板DNA,.,,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件 PCR過程 PCR的特點,,,引物1,引物2,.,,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件 PCR過程 PCR的特點,,,引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,.,,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件 PCR過程 PCR的特點,,,第1輪結(jié)束,第2輪開始,.,,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件 PCR過程 PCR的特點,,,,,,,,,,,,Taq,Taq,Taq,Taq,.,,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件 PCR過程 PCR的特點,,,,,,,,,,,,第2輪結(jié)束,.,PCR技術(shù)擴增與DNA復制的比較,堿基互補配對原則,堿基互補配對原則,四種脫氧核苷酸、模板、酶、ATP,四種脫氧核苷酸、模板、酶、引物,DNA在高溫下變性解旋,解旋酶催化解旋,半保留復制、邊解旋邊復制,半保留復制、全解旋再復制,體外復制,主要在細胞核內(nèi),大量的DNA片段,形成整個DNA分子,熱穩(wěn)定的DNA聚合酶,細胞內(nèi)的DNA聚合酶、解旋酶等,.,目的基因的mRNA,單鏈DNA (cDNA）,雙鏈DNA (即目的基因),反轉(zhuǎn)錄,合成,,,1）反轉(zhuǎn)錄法： 以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。,蛋白質(zhì)的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列,目的基因,推測,推測,化學合成,,,,2）根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法 ：,,3、人工合成的目的基因,.,,課堂練習,1、下列屬于獲取目的基因的方法的是( ) ①利用mRNA反轉(zhuǎn)錄形成 ②從基因組文庫中提取 ③從受體細胞中提取 ④利用PCR技術(shù) ⑤利用DNA轉(zhuǎn)錄 ⑥人工合成 A.①②③⑤ B.①②⑤⑥ C.①②③④ D.①②④⑥,D,.,,二、基因表達載體的構(gòu)建 ——基因工程的核心,.,表達載體,啟動子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì) 終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄 標記基因的作用是為了鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細胞篩選出來,,.,基因表達載體的構(gòu)建過程,,質(zhì)粒,DNA分子,,限制酶處理,,,兩個切口 獲得目的基因,DNA連接酶,重組DNA分子（重組質(zhì)粒）,,同一種,一個切口 兩個黏性末端,.,①載體與表達載體的區(qū)別：二者都有標記基因和復制原點兩部分DNA片段。表達載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動子、終止子三部分結(jié)構(gòu) ②用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學鍵都是磷酸二酯鍵 ③啟動子、終止子對于目的基因表達必不可少 ④目的基因不能單獨進入受體細胞，必需以表達載體的方式攜帶進去。,注意,.,,課堂練習,2、有關(guān)基因工程的敘述正確的是 （ ） A、限制酶只在獲得目的基因時才用 B、重組質(zhì)粒的形成在細胞內(nèi)完成 C、質(zhì)粒都可作為運載體 D、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合成目的基因提供資料,D,【拓展深化】　 工具酶只有兩種：限制酶在操作程序1、2中用到且要求用同一種，目的是產(chǎn)生相同的黏性末端；DNA連接酶只在操作程序2中用到。,.,,三、將目的基因?qū)胧荏w細胞,轉(zhuǎn)化：,方法,,將目的基因?qū)?植物細胞,將目的基因?qū)?動物細胞,將目的基因?qū)?微生物細胞,,農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,基因槍法,花粉管通道法,——顯微注射法,——感受態(tài)細胞,目的基因進入_________內(nèi)，并且在 受體細胞內(nèi)維持_____和_____的過程,受體細胞,穩(wěn)定,表達,.,,1、目的基因?qū)胫参锛毎姆椒?（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,①農(nóng)桿菌特點：易感染雙子葉植物和裸子植 物，對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力。,②原理：Ti質(zhì)粒上的T---DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細胞，并整合到受體細胞染色體的DNA上。,.,③轉(zhuǎn)化過程:,Ti質(zhì)粒 目的基因,構(gòu)建,表達載體,植物細胞,植物細胞染色DNA,新性狀,農(nóng)桿菌,.,,1、目的基因?qū)胫参锛毎姆椒?（2）基因槍法：目的基因?qū)雴巫尤~植物細胞,①操作方法：利用壓縮氣體產(chǎn)生的動力 ，將包裹在金屬粒表面的表達載體DNA打入受體細胞中，使目的基因與其整合并表達的方法。,② 鎢粉粒子和金粉粒子，粒子的直徑一般在0.6～4um 。,③適用：單子葉植物,.,,1、目的基因?qū)胫参锛毎姆椒?（3）花粉管通道法：將目的基因?qū)胫参锛毎?①操作方法：在植物花受粉后，花粉形成花粉管還末愈合前期，剪去柱頭，然后，滴入DNA（含的基因）使目的基因借助花粉管通道進入受體細胞,② 特點:十分簡便經(jīng)濟。,③例：轉(zhuǎn)基因抗蟲棉,.,,2、將目的基因?qū)雱游锛毎?①方法：顯微注射法,①程序：,目的基因表達載體提純 取卵（受精卵） 顯微注射 受精卵 新性狀動物,,,,思考：為什么要用受精卵而不用體細胞？,.,,3、將目的基因?qū)胛⑸锛毎?①微生物作受體細胞原因： 繁殖快、多為單細胞、遺傳物質(zhì)相對少 ②常用菌：大腸桿菌 ③常用方法：Ca2+處理獲得感受態(tài)細胞 ④過程：,,,,,,,,Ca2+處理 大腸桿菌,感受態(tài) 細胞,感受態(tài)細胞 吸收DNA,表達載體 與感受態(tài) 細胞混合,.,,小結(jié)：將目的基因?qū)胧荏w細胞,.,,四、目的基因的檢測與鑒定,1、導入過程完成后，全部受體細胞都能攝入重組DNA分子嗎？,真正能攝入重組DNA分子的受體細胞很少。,2、目的基因進入受體細胞后，是否都能穩(wěn)定維持和表達？,不一定，需要檢測,.,,1、鑒定——分子水平的鑒定,,,,,,,,轉(zhuǎn)基因生 物的DNA,探針,15N,15N,14N,14N,（1）檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了 目的基因,基因探針：,放射性同位素等標記的DNA分子,方法——,DNA分子雜交技術(shù),變性,變性,.,,1、鑒定——分子水平的鑒定,變性,,,,,,,,方法——,分子雜交技術(shù),（2）檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA,探針,15N,15N,轉(zhuǎn)基因生物 的mRNA,14N,14N,.,,1、鑒定——分子水平的鑒定,提取,（3）檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì),方法——抗原-抗體雜交,,Bt毒素蛋白,,,將Bt毒蛋白注射小鼠體內(nèi),從小鼠血管抽出血液分離出抗Bt毒素的抗體,,抗體,,,Bt毒素蛋白,,,,出現(xiàn)雜交帶,脫分化,,組織培養(yǎng),.,,2、鑒定——個體水平的鑒定,抗蟲、抗病接種實驗，活性比較實驗,例：用棉鈴飼喂棉鈴蟲，如蟲吃后不出現(xiàn)中毒癥狀，說明未攝入目的基因或攝入目的基因未表達。如蟲吃后中毒死亡，則說明攝入了抗蟲基因并得到表達。,.,思考？,不能，受體細胞必須表現(xiàn)出特定的性狀，才能說明目的基因完成了表達。,受體細胞攝入DNA分子后就說明目的基因完成了表達嗎？,.,,課堂練習,3、基因工程是在DNA分子水平上進行設(shè)計施工的。在基因操作的基本步驟中，不進行堿基互補配對的步驟是 （ ） A、人工合成目的基因 B、目的基因與運載體結(jié)合 C、將目的基因?qū)胧荏w細胞 D、目的基因的檢測和表達,C,【拓展深化】　只有第三步將目的基因?qū)胧荏w細胞不需堿基互補配對，其余三個步驟都涉及堿基互補配對,.,,課堂練習,即時應(yīng)用(隨學隨練，輕松奪冠) 4．(2009年高考浙江卷)下列關(guān)于基因工程的敘述，錯誤的是(　　) A．目的基因和受體細胞均可來自動、植物或微生物 B．限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶是兩類常用的工具酶 C．人胰島素原基因在大腸桿菌中表達的胰島素原無生物活性 D．載體上的抗性基因有利于篩選含重組DNA的細胞和促進目的基因的表達,D,.,練習5：(2008理綜山東卷)為擴大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備受關(guān)注。我國科學家應(yīng)用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。 （1）獲得耐鹽基因后，構(gòu)建重組DNA分子所用的限制性內(nèi)切酶作用于圖中的 處，DNA連接酶作用于 處。（填“a”或“b”）,a,a,.,練習1：(2008理綜山東卷)為擴大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備受關(guān)注。我國科學家應(yīng)用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。 （2）將重組DNA分子導入水稻受體細胞的常用方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和 法。 （3）由導入目的基因的水稻細胞培養(yǎng)成植株需要利用 技術(shù)，該技術(shù)的核心是 和 。 （4）為了確定耐鹽轉(zhuǎn)基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素標記的 作探針進行分子雜交檢測，又要用 方法從個體水平鑒定水稻植株的耐鹽性。,基因槍法（花粉管通道法）,植物組織培養(yǎng),脫分化和再分化,耐鹽基因,一定濃度鹽水澆灌,